（作物遗传育种专业论文）玉米淀粉分支酶基因表达调控的研究.pdf

一 燮 生兰竖主兰垫堡奎 至鲞鲞塑坌查竺叁里查垫塑丝塑竺壅 摘要 本项研究应用基因工程手段 克隆玉米淀粉分支酶基因的启动子和玉米淀粉分支酶 基因 构建高效的反义表达载体并口si r n a 表达体系 通过农杆菌介导法和花粉管通道法 将其导入玉米自交系 用以抑制淀粉分支酶基因的表达 调控淀粉的生物合成过程 以 期通过基因工程手段 改变玉米淀粉合成途径 提高玉米直链淀粉的含量 取得如下结 果 1 以玉米品种 吉糯l 号 的基因组d n a 为模板 通过p c r 扩增得到玉米淀粉分支酶基 因的启动子序列 克隆到p m d l 8 tv e c t o r 上 测序结果表明 该启动子大小为9 3 4 b p 采用d n a s i s 软件进行启动子序列结构分析 发现该启动子含有种子特异表达所必需的 元件 如t a t a b o x c a a t b o x t a c a c a t 序列 c a t g c a 序列 胚乳基序 g c n 4 基序和 a c g t 元件 与已报道的序列比较仅有1 4 个核苷酸发生改变 同源性为9 8 5 用该启 动子取代植物表达载体p b l l 2 1 的3 5 s 启动子 与g u s 基因编码区连接 构建成融合质 粒p s b e g u s 经衣杆菌介导法转化烟草 获得了转基因植株 g u s 活性检测结果表明 由该启动子序列引导的g u s 基因能在种子中表达 而在其它组织中表达微弱或未表达 证实该启动子具有种子特异性表达的功能 2 以普通玉米自交系铁7 9 2 2 为材料 取授粉10 d 的幼胚盾片向上接种于m b 培养基上 诱导出的胚性愈伤组织多为颜色鲜艳 质地紧密 呈浅黄色的i i 型愈伤组织 愈伤组织 诱导率为8 2 5 胚性愈伤组织诱导率为3 9 16 培养2 周后将其转入调控培养基 2 4 d 的浓度为2 m g l 愈伤组织转变率为4 5 7 16 确定的农杆菌转化体系为浸染时间为 2 5 m i n 菌液浓度为o d 6 0 0 为0 6 共培养时间为3 d 其转化率达3 3 3 应用p c r 技术扩增了玉米淀粉分支酶的基因片段 将其克隆到p m d l 8 t v e c t o r 栽体 上 测序结果表明 克隆片段大小为1 6 9 8 b o 采用d n a s i s 软件进行序列分析 与已发 表的基因一致 将玉米淀粉分支酶基因片段反向插入到p c h m b i a l3 0 13 5 s 启动子下 构 建成表达质粒p c j s 2 b 通过农杆菌介导法将其导入玉米自交系 以再生植株叶片的总 d n a 为模板 3 5 s 启动子和终止子中的一对序列为引物进行p c r 扩增 结果从转化植株 中扩增到1 8 0 0 b p 的特异带 而未转化的植株中未扩增到该特异带 为进一步确定外源 基因的整合情况 对p c r 阳性植株进行s o u t h e r nb l o t 分析 结果表明 转化株株均有 杂交带出现 外源基因以单拷贝和双拷贝的形式插入 而未经转化的植株没有杂交信号 出现 证明外源基因已整合到基因组中 对转基因植株t 1 代的p c r 分析结果表明 外 源基因在转基因后代中能够遗传 其分离比符合孟德尔的遗传规律 以转基因玉米籽粒 的总r n a 为模板 与d i g 标记的探针进行n o r t h e r n 杂交 发现转基因植株内源s b em r n a 吉林农业大学博士学位论文 玉米淀粉分支酶基因表达调控的研究 的含量有所下降 4 克隆了玉米淀粉分支酶的基因片段 93 5 b p 将反义 正义基因片段插入到p b l l 2 135 s 启动子下 构建成表达质粒p c j s b e 2 b 通过花粉管通道法将其导入玉米自交系 获得 t o 代转化的籽粒 萌发后以单棵植株叶片的总d n a 为模板 3 5 s 启动子和终止子中的一 对序列为引物进行p c r 扩增 结果从3 棵植株中得到25 0 0 b p 的特异性扩增条带 而未 转化的植株中无该片段的产生 为进一步确定外源基因的整合情况 对p c r 阳性植株进 行s o u t h e r nb l o t 分析 结果表明 3 株均有杂交带出现 结合表达质粒h i n d l l i 酶切位 点分布情况 可以推断外源基因插入拷贝数依次为1 1 2 而未经转化的植林没有杂 交信号出现 证明外源基因已整合到基因组中 对转基因植株t 1 代的p c r 分析结果表 明 外源基因在转基因后代中能够遗传 其分离比符合孟德尔的遗传规律 以转基因玉 米籽粒的总r n a 为模板 与d i g 标记的探针进行n o r t h e m 杂交 发现转基因植株内源 s b em r n a 的含量明显下降 证明外源基因能正常表达并导致内源淀粉分支酶m r n a 降解 5 以t o 代转化的籽粒为材料 采用分光光度法对淀粉分支酶活性进行了测定 结果显 示 转基因玉米的分支酶活性分别为4 8 9 5 u 7 3 9 4 5u 4 8 0 1 5u 9 6 1 1u 和1 0 5 2 4 u 与对照 3 3 2 85u 相比有明显的下降 淀粉分支酶活 l 生降低了8 5 7 8 s 8 5 s 7 1 和6 8 说明外源基因的导入有效地抑制了淀粉分支酶基因的表达 6 以t o 代转化的籽粒为材料 采用双波长法对直链淀粉衣支链淀粉的含量进行了测定 转基因植株的淀粉含量测定结果显示 总淀粉含量分别为6 8 0 m g 6 9 0 m g 6 8 0 m g 67 3m g 和6 8 7m g 每克干重籽粒 与对照基本没有变化 6 9 3 m g g 干重籽粒 而直链淀粉的含 量 亲本为2 3 却有明显的提高 分别达到5 0 4 7 5 1 4 3 s 和4 1 证明利用反 义技术和r i q a 干扰技术有效地调控了玉米淀粉的合成过程 提高了直链淀粉的含量 关键词 淀粉分支酶基因 反义表达载体 s i r n a 启动子 转基因植株 童竺 娑查兰堡主兰壁堡皇 三鲞茎塑坌塞堕垄里查垄塑丝塑堡塞 a b s t r a c t t h ep u r p o s eo ft h i sr e s e a r c hi st oi n c r e a s et h ec o n t e n to fd i r e c t c h a i ns t a r c hi nm a i z e w i t h g e n e t i ce n g i n e e r i n gm e t h o d t h es