（环境工程专业论文）治理城镇黑臭河道的复合菌剂开发及应用研究.pdf

t h e s i ss u b m i t t e dt oz h e j i a n gu n i v e r s i t yo f1 e c h n o l o g yf o r t h ed e 野e eo fm a s t e ro f e n g i n e e r i n g p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no f t h ec o m p l e xm i c r o b i a la g e n t s c l e a n i n gt h eu r b a nb l a c k o d o rr i v e r 附疗把门砂 z h a n gl i s u n e n v l r o n m e n t a le n g l n e e n n g 1 一 1 r s t l p e r v i s e db v6 甜矽p ，+ v z s p 口d 1 ， w a n gj i a d e c o u e g eo fbi o l o g i c a l & e n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g ，z h e ji a n g u n i v e r s 时o ft e c h n o l o g y ，3 10 0 3 2 ，p r c h i n a a p r i l2 0 lo 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江 工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的 法律责任。 作者签名： 魄吁年p 彩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密彤 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 日期降鲰形日 日期缈岁日 浙江工业大学硕士研究生学位论文 治理城镇黑臭河道的复合菌剂的开发及应用研究 摘要 城镇黑臭河道由于含有大量脂肪、淀粉、蛋白质、纤维素、几丁 质等有机污染物，导致河道水体严重富营养化、恶臭。因此，城镇黑 臭河道治理的首要问题，是解决大量有机物造成的河水严重富营养化 及黑臭问题。 本研究从土壤样品中分离、筛选出了能分解城镇河道水体中上述 主要有机污染物的各菌种( 假单胞菌，芽胞杆菌、乳酸菌，嗜麦芽窄 食单胞菌，红球菌，苏云金杆菌) 。对这些菌种和能固定并利用水中养 分微生物分解产生氮磷的酵母菌，分别进行了降解城镇黑臭河道河水 的实验室试验研究。试验结果表明，这些菌种能有效去除城市河流中 的c o d ，加菌第1 天、第3 天、第5 天和第1 0 天后，水样c o d 平均 去除率分别达到2 1 9 ，4 7 9 ，5 8 8 和6 2 7 。 以上述菌种为主要成份，研制了5 种不同成份的复合菌剂，并在 一实际黑臭河道中进行了应用测试。应用结果表明，添加复合菌剂1 5 天后c o d 去除率达3 8 5 8 ，其中以芽胞杆菌与酵母菌复合的复合菌 剂4 和复合菌5 剂效果较好。复合菌剂1 、复合菌剂2 、复合菌剂3 对总氮、氨氮、硝态氮和活性磷酸盐作用不明显，但复合菌剂4 和复 合菌剂5 ，可显著降低总氮、氨氮、硝态氮和活性磷酸盐浓度。此外， 治理后，河道黑臭消除，水色接近于正常水体，透明度也显著提高， 浙江工业大学硕：1 j 研究生学位论文 水体出现了大量的浮游动物，自净能力有所增强。 关键词：城镇黑臭河道，有机污染物，复合菌剂 i i 浙江工业大学硕士研究生学位论文 p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no f t h ec o m p l e xm i c r o b i a la g e n t s c l e a n i n gt h eu r b a nb l a c k o d o rm v e r a bs t r a c t t h ew a t e ro fu r b a nr i v e rh a sb e e ne u t r o p h i ca n do d o rd u et ot h e o 玛a n i cp o l l u t a n t s ，s u c ha sf a t 吼s t a r c h ，p r o t e i n ，c e l l u l o s ea n d c h i t i n t h u s ， d e a l i n gw i t ht h es e r i o u se