（应用化学专业论文）碱性蛋白酶在洗涤中的应用研究.pdf

中国日用化学l 业研究院硕士毕业论文 摘要 论文研究了沈涤剂组分在多种情况下对碱性蛋白酶活性的影响。采用测定溶 液体系中碱性蛋白颗粒酶存放不同时间后的相对活性，进行了表面活性剂、助剂 与酶相互作用强弱分析。使用液体洗涤剂常用组分进行了液态酶洗涤过程的活力 影响实验，研究了液体洗涤荆组分对液态碱性蛋白酶活性的影响。通过考察洗涤 用碱性蛋白酶在洗涤过程条件下催化动力学参数，研究了表面活性剂对酶催化作 用的抑制类型。进行了不同温度环境中存储自行配制的液态加酶洗涤试样实验， 测定了酶活力随存放时问的变化，研究了加酶液体洗涤剂的存储稳定性问题。 研究结果表明：阴离子表面活性剂a e c 与碱性蛋白颗粒酶有较好的相容性， 与l a s 相比，4 5 分钟时的相对活性有较大的改观：所有测定的非离子表面活性 剂对碱性蛋白颗粒酶具有很好的相容性；两性表面活性剂与酶的相互作用介于非 离子与阴离子之间。洗涤助剂对酶的影响作用很小，尤以新型代磷助剂高稳 定层状二硅酸钠更为特出。液体洗涤剂组分对液体蛋白酶有不同种类的影响效 果，常用阴离子组分l a s 对液体蛋白酶的影响很大，但是可以通过与非离子表 面活性剂a e 0 9 复配，显著改善与酶的配伍性能，研究的液体蛋白酶几乎不受其 他的液体洗涤剂用表面活性剂、助剂的配伍影响。对于酶而言表面活性剂、助剂 中不存在灭活剂，部分为稳定剂、激活剂，其余为抑制剂，可以从表面活性剂对 酶的催化动力学参数影响情况初步判断其抑制剂类型有竞争性可逆抑制和非竞 争性可逆抑制。液体洗涤剂中蛋白酶的存储稳定性结果显示，2 5 存放环境中 a e c 、a e 0 9 、t x 一1 0 、6 5 0 1 、a e s 对液体蛋白酶的存储没有影响。配制的加酶 液体洗涤剂存储温度不应高于3 5 。 关键词：表面活性剂，洗涤剂，碱性蛋白酶，相对活性，催化动力学，抑制剂 温度范围，液体洗涤剂，液体酶，存储稳定性 中国日用化学工业研究院硕士毕业论文 a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t h ee f f e c t so f t h es u r f a c t a n t so na l k a l i n ep m t e a s ei nd e t e r g e n t s o o r i o nw e r ei n v e s t i g a t e db ym e a s u r i n gt h ea c t i v i t yo fe n z y m ei nt h es o l u t i o n o f s u r f a c t a n ta n db u i l d e r a tt h es b g n et i m e ，t h ea c t i v i t i e so fl i q u i ds t a t ee n z y m ei nt h e s o l u t i o ne o n f a c t i n gb yl i q u i ds t a t ed e t e r g e n tc o m p o n e n tw e r ed e t e r m i n e di tw a s a n a l y z e dt h a tm e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o no ft h ea l k a l i n ep r o t e a s ea n dt h es u r f a c t a n t r e s e a r c h i n gc a t a l y s ta b i l i t ya n dd y n a m i c sp a r a m e t e r so ft h ea l k a l i n ep r o t e a s ef a r w a s h i n g ，t h es t a m po f e n z y m ec a t a l y s i sr e a c t i o nw e r e d e f i n e dt h et - 3 j e so f i n h i b i t i o n o f t h es u r f a c t a n tw l ma l k a l i n ep r o t e a s e w e r ea n a l y z e ds t a b i l i t y o f l i q u i ds t a t ee n z y m e i nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r ec i r c u m s t a n c ew a si n v e s t i g a t e d r e s e a r c hr e s u l t se n u n c i a t i o n ：t h ea n i o ns u r f a c t a n t 一- a e ci sb e t t e rc o m p a t i b i l i t y w i t ht h ea l k a l i n ep r o t e a