b eg e n ee n c o d i n gas t a r c hb r a n c he n z y m ea n ds b e p r o m o t e rw e r ec l o n e d ah i g h l ye f f i c i e n ta n t i s e n s ee x p r e s s i o nv e c t o ra n ds i r n ae x p r e s s i o n s y s t e mw e r ec o n s t r u c t e d t h e nt h eg e n ec o n s t r u c t sw e r ei n t r o d u c e di n t om a i z ei n b r e dl i n e s m e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u mm e d i a t i o na n dp o l l e nt u b ep a s s a g em e t h o di no r d e rt or e s t r a i nt h e e x p r e s s i o no fs t m e hb r a n c he n z y m ea n dr e g u l a t et h eb i o l o g i c a lc o m p o s i n gp r o c e s so fs t a r c h t h em a i nr e s u l t sa r ea sf e l l o w 1 u s i n gt h eg e n o m i cd n a o fm a i z ev a r i e t y j i nn u o1 a st e m p l a t e t h es b e p r o m o t e rw a s i s o l a t e db yp c ra n dw a sc l o n e di n t op m d l 8 一tv e c t o r t h es i z eo ft h i sp r o m o t e ri s9 3 4 b p s e q u e n c i n ga n a l y s i so f t h i ss b ep r o m o t e rt h r o u g hd n a s i ss o f tw a r es h o w e dt h a tt h ec l o n e d f r a g m e n tc o n t a i n e da l lt h ee s s e n t i a lm o t i f sw h i c ho n l ye x p r e s s e di ns e e d s s u c ha st a t am o t i f c a a tm o t i f t a c a c a tm o t i f c a r g c a t gm o t i f g t a a a a g tm o t i f o c n 4m o t i fa n d a c g tm o t i f o n l y14n u c l e o t i d e ss h o w e dc h a n g e sc o m p a r i n gt ot h er e p o r t e ds e q u e n c ea n d h o m o l o g o u sr a t ei s9 8 5 0 t oc o n s t r u c tt h es b ep r o m o t e r g u sc h i m e r ag e n e t h es b e p r o m o t e rw a st h e nc l o n e di n t oe x p r e s s i o nv e c t o rp b l l 2 1t or e p l a c et h e3 5 sp r o m o t e r a n d i n s e r t e du p s t r e a mo ft h eg u sg e n ee n c o d i n gr e g i o n w et h e ni n t r o d u c e dp s b e g u si n t o t o b a c c o b ya g r o b a c t e r i u mm e d i a t i o n a n a l y s i s o fg u sa c t i v i t ys h o w e dt h a tt h eg u so n l y e x p r e s s e di ns e e d s 刑sc o n f i r m e dt h a tt h ec l o n e dp r o m o t e ri sas e e ds p e c i n cp r o m o t e r 2 b yu s i n go r d i n a r yc o r no fi n b r e dl i n e7 9 2 2a se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l t h et r a n s f o r m a t i o n c o n d i t i o n so f a g r o b a c t e r i u mm e d i a t i o nw e r eo p t i m i z e d a f t e r1 0d a y so fp o l l i n a t i o n i n f a n t e m b r y o s e l et r a n s p l a n t e do n t ot h em bh u p r u v e dm e d i u ma n d1 1 1 0 5 1e m b r y oc a l l u si n d u c e d s h o w e db r i g h t f i r ma n dl i g h ty e l l o w t h er a t eo fc a l l u si n d u c t i o nw a s8 2 5 a n dt h a to f e m b r y oc a l l u si n d u c t i o nw a s3 9 16 a f t e rt w ow e e k sc u l t i v a t i o n t h ec a l l u sw