u t r o p h i c a t i o na n do d o ri st h ep r i m a 巧p r o b l e m f o rt h ep u r i 6 c a t i o no fu r b a nb l a c k - o d o rr i v e r s i xs t r a i n s ，s u c ha s 尸s p “( 如，行d 刀( 夏譬s p ，b 以c f 刀fs p ，口c 反9 6 口c f ，螂s p ， i s z t 现d f 唧办d ，咒d 聆口s ，卵口z 而妒办f ，砌， r 办d c 扔c d c c z z s s p a n d b 口c f 朋加 砌“r f 馏f 阴s 括，w h i c h c o u l dd e g r a d et h em a i no r g a n i cp o l l u t a n t si nt h e w b a nb l a c k o d o rr i v e r ，w e r ei s o l a t e d 行o ms o i ls 锄p l e s s t u d i e so nt h e t r e a t m e n to fp o l l u t e dr i v e rw a t e rb ys u c hs t r a i n sa n dt h ey e a s t 、v h i c h c o u l df i xa n du t i l i z et h en i t r o g e na n dp h o s p h o i i j sd e c o m p o s e db yo t h e r m i c r o b e si nt h er i v e rw e r ec a r r i e di nl a b o r a t o r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ei n o c u l u m sc o u l de 酋f e c t i v e l yp u r i 矽t h eb l a c k o d o r “v e rw a t e r w h o s e a v e r a g er e m o v a lr a t i o so fc o d r e a c h e d21 9 ，4 7 9 ，5 8 8 a n d6 2 7 o nt h el 吼，3 r d ，5 t ha n d1o t hd 川 r e s p e c t i v e l y f i v ec o m p l e xm i c r o b i a la g e n t s ，w h i c hw e r ec o m p o s e db ya f o r e s a i d m i c r o o r g a n is m so fd 硼、e r e n td r o p o i r t i o n ，w e r ei n v e s t i g a t e di nt h et r e a t m e m m l c r o o r g a n l s m so td l f t e r e n tp r o p o i r c l o n ，w e r el n v e s 【l g a 【e ql i l l e 【r e a l i i l c i l l o fb l a c k o d o rw a t e r t h er e m o v a lo fa b o u t38 58 c o do fw a t e rc o u l d i i l 浙江工业人学硕士研究生学位论文 b e e no b t a i n e d b yt h e a d d i t i o no fs u c h c o m p l e xm i c r o b i a la g e n t s a m o n g t h ed i f i f e r e n tc o m p l e xm i c r o b i a la g e n t s ，t h ea g e n t4a n da g e n t5 g a v em e b e s te 仃色c t s ，、h i c hc o u l ds i g n i f i c a n t l yr e d u c et h ec o n c e n t r a t i o n s o ft h et n 、n h 3 - na n dp h o s p h a t e ，w h i l et h ec o m p o s i t em i c r o o 玛a n i s m a g e n t1 ，a g e n t2a n da g e n t3r e s u