s e ，c o m p a r i n gw i t hl a s t h er e l a t i v e l ya c t i v i t yo f4 5m i n u t e s o fa l k a l i n ep r o t e a s ah a si n c r e a s e a l la c t i o ni nt h en o n i o n i cs u r f a c t a n t st h a tu s i l l 2l n t h ee x p e r i m e n ta r eg o o dc o m p a t i b i l i t yw i t ht h ea l k a l i n ep r o t e a s e ；t h ei n t e r a c t i o no f h e r m a p h r o d i t i cs u r p a c t a n tw i t ht h ea l k a l i n ep r o t e a s ei si n t e r v e n l e n tf o rt h en o n t 。h2 c s u r f a c t a n t sa n dt h ea n i o ns u r f a e t a m s ，t h ei n f l u e n c e so fw a s h i n gb u i l d e r t ot 1 1 e a l k a l i n ep r o t e a s ea r ev e r ys m a l l p a r t i c u l a r l yn e wn o n p h o s p h a t ed e t e r g e n tb u i l d e r c r y s t a l l i n el a y e r e ds o d i u md i - s i l i c a t er h s s t ) a r em o r eo u t s t a n d i n g f o rt h ea l k a l i n e p r o t e a s e ，t h e r ea r en o ta g e n t s o m ei ss t a b i l i t ya g e n t ，s o m ei sh i g ha c t i v i t ya g e n ta n d t i l eo t h e r sa r ei r d a i b i t o r w ec a uj u d g ei t si n h i b i t o r yt y p ef r m nt h ev i e wd y n a m i c s p a r a m e t e rp o s s i b i l i t yw i t h m ea d d i t i o no fp r e t e n s e e s p c c i n l y u s e di nl i q u i d d e t e r g e n t si n t o8d i f f e r e n t3 0 ( w ) a q u e o u ss u r f a c t a n bs o l u t i o n s ，t h ee f f e c t s 。f s u r f a c t a n t so nt h es t a b i l i t yo f p r o t e a s ed u r i n gs t o r a g eh a sb e e ns t u d i e d t h ee f f e c t so f s u r f a c t a n t sd e p e n do i li t sc h a r a c t e na e 0 9 ，6 5 0 1 ，a e cs h o w e dw e a ke f f e c t so nt h e a c t i v i t yo fl i q u i dp r e t e n s e ，w h e r e a sl a s ，a o s ，a p g 1 2 一1 4e x h i b i t e ds t r o n g e re f f e c t s t h ee f f e c t so ft x - 1 0 ，a e sl i eb e t w e e na b e v et w oc a t e g o r i e so fs u r f a c t a n t se v i d e n t e f f e c tw f o u n da st e m p e r a t u r ec h a n g e ( ，t h ee f f e c t so f s u r f a c t a n t so t ll i q u i dp r o t e a s e g r e a t l ys 廿e n g t h e n e do nt e m p e r a t u r e t h a ts t o r a g et e m p e r a t u r eo fl o w e rt h a n3 5o c i s n e e d e di f w et r yt oa d d p r o t e g ei nt