e r e t r a n s p l a n t e di n t or e g u l a t i n ga n dm a n a g i n gm e d i u m t h ec o n c e n t r a t i o no f2 4 一dw a s2 m v l t h ec h a n g i n gr a t eo fc a l l u sw a s4 5 7 1 6 t h et i m eo f a g r o b a c t e r i u mc o n t a m i n a t i o nw a s2 5 m i n u t e s t h ec o n c e n t r a t i o no fa g r o b a c t e r i u mw a s0 6o d 6 0 0a n dt h et i m eo fc o c u l t i v a t i o n w a s3d a y s t h er a t eo f t r a n s f o r m a t i o nw a s3 3 3 u s i n gp c rt e c h n o l o g y t h e1 6 9 8 b pg e n ee n c o d i n gam a i z eb r a n c he n z y m ew a sa m p l i f i e d a n dc l o n e di n t op m d l 8 t v e c t o r t h ea r r a ya n a l y s i so fd n a s i ss o f ts h o w e dt h a tt h e s e q u e n c eo fg e n ew a st h es a m ew i t ht h eg e n e so ft h o s ep u b l i c i z e db e f o r e w et h e ni n s e r t e d i i i 吉林农业大学博士学位论文 玉米淀粉分支酶基因表达调控的研究 t h ed n af r a g m e n t so fg e n ed o w n s t r e a mo ft h e3 5 sp r o m o t e ri nr e v e r s eo r i e n t a t i o n a n d c l o n e di n t op c a m b i a1 3 0 1t o g e n e r a t e r e c o m b i n a n tp l a s m i dp c j s 2 b t h e ni tw e r e i n t r o d u c e di n t om a i z ei n b r e dl i n e sb ya g r o b a c t e r i u mm e d i a t i o n t oi d e n f i f yt h et r a n s g e n i c p l a n t s u s i n gg e r o m i c d n ao ft h e r e g e n e r a t e dp l a n t s l e a v e s a s t e m p l a t e p c r a m p l i f i c a t i o nw a sp e r f o r m e dw i t l l3 5 sp r o m o t e rp r i m e r s t h e 18 0 0 b pp c rp r o d u c tw a s o b t a i n e dr e s p e c t i v e l yf r o mt h et r a n s g e n i cp l a n t s w h i l et h i sp r o d u c td i s a p p e a r e df r o mt h o s e c o n t r o lp l a n t st h a th a v en o tb e e nt r a n s p l a n t e d t h e n s o u t h e r nb l o ta n a l y s i sw a sp e r f o r m e dt o f u r t h e ri d e n t i 黟t h en u m b e ro fc o p i e st h a to fg e n ei n t e g r a t e di n t ot h eg e r o m i ed n ao ft h e t r a n s g e n i cp l a n t a n dt h er e s u l ti n d i c a t e st h a th y b r i ds i g n a lo c c u r r e di nb o t ht h et r a n s g e n i c p l a n tl i n e sw i t ho n eo rt w oc o p i e s r e s p e c t i v e l y b u tt h e r ew r i t sn oh y b r i ds i g n a l ss h o w ni n p l a n t st h a th a d n tb e e nt r a n s p l a n t e d w ec a l li n f e rf r o mt h a tt h ei n t r o d u c e dg e n e sc a nb e d e s c e n d e di nt h ef o l l o w i n gg e n e r a t i o n s a n dt h es e p a r a t i n gr a t ef i t st om o d e l sg e n e t i cl a w t h et o t a lr n aw a si s o l a t e df r o mt m n s g e n i cm a i z es e e d sa n d s u b j e c tt on o r t h e r nb l o ta n a l y s i s u s i n gs b ee d n aa sp r o b el a b e l l e d v i md i qa n dt h e nw ef o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o no fs b