l t e di nn oo b v i o u se 位c t s m o r e o v e r t h e d i s 印p e a r a n c eo f t h eb l a c kc o l o ra n do d o r ，t h ei n c r e a s ei nt r a n s p a r e n c y ，t h e a p p e a r a n c eo fag r e a td e a lo fz o o p l a n k t o na n da ne n h a n c e m e n to ft h e s e l f p u r i f i c a t i o nc a p a c i t y o fr i v e r s y s t e m ， w e r eo b s e r v e da f t e rs u c h p u r i f i c a t i o n k e yw o i s ：u r b a nb l a c k o d o rr i v e r ；o 玛a n i cp 0 1 1 u t a n t s ；c o m p l e x 1 m l c r ob l a la g e n t i v 浙江工业大学顾十研究生学位论文 目录 第一章绪论 1 1 国内地表水水环境现状l 1 2 地表水水体黑臭的机理、成因1 1 2 1 地表水水体黑臭的机理1 1 2 2 地表水水体黑臭成因2 1 3 传统城镇河道治理技术3 1 3 1 引流冲污和综合调水3 1 3 2 曝气复氧3 1 3 3 底泥疏浚3 1 3 4 化学絮凝处理4 1 4 城镇河道治理新技术微生物净化技术4 1 5 课题研究意义和内容5 1 5 1 课题研究意义5 1 5 。2 课题研究内容5 1 5 3 课题创新之处6 第二章复合菌剂的开发研究。7 2 1 菌种的分离与筛选7 2 1 1 大豆油降解菌的分离与筛选7 2 1 2 淀粉降解菌的筛选7 2 1 3 蛋白质降解菌的分离与筛选8 2 1 4 纤维素降解菌的分离与筛选9 2 1 。5 几丁质降解菌的分离与筛选。1 0 2 1 6 煤焦油污染土壤中优势细菌的筛选1 0 2 2 菌种对黑臭河道河水c o d 去除效果试验1 1 2 3 菌种保存方法1 l 2 4 菌种的鉴定方法1 1 2 5 水质指标分析方法1 2 2 6 降解菌菌种筛选结果1 2 2 6 。1 油脂降解菌的筛选结果1 2 2 6 2 淀粉分解菌的筛选结果1 4 2 6 3 蛋白质水解菌的筛选结果1 6 v 浙江t 业大学硕十研究生学位论文 2 6 4 纤维素降解菌的筛选18 2 6 5 几丁质降解细菌的分离与筛选结果。2 1 2 6 6 煤焦油污染土壤中优势细菌的筛选结果2 2 2 7 复合菌剂的配制2 5 2 8 本章小结2 5 第三章复合菌剂治理城镇黑臭河道的应用研究2 6 3 1 材料与方法2 6 3 1 1 试验河道水环境2 6 3 1 2 试验设计2 6 3 。1 3 水化测定。2 6 3 2 结果与分析2 7 3 2 1 水质效果和分析2 7 3 2 2 表观效果和分析3 3 3 3 讨论一3 5 3 4 本章小结3 6 第四章结论与建议3 7 4 1 结 仑。3 7 4 2 建议3 7 参考文献3 9 鸳| 【谢。4 2 攻读学位期间发表的学术论文目录4 3 v i 浙江t 业大学硕十研究生学位论文 第一章绪论 1 1 国内地表水水环境现状 近三十多年来，我国经济发展迅速、城镇人口持续增加、城市规模不断扩张， 导致资源过度消耗、严重的环境污染和生态系统失衡问题。在水体环境方面，城 镇河道黑臭问题和湖泊富营养化现象日渐严重【l 】。 水污染是指由于人为因素直接或间接地将污染物质排入水中，改变了水体的 物理、化学和生物学特性，以致影响水的正常用途或危害国民健康及生活环境【2 j 。 据统计，全国废水排放总量每年约为3 6 6 5 亿吨以上，其中沿海4 3 个城市入海废 水量超过6 0 亿吨；淡水水域如长江、黄河、珠江、淮河等流域城市8 0 河段受 到污染，而且污染还在扩大【3 】。大量工业废水、生活污水、农业污水和地表径流 直接排入河流，加上部分河道疏于管理，造成水流不畅、水质恶化【4 j 。许多河道 水体已达不到应有的水质标准，重度富营养化、黑臭，严重制约了目前城镇经济 的发展，满足不了人民的正常生活需要。 1 2 地表水水体黑臭的机理、成因 1 2 1 地表水水体黑臭的机理 地表水水体黑臭其实是一种生物化学现象【5 1 ：当水体遭受严重污染特别是严 重有机污染时，水体中的溶解氧被大量消耗，大气或其他自然途径复氧不足以补 充有机污染消耗的氧，使水体严重缺氧，甚至趋近于零。此时，水体中微生物活 动由好氧分解转化为厌氧分解，产生难溶于水的恶臭类气体( 如c h 4 、n h 。