h ep r e p a r a t i o no f d e t e r g e n t ， k e y w o r d ：s u r f a c t a n t ；d e t e r g e n t ；a l k a l i n ep r o t e a s e ；r e l a t i v e l ya c t i v i t y ；p a r a m e t e ro f k i n e t i c s ；i n h i b i t o r ；t e m p e r a t u r es c o p e 2 创新性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体己经发表或撰写过的科研成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集 体均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：鱼墼叠!日期：丝堕塾幽 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国日化院有关保留、使用学位论文的规定，同意f j 化院保留 或向国家有关部门或机构送交论文复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅：本 人授权中国日化院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本论文所 取得的研究成果属中国日化院，其他任何个人或集体未经中国日化院授权不得使 用。 论文作者签名：幽导师签名：叠受霾曼日期：兰幽 中国日用化学工业研究院硕士毕业论文 主要创新点 一、通过对新型表面活性剂、助剂溶液( 或悬浊液) 体系中洗涤用碱性蛋白 酶相对活性的研究，发现了阴离子表面活性剂a e c 以及新型代磷助剂一高稳定 层状二硅酸钠优异的性能，具有潜在的应用价值。 二、首次考察了洗涤用酶在表面活性剂存在情况下的催化动力学参数，采用 米氏方程积分式进行作图分析，初步判定了作用类型。 三、通过在液体洗涤剂中添加液态蛋白酶，研究其存放过程中酶活性的变化 舰律，为丌发加酶液体洗涤剂的开发提供基础研究数据。 中国日用化学j ：业研究院硕士毕业论文 1 1 概述 第一章文献综述 1 1 。1 加酶液体洗涤剂的发展现状 数十年来，由于科学技术的不断进步和石油化工的高速发展以及人们生活水平 提高带来的对沈涤用品的迫切需要，世界合成洗涤剂生产得以迅猛发展。上世纪七 十年代至八十年代期间增长最快，九十年代以来发达国家市场增势趋于平稳但发 展中国家如亚太和拉美地区的发展仍处于高速增长。我国合成洗涤剂的增长速度是 世界合成洗涤剂的增长速度的2 倍以上，2 0 0 0 年我国合成洗涤剂产量已跃居世界第 二位，达到3 2 2 万吨忆其中液体洗涤剂产量达到8 0 万吨，预计仍将以每年8 高 速率继续增长。“十五”规划中预测，到2 0 0 5 年液体洗涤剂产量将达到1 1 0 万吨 2 】。 在粉状洗涤剂推新换代的同时，液体洗涤剂凭借自身性能优势得以迅猛发展， 有关资料表明【3 1 ，目前在国外的数万种洗涤用品中，液体洗涤剂品种占到了8 0 以 上：我国现有的液体洗涤剂品种也有数百种之多。从世界合成洗涤剂的发展和中国 目6 口生产水平来看，液体洗涤剂将会迅速发展成为人们生活中不可缺少的必需品， 其市场前景极为广阔。 加酶液体洗涤剂的出现是液体洗涤剂的重大技术革新，既解决了环保问题中磷 酸盐富营养的问题，又使洗涤温度大大降低，有效节约能源。全世界加酶液洗得至4 大力发展，到上世纪八十年代末，美国加酶液洗占6 0 i “，酶在洗涤剂中的消费从 19 9 0 年起平均以1 6 的速度增长。目前我国的加酶洗涤剂所占比重还比较小，随着 国产酶技术的逐步成熟，产量和所占比重会迅速增加。 无论粉状洗涤剂还是液体洗涤剂酶制剂已经逐步成为洗涤剂必须的组分，而 酶的稳定性问题是加酶洗涤剂发展的技术关键。加酶粉状洗涤剂由于使用酶包裹造 粒技术，已经完美地解决了存储稳定性问题。许多科学研究者针对液体洗涤剂加酶 的稳定性、以及粉状洗涤剂中酶的作用，已经进行了大量的研究工作，但是结果并 不十分令人满意。 中国日用化学工业研究院硕士毕业论文 1 ，1 2 洗涤剂用酶的发展史 洗涤剂用酶的研究始于二十世纪初，1 9 1 3 年德国人r o h m 和h a a s 将动物内脏 提取的胰蛋白酶用于洗衣剂研究，指出胰蛋白酶具有分解蛋白质污垢的能力，提出 了可能在较短的时间里用比沸点低得多的温度下将衣物织物洗净胪1 。由此，世界上 第一种加酶洗涤剂“b u r n u s ”诞生了，主要成分是碳酸钠和胰腺粗提物。 当时，由于酶的作用效果不能让人满意，人们没有对它给予足够的重视，在几 十年时间里加酶洗涤剂都没有很好的发展。 到1 9 5 6 年第一种使用细菌蛋白酶的洗涤剂出现了，商品名是“b i o 一4 0 ”；1 9 6 0 年月麦n o v oi n d u s t r ya s 公司开发成功一种由地衣芽孢杆菌( b 1 i c h e n i f o r m s ) 发酵生 产的碱性蛋白酶a l c a k a s e ，该酶在p h 8 1 0 显示高稳定性和活性，加入该酶的洗涤 剂的商品名为b i o t e x 们。