一n 、h z s 等) ，逸出水面，使水体发臭【6 7 ，引。同时，水体中的铁、锰等金属被还原，与水中 的s 吨形成f e s 等致黑物质，致使水体发黑【9 ，1 0 l l 】。另外，缺氧水体中的有机污染 物与悬浮物在一定的条件下，会发生沉淀作用，沉积于水体底部，这些沉淀物在 厌氧条件下分解也会释放出黑臭的物质，进一步加剧水体黑臭。 浙江工业大学硕上研究生学位论文 1 2 2 地表水水体黑臭成因 地表水水体发生黑臭的过程是一个复杂的生物化学过程，它是由多方面的原因 造成的： ( 1 ) 有机污染【1 2 】 大量工业废水、生活污水、垃圾排入水体，使得水体中的有机污染负荷不断 加大( 远大于水体的正常自净能力的污染负荷) ，消耗水体大量溶解氧，使水体呈 严重缺氧状态，产生各种恶臭物质。同时，底泥中的有机物上浮，进一步加重水 体的黑臭程度，最终形成恶性循环，黑臭越演越烈。因此，有机污染是水体发生 黑臭的根本原因。1 9 8 3 年，w o o d s t 【1 3 1 就指出碳氢氮化合物超过一定的值时，水 体就容易发生黑臭。其中的乔司眯可作为表中水体黑臭程度的指示物。r o 舢a n o 【1 4 】 指出乔司眯的含量可以定量描述水体黑臭的程度，它是由放线菌在有机污染物存 在下所产生的。 ( 2 ) 溶解氧 水体缺氧是水体发生黑臭的直接原因。一般来说，正常水体中溶解氧含量很 高，自然途径的复氧量是足以补充水体有机物消耗所需的溶解氧。但对于有机污 染严重的水体来说，水体严重缺氧，水体中的化合物以还原的状态存在如f e 、m n 、 s 以f e ”、m n + 2 及s 。2 形式存在，极易形成h 。s 、f e s 等恶臭物质使水体发黑发臭。 ( 3 ) 温度 温度也是水体黑臭的一个重要影响因素。一方面，水体中溶解氧随着温度的 升高而降低。另一方面，在较高的温度下，厌氧微生物活动比较活跃，会产生大 量恶臭物质，引起水体出现不同程度的黑臭。w o o d s t 【1 3 1 曾经指出，水体温度在8 一3 5 时，水体一般会发生黑臭，是因为在这个温度范围内放线菌分解有机污 染物，产生乔司眯的活动较强一。 ( 4 ) 微生物分解 微生物在水体黑臭的过程中扮演着一个重要的角色。水体中的有机污染物， 不仅消耗掉大量溶解氧，而且为厌氧微生物的繁殖提供充足的营养，使得水体溶 解氧进一步降低，甚至趋于零，排放出不同种类恶臭物质，引起并加剧了水体黑 臭。 ( 5 ) 重金属污染 2 浙江- 丁业大学硕士研究生学位论文 重金属污染也是导致水体黑臭的重要原因之一。相关文献表明，水体中铁、 锰是致使水体黑臭的重要的因子【1 5 ，1 6 1 。当水体严重缺氧时，铁、锰会被还原，与 水体中的s 吨结合形成致黑物质，再与腐殖质结合悬浮于水体中，从而使水体呈现 黑色。水体中铁、锰的含量甚至直接决定了水体黑臭的程度。 1 3 传统城镇河道治理技术 近年来，在城镇水环境综合整治和城镇水资源再生利用研究中，人们十分关 注城镇河道污染处理问题，特别是黑臭河道治理问题。纵观国内外河道治理现状， 以下几种方法较为引人关注。 1 3 1 引流冲污和综合调水 引流冲污实质上是对水体污染物和浮游藻类的稀释扩散，就局部而言常被视 为解决水体富营养化相对简单、易行和代价较低的办法。如杭州西湖自钱塘江引 水后对延缓水体富营养化发挥了一定的作用。但从整体出发，这种办法实为污染 转移，有以邻为壑之嫌；综合调水不同于引流冲污，主要解决水资源的再分配， 利用一定的水利设施合理调活河网水系，达到“以动制静、以清稀污、以丰补桔、 改善水质”的目的，尤其对提高水体的自净能力能发挥较好的作用【i 。 1 3 2 曝气复氧 曝气复氧对消除水体黑臭的良好效果已被国内一些实验室试验及河流曝气中 试所证实。其原理是进入水体的溶解氧与黑臭物质( h 2 s ，f e s 等还原物质) 之间 发生了氧化还原反应。对于长期处于缺氧状态的黑臭河流，要使水生态系统恢复 到f 常状态一般需要一个长期的过程，水体曝气复氧有助于加快这一过程。由于 河道曝气复氧具有效果好、投资与运行费用相对较低的特点，已成为一些发达国 家如美国、德国、法国、英国及中等发达国家与地区如韩国、香港等在中小型污 染河流污染治理经常采用的方法【l 引。 1 3 3 底泥疏浚 在污染源控制达到一定程度以后，底泥则成为水体污染的主要来源。因此清 浙江工业大学顾十研究生学位论文 淤疏浚通常被认为是消除内源污染的重要措施。然而，疏浚技术通常是决定疏浚 效果好坏的关键。从最早的人工挖泥到现在的精确水下吸泥，疏浚过程对环境的 影响正在变得越来越小。疏浚作为水利工程和航道工程措施有重要效用，但作为 水质治理目前还存在一些难于克服的问题，如一定程度上引起上覆水污染物浓度 增加，疏浚后淤泥以其量大、污染物成分复杂、含水量高而难以处理等等【1 9 1 。 1 3 4 化学絮凝处理 化学絮凝处理技术是一种通过投加化学药剂去除水层污染物以达到改善水质 的污水处理技术【2 。近年来，化学絮凝处理技术在强化城市污水一级处理的效果 方面得到了越来越广泛的研究与应用，而随着水体污染形势的日趋严峻，对严重 污染的水体如黑臭( 河道) 水体的治理，化学絮凝处理技术的快速和高效也显示 其一定的优越性。但是由于化学絮凝处理的效果容易受水体环境变化的影响，且 必须顾及化学药物对水生生物的毒性及生态系统的二次污染，这种技术的应用有 很大的局限性，一般作为临时应急措施使用。 1 4 城镇河道治理新技术微生物；争化技术 微生物是自然界的生产者，同时也是分解者，在物质循环中担当重要角色。 但是这个过程不是由一种微生物完成的，而是在许多种微生物共同作用下完成的。 微生物净化河道技术，是从维护和增强水体生态自净能力这一角度出发，通 过向水体投放一种或几种功能菌等为主要成分的菌剂( 制剂) 或投放生物激活剂， 促进土著微生物的生长，提高水体有机污染物的降解速率，加速降解水体富营养 化物质，增强水体生物净化能力。一般分为微生物菌剂法和微生物促生法。 微生物促生法，作用明显，见效快( 如，汪红军等【2 l 】将美国普罗公司生产的 b e 生物促生剂用于黑臭河涌治理，结果：水体自净能力增强，水色好转，水体透 明度稳步提高) ，但成本较高不易推广。 微生物菌剂法如复合微生物制剂就是利用微生物作为自然界的生产者、分解 者、在物质循环中担当重要角色这个特点，来充分发挥微生物在水体净化的最大 功能【2 2 2 3 1 ，从而达到净化水体、消除河道如黑臭等问题。具有见效快、投资少、 操作简单等特点，显示出了巨大的应用前景。国外有类似产品，如日本的e m 菌 4 浙江工业大学硕十研究生学位论文 剂囝 2 5 1 。但在国内来说，开发的复合微生物制剂在工程上应用成功的案例少见报 、j 上 追o 1 5 课题研究意义和内容 1 5 1 课题研究意义 采用传统河道治理技术治理城镇河道特别是黑臭河道有很大的局限性，因此 迫切需要研究和发展新型、高效、经济的城镇河道治理技术。微生物净化技术是 在水体中添加具有特殊功能的微生物以提高水体有机污染物的降解速率。其优点 是不需永久性设备、能源消耗低、施作简单、没有任何环境和社会冲击、改善期 短，特别适用于城市中的池塘、湖泊、水沟，与低流量河道的水质改善。 从发达国家情况看，其河道治理的根本措施是不断优化城市发展结构，减少 污染排放，限制污染物进入河道，维护和增强水体生态自净能力。但目前，我国 城镇污染河流多为富营养化甚至黑臭水体，消除河道黑臭、控制富营养化是当前 需急切解决的问题。向城镇黑臭河流添加微生物菌剂可以提高污染物降解速率， 具有潜在的污染治理作用。因此，研究高效的微生物菌剂，净化城镇污水，加速 河流自然降解过程具有重要的理论和实践意义。 为避免造成外来物种入侵，破坏当地生物种群结构，导致二次污染等问题， 高效的微生物菌剂中的菌种成分必须为土著或本地的品种为主。 1 5 2 课题研究内容 ( 1 ) 降解黑臭河道河水中污染物的菌种分离、筛选 以黑臭河道中的某种有机污染物为目标污染物，从黑臭河道当地土壤和污泥 中分离出具有降解效果的多株菌种，对该些菌种进行降解黑臭河道河水c o d 的 试验，考察其降解去除效率；通过试验研究，选出效果最好的几株菌种，作为配 制复合菌剂的成分。 ( 2 ) 复合菌剂对黑臭河道的治理效果研究 筛选出来的各种菌种配制成不同成分的5 种复合菌剂，在黑臭河道中进行应 用试验，考察其效果，确定效果最好的1 2 种复合菌剂。 浙江工业大学硕十研究生学位论文 1 5 3 课题创新之处 ( 1 ) 开展城镇黑臭河道微生物净化技术研究，对解决当前城镇地表水黑臭问 题具有重要的指导和借鉴作用。 ( 2 ) 研制复合菌剂，首次以实际黑臭河道为对象，对类似河道治理的实际现 场研究提供借鉴作用，并对实际河道工程应用具有指导意义。 6 浙江工业大学硕士研究生学位论文 第二章复合菌剂的开发研究 2 1 菌种的分离与筛选 2 1 1 大豆油降解菌的分离与筛选 大豆油降解菌的分离与筛选：从采自宁波某炼焦厂周围污染土壤中各取1 2 个 的表层土壤样品，混合后用于分离有机污染物降解菌。分离培养之前将新鲜土壤 样品保存在4 0 c 冰箱中备用。取1 0 9 土壤置于9 0 m l 水溶液中搅拌和振荡1 0 m i n ，静置 沉降1 0 m i n 后，取上层悬液1 m l 稀释到1 0 3 ，1 0 。4 ，1 0 一。每个稀释样品取0 1 m l ，接种 于以大豆油( 福临门牌一级大豆油) 为唯一碳源的液体培养基试管( 1 8 1 5 m 1 ) 中，置 于2 8 0 c 恒温摇床( 15 0 印m ) 培养15 天。与无菌对照液体培养基试管相比，每天观察 试管内细菌生长状态( 混蚀度变化) 。