同一时期，荷兰皇家发酵公司开发成功洗涤剂用碱性蛋白 酶m a x a l a s e 。这些酶的开发都是针对酶的碱适应能力，有一定的适应能力。 六十年代术到七十年代初，由于对洗涤剂用酶的人体皮肤过敏性等安全问题的 影响，导致酶在合成洗涤剂工业中的使用量急剧下降。但随着科学实验的深入丌展 和生物技术的发展证明洗涤剂酶对人体无害，同时也解决了酶的安全运作问题，洗 涤剂用酶重新焕发出生机，恢复上升趋势。 七十年代术到八十年代初丹麦n o v o 公司开发成功第二代碱性蛋白酶e s p e r a s e 和s a v i n a s e i ”，与第一代酶相比，这些酶具有活力高、p h 适应范围广、稳定性好的 优点【引。 1 9 9 1 年更加稳定的低温碱性蛋白酶m a x a p e m 9 】和耐漂白的碱性蛋白酶 d u r a z y m l l 0 1 研制成功，标志着洗涤剂用酶开始向着适应多功能化的洗涤方向发展。 1 9 9 9 年诺和诺德( 中国) 生物技术有限公司研究开发了微胶囊型的液体碱性蛋 白酶s a v i n a s el c c i “l ，适用于液体洗涤剂中酶的复合使用，研究表明该酶在液洗中 稳定性好、与其他酶及洗涤剂配伍性良好。 我国自五十年代开始选育产碱性蛋白酶菌株，六十年代末上海洗涤剂厂等选育 出地衣芽孢杆菌2 7 0 9 ；七十年代，中国科学院林业土壤研究所等选育出短小芽孢杆 菌2 8 9 和2 0 9 ，以及地衣芽孢杆菌1 2 1 3 ，嗜碱性短小芽孢杆菌b 4 5 等 ”1 。这些菌株 的培育，使得我国对碱性蛋白酶有了深入的了解和广泛的应用。 近几年来，我国科学工作者研究了耐高温、低温、高耐碱性等高产菌株，用于 2 主里旦里垡堂三、业塑塞堕堡主望些笙塞 工业化生产。尤其是在低温酶方面有较大突破，中国水产科学研究院黄海水产研究 所海洋酶与酶工程丌放实验室研究开发了产低温碱性蛋白酶的菌株y s 一9 4 1 2 1 3 0 ， 陔低温碱性蛋白酶最适反应温度为3 5 。c 【13 1 , 较其它酶低1 5 2 0 。c ，并且该酶在含 氧化剂的体系中稳定。 i 2 酶在洗涤应用中的研究进展 1 2 1 酶在洗涤中稳定性的研究 酶在洗涤剂中的稳定性问题可以分为：在粉状洗涤剂中储存稳定性、在液体洗 涤剂中储存稳定性、在洗涤过程中的稳定性三部分。 酶加入粉状洗涤剂中的储存稳定性问题已经得到很好的解决1 。1 ”，其方法主要 是将酶粉或酶颗粒包覆起来，不仅使之不直接与洗涤剂组分接触，而且连自身酶与 酶互相之间都不接触，从而避免失活。 酶加入到液体洗涤剂中，由于直接接触到液体洗涤剂中的水分、表面活性剂、 助剂等，使酶很快失活而失效。因此人们在研究洗涤剂助分对酶活性影响作用的基 础上，寻找保存酶活力的方法。 i n a m o r a t o f 硒】等研究表明，用甘油5 、硼砂3 作稳定剂可以使组成为c m l 4 a e o 5 5 ，椰油酰胺基甜菜碱2 1 ，柠檬酸纳1 3 ，酶1 ，其余为水的体系中，4 3 储存6 天保持9 5 的酶活性，而不加酶稳定剂时只能保持2 6 的活性。 水分的大量存在能够使酶迅速失活，邱学青i ”1 研究了不同水分含量的对碱性蛋 白酶活性的影响，结果表明，这种影响作用很大，当水分含量为9 9 时，样品储存 1 2 天后，酶几乎全部失活。随着水分含量的减少，酶的稳定性逐渐增大。 邱学青旧等还对酶稳定剂进行研究，结果表明单一组分的酶稳定剂能不同程度 地提高酶的储存稳定性，但只有添加多组分的稳定剂，才能很好的保存酶的储存稳 定性。同时还研究了工业上快速筛选酶稳定剂的方法。 k r a v e t z i s l 等人研究表明，浓度为3 0 的阴离子表面活性剂c 1 2 l a s 、c 1 4 州a o s 等在3 7 。c 下1 4 天内会使碱性蛋白酶全部失活，而非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙 烯醚等在相同条件下使碱性蛋白酶保持7 5 的活性。 美国m o n s a n t o 1 明公司研究表明，洗涤剂组分硅酸钠、碳酸钠、二甲基二苄基氯 化铵使碱性蛋白酶失活很快。 宝鱼旦旦垡堂三些堑壅堕塑圭堡些迨塞 1 w a d a r e 2 0 1 等报道了用甘油6 0 、丙二醇5 、硼酸0 0 5 、p v p 0 2 5 的酶稳定 剂可以是蛋自酶在含水3 0 的体系中4 0 c 存放4 周，保持7 5 的活性。 月麦诺维信公司f 2 13 提出，用甜菜碱和二甲基羟乙基胺系两性表面活性剂改进含 3 3 5 表面活性剂的液洗产品中蛋白酶和淀粉酶的储存稳定性。美国宝洁公司提 出，在液洗产品中加入n 一椰油酰基- n 甲基葡糖胺可以改进蛋白酶和淀粉酶、脂肪 酶、纤维素酶和或过氧化氢酶等的性能。 l i s sr 2 2 1 等研究了直链十二烷基苯磺酸盐和c ”1 5 脂肪醇聚氧乙烯醚对碱性蛋白 酶活性的影响。结果表明，碱性蛋白酶在非离子表面活性剂配方中活力较为稳定。 彭先群2 3 等研究了国产酶与洗涤剂组分的配伍性能。