从变混浊的试管中取o 1m l 混合菌液，涂布于 l b 平板上培养2 天，用灭菌牙签挑取单菌落，置于大豆油液体试验培养基试管 ( 1 8 1 5 m 1 ) 中重新筛选油脂降解菌，能够在大豆油培养基中生长的细菌可认为能够 降解油脂。 大豆油液体培养基组成：0 1 ( 、v v ) ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，o 0 9 ( w v ) k 2 h p 0 4 ， 0 0 6 ( 、7 l ，v ) k h 2 p 0 4 ，o 0 2 ( w v ) m g s 0 4 。7 h 2 0 ，1 ( v v ) 大豆油，p h7 o 。l 21o c 高压 灭菌2 0 分钟后冷却。 l b 培养基组成：1 0 9 胰化蛋白胨，5 9 酵母膏，1 0 9 n a c l ，1 5 9 琼脂，9 5 0m l d d h 2 0 ，p h7 0 。1 2 1 0 c 高压灭菌2 0 分钟后冷却。 l ( i b 培养基组成：2 0 9 朊间质蛋白胨，1 5 9k 2 h p 0 4 ，1 5 9m g s 0 4 。7 h 2 0 ，1 0 m l 甘油，9 9 0 m l d d h 2 0 ，1 5 9 琼脂，p h7 o 。 2 1 2 淀粉降解菌的筛选 淀粉降解菌株来源： l 株乳酸杆菌( 三口c ，d c d c c 甜s 肠c f 括) ，暂缩写为l l ，1 株枯草 芽胞杆菌( b 切c f 刀淞j “6 f f 胁) ，暂缩写为b s 。 淀粉降解菌培养基：l o g 淀粉，1 0 9 蛋白胨，0 5gk 2 h p 0 4 ，0 5gk h 2 p 0 4 ，0 2g m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 0 5gm n s 0 4 h 2 0 ，0 5go f c a c l 2 2 h 2 0 ，1 5 9 琼脂，1 0 0 0m l 水。1 2 l 。c 7 浙江t 业大学硕士研究生学位论文 高压灭菌2 0 分钟后冷却。 淀粉降解菌株的摇瓶培养：将供试纯菌株接种到淀粉降解菌培养基平板上再 挑一个单菌落至1 0 0m l 的液态淀粉分解菌培养基( 不加琼脂) 中进行预培养，以此菌 液做为接种菌液。用5 0 0 m l 三角瓶装入2 5 0 m 1 液体培养基，接入3 ( v v ) 的菌液，在 2 8 、1 5 0r p m 条件下摇床培养7 2 小时。 淀粉降解能力测定：采用还原醣浓度测定，比较不同菌株将淀粉分解为还原 糖的能力。还原糖浓度测定利用3 ，5 二硝基水杨酸( d n s ) 法。淀粉、纤维素和 几丁质降解所产生的葡萄糖、麦芽糖及麦芽多糖等均含有醛基，醛基能将3 ，5 二 硝基水杨酸还原成3 氨基5 硝基水杨酸，呈显色反应，可作为判断还原糖产生 量的多少或淀粉分解数量。摇瓶培培养1 5 小时后，取0 5m l 经过离心的澄清的 淀粉降解菌株的摇瓶培培养液于试管中，再加入0 5m l 已配置好的d n s 试剂， 置于沸水浴中反应1 0 分钟。将试管取出，迅速置入冷水中冷却，以终止反应。 然后再加入去离子水1 0m l 稀释。充分混合后，利用分光光度计于波长5 4 0i l i i l 下测定吸光值，再对照标准曲线计算还原醣浓度。 d n s 试剂：含3 ，5 二硝基水杨酸1 0g l ，酒石酸钾钠3 0 l ，n a o h1 6 l 。先 将n a o h 和酒石酸钾钠以5 0m l 的水溶解，然后称取1g3 ，5 二硝基水杨酸度溶解于 溶液中，再以蒸馏水定量至l o om l 。 2 1 3 蛋白质降解菌的分离与筛选 采集某菜场猪肉摊位下水道污泥样品，筛选具可分解蛋白质的菌株。污泥样 品摇匀后，取2 0 9 样品置于内含1 0 0m l 的无菌水的灭菌三角瓶中，在2 8 、1 5 0 印m 条件下振荡2 小时，混合均匀后取lm l 的悬浮液作系列稀释，以倾倒培养法，倒入 用于筛选分解蛋白质菌株的培养基中进行平板培养。在2 8 下培养2 4 天，每天观 察并挑选有透明圈出现的菌株。 蛋白质水解菌培养基：胶原蛋白2 9 ，o 8 9 k 2 h p 0 4 ，0 1 9 c a c l 2 ，0 3 9 m g s 0 4 。7 h 2 0 ， 琼脂2 0g ，自来水1 0 0 0 m l 。1 2 1 0 c 高压灭菌2 0 分钟后冷却。 蛋白质水解菌的筛选：将单一菌株以无菌牙签接种到蛋白质分解菌培养基上， 在2 8 下培养2 3 天，直接观察透明圈大小，测定透明圈的直径和菌落直径来评 估菌株蛋白酶分泌能力的强弱。 8 浙江工业人学硕上研究生学位论文 蛋白质降解菌株的摇瓶培养：将筛选出的纯菌株接种到平板上再挑一个单菌 落至1 0 0m l 的液态蛋白质水解菌培养基( 不加琼脂) 中进行预培养，以此菌液做为接 种菌液。