得出了配制指导方案：采 用阴离子与非离子s a a 复配，加适量助剂和酶保护、稳定剂，控制水量及p h 值， 可以得到外观均匀、色白、性能稳定的加酶膏状洗涤齐，其年存活率达到6 7 8 1 。 无锡江南大学董荣 2 4 1 等研究了液体洗涤剂中常用的表面活性剂如l a s 、s a s 、 a e s 、a o s 、m e s 、烷基醇酰胺、a p g 、o b 2 以及常用助剂如增溶剂、增稠剂、防 腐剂等对青霉脂肪酶活性的影响，还研究了阳离子表面活性剂以及淀粉酶对青霉脂 肪酶活性的影响。结果表明，a e s 、m e s 、a o s 对酶活的影响比l a s 小，且a e s 与l a s 复配有利于减低l a s 对酶活的影响；烷基醇酰胺和a e 0 9 、t x 1 0 一样，对 酶活的影响较小：a p g 和o b 2 则有较大影响；阳离子表面活性剂在较低的浓度下对 酶无影响，有的甚至还有激活作用。液体洗涤剂中的增溶剂、增稠剂、防腐剂等在 配方浓度范围内对酶活影响不大；淀粉酶对青霉脂肪酶的活性几乎没有影响。 在沈涤过程中酶活力的保持问题，就是直接反映真正洗涤时起作用的酶。从中 可以看出添加酶在洗涤过程直到洗涤结束，有多少酶在发挥作用。 张宝莲【2 5 1 模拟洗涤条件研究了洗涤过程中表面活性剂、洗涤助剂对碱性蛋白酶 酶活性的影响。实验结果显示4 5 r a i n 内，酶活性保持在8 5 以上，具有洗涤去污能 力。 1 2 2 酶的催化反应动力学研究 酶催化的基本动力学关系，是指酶催化反应速度与酶和底物间的动力学。因为 酶和底物是构成酶反应系统最基本的因素，它们决定反应的基本性质、酶反应的速 度规律，而其它各种因素也正是通过它们产生影响的；而且，这种动力学关系是整 个酶反应动力学的基础。描述这种基本动力学关系的是米氏方程f 2 q 4 ： 空重旦旦丝堂兰些堕至塑堡主望些丝塞一 ( m i c h a e l i s m e n t e ne q u a t i o n ) 。反应式可以表示成如下形式： e + s ；= 净e s e + p t t 其中，e 、s 和e s 分别表示酶、底物和酶一底物活性络合物。该反应式适合酶在液 相中对底物的催化反应动力学研究。 酶与底物形成活性络合物的过程是可逆反应，速度很快，酶、底物和酶一底物 活性络合物之间达到平衡态；而e s 分解为酶和产物，近似于不可逆反应，速度较 馒，是酶催化反应速率决定步骤。因此，催化反应速率方程式为： v 0 - - - - - k c a t e s 】 v o 为仞速度。 用静念c ：去( s t e a d y s t a t e ) 处理( 由于 s ) ，( e 】，认为 e s 】不随时间变化) ，可得 粤= k l e 】【s - k _ 1 e s h e s = 。 l - 3 k 。 e s = ( k 一4 - k 。) e s 】 l 4 r 引：坠些韭型l 一5 由于【e 。 _ 【e + 【e s 式( 1 2 ) ( 1 - 6 ) 得： 将1 5 代入1 8 得 玉一：堡塑s 【兰墅 e 。】 e + e s v o 一篱酱 。： 世堡。监墅 ：坠鱼趔：坠邑魁1 _ 9 。垡! 上二j 韭! f ! 蛰+ e s 】兰= i 兰趔+ s k 。+ 【s 1 7 k s 1 。 k 。 。 其中k m 为垦生坠 k 底物浓度远高于浓度时， s 】 s o l ，同时可得v 。= k 。 e 。1 ，因此 中国日用化学工业研究院硕士毕业论文 ”端 。 当酶浓度一定盼清况下，【s 很小，k m + s k 。，则v = ! 素# ，v 对 s 为级 反应。当( s 足够大时，k 。+ s 】c s ，则v = v 丌扭。v 对 s 变成零级反应。 1 2 3 溶液体系环境对酶的影响 溶液体系环境包括很多内容：有溶液组成、p h 值、温度、黏度、化学成分等。 全部对酶稳定性产生影响，在以往的研究中，科研工作者重点对温度、p h 值、化 学成分等进行研究。 化学成分( 研究对象主要为表面活性剂) 对酶稳定性能的影响作用已在1 2 1 中作详细介绍。这里主要介绍在溶液的p h 值和温度对酶活性稳定性的影响作用方 面研究人员所作的工作。 林朝晖i 2 1 按原轻工业部部颁标准合成洗衣粉的p h 值为6 ，5 1 0 5 进行实验。结 果表明，在此p h 值范围内，蛋白酶的活力较强，因此，一般不需要另外考虑p h 值对加酶洗涤剂效果的影响。同时认为，在一定条件下，每一种酶都有固定的最适 p h 值，在最适p h 值时，酶的催化效力可达到最高。 王海亭【1 3 等研究了黄海黄杆菌y s ，9 4 1 2 1 3 0 低温碱性蛋白酶包覆型酶制剂的去 污性能，结果表明，该酶在高温区( 大于3 0 ) 的去污能力与s a v i n a s e 、p r o r e a s e 、 0 x 国产酶、2 7 0 9 碱性蛋白酶接近，在低温区( 小于2 0 ) 明显好于其他酶。 蒋惠亮【2 8j 等研究了适用于粉状洗涤剂的表面活性剂及助剂受温度的影响情况， 结果表明，温度对表面活性剂临界胶柬浓度无明显影响，对表面活性剂及洗涤剂的 表面张力、润湿力及螯合剂的螯合能力有一定的影响。并认为酶的加入有效地提高 了洗涤剂在低温下的去污力。 坂口博修2 9 1 研究了水溶液的p h 、温度等对脂肪酶稳定性的影响。