用5 0 0 m 1 三角瓶装入3 0 0 m l 液体培养基，接入3 ( v ，v ) 的菌液，在2 8 、1 5 0 印m 条件下摇床培养4 8 小时。 2 1 4 纤维素降解菌的分离与筛选 纤维素降解菌株的分离：采集竹林土壤2 5 c m 枯枝落叶层半分解的竹叶样品， 筛选具可分解纤维素的菌株。将样品粉碎至6 0 目，取3 0 9 样品置于内含l o o m l 的无 菌水的灭菌三角瓶中，在2 8 、1 5 0 印m 条件下振荡2 小时，混合均匀后取l m l 的悬 浮液作系列稀释，以倾倒培养法，倒入用于筛选分解纤维素菌株的m e n d e l s r e e s e 培养基中进行平板培养【3 l 】。在2 8 下培养2 4 天，每天观察并挑选单菌落，用刚果 红试验初步判定，有分解圈形成的即为能够产纤维素分解酶的菌株。 m e n d e l s r e e s e 培养基：成分主要以羧甲基纤维素( c a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e ， c m c ) 为主要碳源，成分为( l ) ：蛋白胨1 0 ，c m c l 0 0 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 3 ， c a c l 2 - 2 h 2 0o 3 ，( n h 4 ) 2 s 0 41 4 ，f e s 0 4 - 7 h 2 0o 0 0 5 ，尿素o 3 ，m n s 0 4 。h 2 00 0 1 6 ， k h 2 p 0 42 o ，z n s 0 4 - 7 h 2 00 0 1 4 ，c o c l 2 6 h 2 00 0 0 2 ，琼脂2 0 o ，p h7 0 士o 1 ，液态培 养基不添加琼脂。 纤维素降解酶活性测试的刚果红试验：将单一菌株以无菌牙签接种至 m a n d e l s r e e s e 培养基上，在2 8 下培养2 4 天，然后用5 1 0m l0 1 的刚果红溶 液覆盖培养基，染色1 小时后倒掉溶液，再加入1mn a c l 溶液，静置l 小时后倒掉 n a c l 溶液，观察菌落周围是否有淡色的透明圈。若有透明圈则可判定此菌株具有 分解纤维素的能力【3 2 】。测定透明圈的直径和菌落直径来评估菌株酶分泌能力的强 弱，当透明圈的直径和菌落直径的比值大于2 5 或透明圈直径大于2 5m m 以上时， 认为该菌株具有较强的纤维素分解能力。 纤维素降解菌株的摇瓶培养：将筛选出的纯菌株接种到平板上再挑一个单菌 落至l o om l 的液态培养基( 碳源为1 c m c ) 中进行预培养，以此菌液做为接种菌 液。用其5 0 0 m l 三角瓶装入2 4 3 m l 液体培养基，接入3 ( v v ) 的菌液，在2 8 、1 5 0 印m 条件下摇床培养7 2 小时。 9 浙江_ t 业大学颁十研究生学位论文 2 1 5 几丁质降解菌的分离与筛选 几丁质降解菌的富集：将收集的龙虾壳粉碎，混入从宁波郊区菜园土中采集 的土壤样品中，在温室中培养2 个月，定期浇水，富集几丁质分解菌。 几丁质降解菌的分离和筛选：称取富集几丁质降解菌的土样1 0g ，放入盛有9 0 m l 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，在1 5 0 印m 、2 8 条件下振荡3 0 分钟，制成菌 悬液，在试管中作梯度稀释。取三个稀释度( 1 0 。3 、1 0 4 、l o 。5 ) 的菌悬液0 1m l 涂布 于几丁质培养基平板上，2 8 恒温培养3 5 天，直接观察菌落周围是否有透明圈。 测定透明圈的直径和菌落直径来评估菌株几丁质酶分泌能力的强弱。 胶体几丁质的制备：称取5 9 由某公司订购的几丁质粉末，加入5 0 0m l 浓盐酸， 反应3 0 分钟左右，期间约每5 分钟搅拌一次，然后加入2l 冰水，搅拌均匀后以9 0 0 0 印m 持续离心数次，直至p h 大约在4 左右之后，收集沉淀物放入透析袋中直到透析 液的p h 大于4 6 ，并加水及n a o h 或k o h 调p h 值至7 2 ，以灭菌釜灭菌之后置于4 冰箱中储存。 几丁质培养基的配制：2 胶体几丁质，o 3 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，o 0 7 k 2 h p 0 4 ， 0 3 k h 2 p 0 4 ，o 0 5 m g s 0 4 7 h 2 0 ，2 琼脂，p h 7 2 。几丁质液体培养基按几丁质 固体培养基组成，不加2 琼脂即可1 3 3 】。 几丁质降解菌的摇瓶培养；将筛选出的纯菌株接种到平板上再挑一个单菌落 至1 0 0m l 的几丁质液体培养基中进行预培养，以此菌液做为接种菌液。用其5 0 0 i i l i 三角瓶装入1 0 0 m l 液体培养基，接入3 ( v v ) 的菌液，在2 8 、1 5 0 印m 条件下摇床 培养7 2 小时。 2 1 6 煤焦油污染土壤中优势细菌的筛选 降解菌来源与筛选：从采自炼焦厂周围污染土壤中各取1 2 个的表层土壤样品， 混合后用于分离有机污染物降解菌。分离培养之前将新鲜土壤样品保存在4 0 c 冰箱 中备用。取5 9 土壤置于9 0 m 1 水溶液中搅拌和振荡1 0 m i n ，静置沉降1 0 m i n 后，取上 层悬液1 m l 稀释到1 0 4 ，1 0 一。每个稀释样品取0 1 m l ，接种到灭菌的污水琼脂平板( 不 加任何营养物质) ，培养7 2 小时，能够在该平板上生长的微生物可认为能分解污 水中的有机物。 l o 浙江工业大学硕上研究生学位论文 2 2 菌种对黑臭河道河水c o d 去除效果试验 用平板划线法将筛选出的每个降解菌株接种到l b 平板上，2 8 0 c 培养1 2 小时。 取一个单一菌落接种到含2 0 m ll b 液体培养基的试管中，2 8 0 c 培养1 0 小时，用于 c o d 去除试验。 在某大型老居民区内菜场旁黑臭河道采集表层水( 重污染河水、恶臭) ，用 4 0 0 目网筛过滤，去除浮游生物。经过湿热灭菌后，取1 0 0 m l 转入1 5 0m l 三角瓶中。 每个三角瓶中接入1 m l 对数生长期菌液( 接种量1 ) ，置于2 8 0 c 恒温摇床( 1 0 0 印m ) 培养，于第1 ，2 ，3 ，4 ，5 ，1 0 天，测定c o d 含量，重复两次。 2 3 菌种保存方法 将筛选得到的各种菌株用划线法接种到平板培养基，在2 8 恒温培养箱中培 养至形成单一菌落，连续划线纯化3 5 次，最后用灭菌牙签挑取单菌落，于3 0 灭 菌甘油中在7 0 下保存备用。 2 4 菌种的鉴定方法 形态学观察：将筛选菌株分别接种到l b 培养基平板上，2 8 倒置培养1 - 2 天。革兰氏染色，观察其菌落形态特征。 生理生化反应：明胶水解、淀粉水解、油脂利用、v p 试验、甲基红试验、 吲哚试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验以及糖发酵等生理生化试验及其培养基 按常规细菌鉴定方法进行( i ) 。 菌株菌体总d n a 的提取( 委托完成) ：菌体总d n a 的提取采用高盐法并作部 分改进：将o d 6 0 0 值约为1 o 的菌液1 0 m l 于5 0 0 0r m i n _ 1 离心5 m i n 。弃去上清，加入 2 m lsi ，悬浮振荡，5 0 0 0r m i n - 1 离心5 m i n 。再弃去上清，加入2 m lsi 悬浮菌体。 在悬浮液中加入2 0 0 肛l 1 0 0m g m l d 溶菌酶，3 7 水浴l h ，再加入3 0 0 “l2 0 s d s ， 剧烈振荡，水浴至澄清。加入1 3 体积的饱和n a c l ，剧烈振荡，1 2 0 0 0r m i n - 1 离心5 m i n 。 取上清，加入等体积酚：氯仿抽提2 次，每次都1 2 0 0 0r m i n d 离心5 m i n 。离心后收 集上清，在上清中加入等体积t e 调整盐浓度，再加入o 6 体积异丙醇沉淀d n a 。用 熔封的毛细管将总d n a 挑出后，用7 0 乙醇洗涤3 次，待乙醇挥发后加入1 0 0 此t e ， 放置4 冰箱过夜溶解，2 0 保存。 浙江t 业大学顾十研究生学位论文 菌株的分子生物学鉴定( 委托完成) ：采取的是用菌体直接扩增1 6 sr d n a 的 方法。p c r 扩增引物选用1 6 sr d n a 细菌通用引物( 5 端引物： 5 a g a g t t r g a t c c t g g c t c a g 3 ，3 端引物：5 1 a c c t t g l l t a c g a c t t 3 ) 。 p c r 产物采用试剂盒( a x y p r e pd n a g e le x t r a c t i o nk i t ，a x y g e nb i o s c i e n c e s ) 纯化 后，与p m d l 9 f v e c t o r 载体连接。1 6 连接l oh ，转化大肠杆菌e ，d h 5 q ， 经蓝白斑筛选，随机挑选阳性克隆，酶切质粒d n a 验证后，进行测序。测序结果 在伽a n k 数据库中进行同源性检索。 2 5 水质指标分析方法 c o d 测定和计算：按照标准方法“h z h j s z 0 0 6 0 水质化学需氧量的测定一