结果表明， 溶液中的温度大于5 5 c ，p h 大于1 0 均不利于脂肪酶的活性保持。 闰长伟【3 0 1 等研究了液体洗涤剂中复合酶稳定性，由碱性蛋白酶、淀粉酶通过微 胶囊复配而成的复合酶在不同温度和p h 下的特性，以及含水量、保护剂和表面活 性剂对酶活力稳定性的影响。结果表明，该复合酶的最适反应温度为5 0 ，最适 p h 为9 , 0 ，在温度2 0 5 0 。c ，p h 6 1 0 ，水的体积分数小于4 0 及各表面活性剂的 6 中国日用化学工业研究院硕士毕业论文 洗涤浓度范围内均有良好的稳定性。 由于溶液体系的黏度对蛋白质的运动影响，导致蛋白质的构象变化缓慢，而作 为蛋白质重要组成部分酶，因为构象变化减慢会造成酶的催化能力下降。研究 液体洗涤剂加酶时，除其他影响酶活力的因素外，溶液体系的黏度也应当作为考察 的一个重要对象。 1 2 4 酶在洗涤应用中有待于解决的问题 近年柬，酶在洗涤中的应用发展很快。为了与这一应用发展相适应，迫切需要 对酶在洗涤中的应用性能进行深入的研究，才能更好地发挥酶在洗涤中的作用。近 几年，我国在洗涤剂用酶的应用方面，发展迅速，但对酶在洗涤中的稳定性研究还 比较少。为此，必须尽快开展这方面的研究工作。酶在洗涤应用中仍有待于解决的 问题归纳如下： ( 1 ) 酶在洗涤过程中的稳定性问题。以往人们所做的研究只是通过考察洗涤 剂中表面活性剂的组分或浓度对酶活性的影响，来寻找适合的洗涤剂配方。而从表 面活性剂对酶作用时间来考察酶活性的影响作用，同样具有现实的意义，能够直观 地显现出洗涤过程中酶能够起作用的情况。 ( 2 ) 表面活性剂对酶的作用理论。表面活性剂对酶的作用研究已有很多，但 大多数部是停留在现象分析，或从一些性能分析得出的推断结论。很少有从催化动 力学分析出发，测定参数而给出可能的机理解释。 ( 3 ) 液体洗涤剂中添加酶的存储稳定性问题，近年来已经成为了研究的焦点。 提出了一些设想和解决方法，但是仍旧没有形成成熟的理论和满意的产品。 1 3 本论文的研究背景及研究内容 我国的洗涤操作一般都在室温下进行，室温洗涤时往往难以较好地发挥洗涤剂 的去污能力。添加酶制齐是提高去污力的好方法。针对酶在洗涤过程中有待于解决 的问题和我国加酶洗涤剂迅速发展的现状。本论文开展如下的研究工作： ( 1 ) 洗涤过程中酶稳定性的影响研究 针对洗涤用量最多，用途最广且已经工业化的碱性蛋白酶，研究了新型表面活 性剂、助剂对酶活性的影响，并将我国自行研制的新型酶制剂与国外厂家生产的酶 中国日用化学工业研究院硕士毕业论文 带0 齐0 进行了比较。 ( 2 ) 从动力学方面探讨表面活性剂对酶的作用方式 生物酶学研究的动力学已经很深入了，但是在表面活性剂、酶与污垢相互作用 领域，催化动力学研究应用的很少。采用测定计算存在和不存在表面活性剂时酶催 化动力学参数，并进行比较讨论，得出一些作用机理的解释。 ( 3 ) 液体洗涤环境对酶稳定性的影响研究 通过对液体洗涤剂用酶的测试，考察液体洗涤剂专用酶的实际使嗣效果，以及 从液体加酶洗涤剂配制后稳定性着手，考察研究加酶液体洗涤荆的应用性能。 国旦旦垡兰工些丛壅堕堡望、业迨塞一一 参考文献 1 2 】 嘲3 4 】 5 】 6 1 7 8 9 1 0 】 【1 1 1 2 1 3 】 1 4 1 5 1 6 1 7 】 18 1 9 1 2 0 】 2 i 】 2 2 】 2 3 同用化学品科学2 0 0 2 ，2 5 ( 4 ) ：4 5 r 用化学品科学2 0 0 2 ，2 5 ( 3 ) ：4 6 刘国信进了液体洗涤的年代 n 中国化工报日化( 生活周刊) ，2 0 0 0 ，3 ( 6 ) s o a pc o a m c h e ms p e e ，1 9 8 9 ，( 1 2 ) ：6 4 j e n s e ng j a o c s ，1 9 9 0 ，( 3 ) ：1 6 8 1 7 0 王海丰芽孢杆菌蛋白酶产生条件、部分酶学性质及其基因的克隆研究成部 硕士学位论文 s t a r a c ec a ，j a o c s ，1 9 8 1 ，5 8 犯) ：1 6 5 1 7 0 。 m i c h a e k c ，c r o s s i n s o a pc o s t ac h e ms p e c ，19 8 7 ，( 8 ) ：5 2 j a nh v a ne e 1 9 9 2 年西班牙表面活性剂会议论文集1 9 9 2 ，6 7 8 2 n o v o n o r d i s k s o a pc o s t ac h e ms p e c ，19 9 1 ，6 7 ( 8 ) ：4 0 王岩微胶囊型的液体碱性蛋白酶s a v i n a s el c c 在重垢液体洗涤剂中的应用 日用化学品科学，2 0 0 0 ，2 3 ( 1 ) ：4 2 - 4 4 薛林贵，等我国碱性蛋白酶的应用及研究进展，微生物学通报，1 9 9 7 ，2 4 ( 6 ) ： 3 7 0 3 7 1 王海亭等黄海黄杆菌y s - 9 4 1 2 1 3 0 低温碱性蛋自酶的应用研究i i 海洋水 产研究，2 0 0 2 ，2 3 ( 3 ) ：3 0 3 6 陆宗侠日用化学工业，1 9 8 4 ，( 4 ) ：1 9 2 3 黄建国日用化学工业，1 9 9 1 ，( 6 ) ：1 4 u s p 4 6 7 0 1 7 9 邱学青液体洗涤剂用酶的稳定性及其去污性能的研究华南理工大学博士 学位论文，1 9 9 5 k r a v e t zle ta 1 j a o c s ，1 9 8 5 ，6 2 ( 5 ) ：9 4 3 9 4 9 c t t e m w e e k ，1 9 6 9 ，1 0 4 ( 2 2 ) ：6 8 j p9 2 3 7 0 1 9 7 王燕国外液体洗涤荆最新进展日用化学工业，1 9 9 4 ，( 6 ) ：2 1 2 6 l i s sr l & l a n g g u t h r p j a o c s 1 9 6 9 ，( 4 6 ) ：5 0 7 彭先群，程恭仁，王两珠等洗涤剂组分与国产酶配伍性能研莉j 】目用化学 9 生堕旦旦丝堂三些堑塑堕堡主望些堡塞 一 一 一 工业。1 9 9 6 ，4 ：7 - 1 0 【2 4 】董荣，李江华，陈银生液体洗涤剂组分对青霉脂肪酶活性的影响 j ，日用化 学品科学，2 0 0 0 ( 2 3 ) 增刊， 2 5 张宝莲碱性蛋白酶在洗涤剂各组份溶液中的稳定性研究第七届国际表面 活性剂和洗涤剂会论文集 c ，2 0 0 2 ：6 7 6 9 2 6 袁勤生现代酶学 m 上海：华东理工大学出版社，2 0 0 1 ：2 0 f 2 7 1 林朝咩加酶洗涤剂中酶对洗涤剂洗涤效果的影响湖南轻工业高等专科学 校学报【j ，2 0 0 3 ，( 1 5 ) ：1 7 一1 9 2 8 】蒋惠亮，等洗涤剂及其主要组分效能与温度之关系的研究 j 】2 0 0 2 ，3 1 ( 4 ) ： 6 1 6 4 2 9 坂口博修油脂，1 9 8 9 ，( 8 ) ：5 9 6 3 f 3 0 闰长伟，陈宜顶，王联结，液体洗涤剂中复合酶稳定性的研究陕西科技大学 学报，2 0 0 3 ，2 1 f 2 ) ：1 9 2 2 中国日用化学工业研究院硕士毕业论文 2 1 实验原料和试剂 第二章实验技术和方法 实验中用到的原料和化学试剂具体如下： ( 1 ) 碱性蛋白酶五种：青岛黄海水产研究所黄海黄杆菌y s 9 4 1 2 1 3 0 碱性蛋 白酶( 国家“8 6 3 ”项目成果) ，活力为9 5 万g i g ；诺维信s a v i n a s e 4 ，0 t 碱性蛋白酶， 活力为9 7 ) i l a g ：杰能科p r o p e r a s e 4 5 0 e 碱性蛋白酶，活力为1 08 万p - g 。诺维信 s a v i n a s e l 6 o l 液体碱性蛋白酶，活力为1 0 1 万g g ( 2 ) 表面活性剂十种：脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠( a e c ) ；脂肪酸甲脂乙氧 基化物( m e e ) ；。一烯基磺酸钠( a o s ) ；甜菜碱；十二烷基苯磺酸钠( l a s ) ： 脂肪醇聚氧乙烯( 9 ) 醚( a e 0 9 ) ；烷基多糖苷( a p g l 2 州) ：脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠 ( a e s ) ：壬基酚聚氧乙烯醚( t x 1 0 ) ：椰子油二乙醇酰股( 6 5 叭) ；吐温8 0 。均为上业 级。 ( 3 ) 洗涤助剂七种：高稳定层状- - 酸钠( h s s t 1 ) ；生化植物助洗剂；亚微 米4 a 沸石；4 a 沸石；氯化钠；尿素；苯甲酸钠。 ( 4 ) 碱性蛋白酶分析用原料和化学试剂：钨酸钠、钼酸钠、磷酸、浓盐酸、 硫酸锂、浓溴水、无水碳酸钠、三氯乙酸、四硼酸钠( 硼砂) 、干酪素、酪氨酸、 氢氧化钠，均符合q b f t1 8 0 3 9 3 所规定的要求。 ( 5 ) 缓冲液、水质调节用原料和试剂：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、 盐酸、甘油、柠檬酸钠，均为分析纯。 2 2 实验主要仪器和设备 ( 1 ) u v - 1 6 0 0 紫外可见分光光度计，北京瑞利仪器分析有限公司( i c m 玻璃池 和石英池) ； ( 2 ) 5 0 1 超级恒温水浴( o 1 ) ，上海市上海县第- - 2 a 金厂： ( 3 ) p h s 一2 酸度计，上海第二分析仪器厂； ( 4 ) 7 9 1 型磁力加热搅拌器，姜堰市医疗器械有限公司： ( 5 ) e s j l 2 0 光学读数分析天平，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司。 1 i 中国日用化学工业研究院硕士毕业论文 ( 6 ) b p 2 1 i d 型电子天平，北京赛多利斯天平有限公司。 ( 7 ) w d y 型1 0 0 0 微升微量移液器，上海求精生化试剂仪器有限公司； ( 8 ) r s 7 5 流变仪，德国公司啥克公司； ( 9 ) 万用调节炉( 1 0 0 0 w ) ，北京市光明医疗仪器厂； ( 1 0 ) m j x 一2 5 0 一i i b 微电脑控制霉菌培养箱，广州省医疗器械厂( 调节恒定温度 2 5 、3 5 和4 5 ) 。 2 ，3 碱性蛋白酶活力定义 碱性蛋白酶活力定义： l g 固体酶粉( 或l m l 液体酶) ，在一定温度和p h 值条件下，1 m i n 水解酪素产 生1 掣g 酪氨酸为一个活力单位，以u g ( u m 1 ) 3 茛示。 相对酶活力定义： 酶的弃。对活性=兰至!；：i!；i；i；：；辫，。 2 4 实验方法 2 4 1 酶活力测定方法 24 1 1 原理 蛋白酶在一定的温度与p h 值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸 ( 如：酪氨酸、色氨酸等) ，在碱性条件下，将福林试剂( f o l i n ) 还原，生成钼蓝 和钨蓝，用分光光度计测定，计算其酶活力。 241 2 福林试剂的制备 于2 0 0 0 m l 磨口回流装置中加入钨酸钠( n a 2 w 0 4 2 h 2 0 ) 1 0 0 9 、铝酸钠 ( n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 ) 2 5 g 、水7 0 0 m l 、8 5 磷酸5 0 m l 、浓盐酸1 0 0 m l ，小火沸腾回 流1 0 】1 ，取下回流冷凝器，再通风橱中加入硫酸锂( l i 2 s 0 4 ) 5 0 9 、水5 0 m l 和数滴 浓溴水( 9 9 ) ，再微沸1 5 r a i n ，以除去多余的溴( 冷后仍有绿色需再加溴水，再煮 2 生里旦旦丝堂三些堑塞堕塑主兰些鲨塞 沸除去过量的溴) ，冷却，加水定容至1 0 0 0 m l 。混匀，过滤。制得的试剂呈金黄色， 储存于棕色瓶内。 2 4 1 3 硼酸缓冲溶液配制 该缓冲溶液p h = 1 0 5 ，适用于碱性蛋白酶。 甲液称取硼酸钠( 硼砂) 1 9 0 8 9 ，加水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 乙液称取氢氧化钠4 o g ，加水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 使用溶液取甲液5 0 0 m l 、乙液4 0 0 m l 混匀，用水稀释至1 0 0 0 m l 。用p h 计校 正，如有偏差，添加甲液或乙液调整溶液p h 至i o 5 。 2 4 13 磷酸二氨钾缓冲溶液配制 该缓冲溶液p h = 8 。0 ，适用于液体碱性蛋白酶s a v i r m s e l 6 0 l 。 甲液称取磷酸二氢钾，加水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 乙液称取氢氧化钠，加水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 使用溶液取m i 混匀用水稀释至1 0 0 0 m l 。用p h 校正，如有偏差，添加甲 液或乙液调整p h 至8 0 。 2 4 2 测定波长的选择 图2 1 碱性蛋白酶水解酪索( 即酪蛋白) 所得产物的全波长扫描图 l 一。一 一 一a l 墨； 。 l 蛊i 图2 1 酪索经蛋白酶水解产物的紫外扫描图 图2 2 是在波长5 8 5 n m 到9 5 5 n m ，吸光度在0 2 8 0 到o 4 1 4 范围内的局部放大图 中国日用化学工业研究院硕士毕业论文 嚣 、 ：r 聃5 帅 站l ： 日i io “b 图2 2 酪素经蛋白酶水解产物5 8 5 n m 9 5 5 n m 的扫描图 从图2 2 可以看出。6 8 0 n m 处有很明显的吸收峰。 同样从仪器给出的数据分析可以看出，在6 8 0 n t o 波长处，存在个波峰，证明 该样品在6 8 0 n t o 波长处有较强的吸收。 2 4 _ 3 吸光常数的测定 在6 8 0 h m 波长下测定不同浓度的酪氨酸对应的吸光度，求出吸光度为1 时的对 应酪氨酸浓度。 酪氨酸标准溶液的配制 诺维信 青岛黄海酶。 液体蛋白酶的最适温度见图3 4 。 1 0 0 8 0 彗6 0 孥4 0 2 0 0 01 02 03 04 05 06 07 0 温度 图3 4 洗涤温度对液体洗涤剂用酶活性的影响 有图中可以看出，液体蛋白酶的最适温度为4 5 。 温度对酶反应速度有很大的影响，在一定条件下，将酶活力最大时的温度称为 最适温度。酶的最适温度不是酶的特征物理常数，其数值受底物的种类、作用时间、 介质的p h 值、离子强度等因素的影响而改变，但在一定条件下酶的最适温度可以 生里旦旦垡堂三些婴塞噻堡主望些迨皇 反映酶的热稳定性。 3 3 3 温度对酶影响的实测数据 表3 1 温度对液体酶活性的影响 温度( )样品号透光率吸光度吸光度平均值相对吸光度 l7 4 7 70 1 2 6 2 3 027 3 5 10 1 3 3 60 1 2 8 51 6 8 8 37 4 8 40 1 2 5 8 l5 3 9 20 ，2 6 8 l 4 025 2 5 20 2 7 9 60 2 6 7 83 5 1 9 35 5 5 1 0 2 5 5 6 l2 3 8 7 0 6 2 2 1 5 022 4 6 8 0 6 0 7 50 ，6 4 0 08 4 1 0 32 3 8 2 0 6 2 2 8 11 7 8 80 7