e m r n a s i g n i f i c a n td e c r e a s e d 4 t h es e c o n df r a g m e n t s9 3 5 b po fm a i z es t a r c hb r a n c he n z y m ew a sa l s oo b t a i n e db yp c r u s i n gg e n e s p e c i f i c p r i m e r s t h e nt h ea n t i s e n s ea n ds e n s eg e n ef r a g m e n t sw e r ei n s e r t e d u p s t r e a mo f3 5 sp r o m o t e ra n dc l o n e di n t op b l l 2 1t oc o n s t r u c tr n a ie x p r e s s i o nv e c t o r p c j s b e 2 b w ei n t r o d u c e di ti n t om a i z ei n b r e dl i n e sb yp o l l e np i p ep a s s a g em e t h o da n d o b t a i n e dt 0 9 e n e r a t i o nt r a n s g e n i cs e e d s w h e nt h es e e d ss p r o u t e d u s i n gt h eg e n o m i ed n a f r o ms i n g l ep l a n t sl e a v e sa st e m p l a t e a n dp c ra m p l i f i c a t i o nw a sp e r f o r m e dw i m3 5 s p r o m o t e rp r i m e r s t h e2 5 0 0 b pp c rp r o d u c tw a so b t a i n e dr e s p e c t i v e l yf r o mt h r e et r a n s g e n i c p i a i b w h i l e d f i sp i o d u c td i s a p p e a r e df i o mt h o s ec o n t r o lp l a n t st h a th a v el l o tb e e n t r a n s p l a n t e d t h e n s o u t h e r nb l o ta n a l y s i sw a sp e r f o r m e dt of u r t h e ri d e n t i f yt h en u m b e ro f c o p i e st h a to fg e n ei n t e g r a t e di n t ot h eg e r o m i cd n a o ft h et r a n s g e n i cp l a n t a n dt h er e s u l t i n d i c a t e st h a th y b r i ds i g n a lo c c u r r e di na l lt h et h r e ep l a n t s c o m b i n i n gt h el o c a t i n gc o n d i t i o n s o fe x p r e s s i o ns u b s t a n c eh i n d l i le n z y m ec u t t i n gp o s i t i o n s w ec a l li n f e rt h a tt h ei n s e a e dc o p y n u m b e r so fi n t r o d u c e dg e n e sa r e1 1a n d2 r e s p e c t i v e l y n oh y b r i ds i g n a l so c c u r e di np l a n t s t h a th a dn o tb e e nt r a n s p t a n t e d a n dt h a ti n d i c a t e st h a ti n t r o d u c e dg e n e sh a v eb e e ni n t e r g r a t e d i n t ot h eg e n o m i cd n ao ft r a n s g e n i cm a i z e t h ep c rr e s u l t so ft h et 1g e n e r a t i o nt r a n s g e n i c p l a n ti n d i c a t e st h a ts b eg e n ed e s c e n d e di nt h ef o l l o w i n gg e n e r a t i o n a n dt h es e p a r a t i n gr a t e f i t st om o d e l sg e n e t i cl a w t h et o t a lr n aw a si s o l a t e df r o mt r a n s g e n i cm a i z es e e d sa n d v 童苎室些查兰堕主兰壁堡塞 至鲞鎏筮坌塞堕茎里查兰塑苎塑塑壅 s u b j e c tt on o r t h e r nb l o ta n a l y s i su s i n gs b ec d n aa sp r o b el a b e l l e dw i t hd 1 ga n dw ef o u n d t h a tt h ee x p r e s s i o no fs b em r n a s h a r p l yd e c r e a s e d t h i sr e s u l ti n d i c a t e st h a tt h er n a i t e c h n o l o g yi n h i b i t e ds b eg e n ee x p r e s s i o na n dl e a dt ot h ed e c r e a s eo fo r i g i ns t a r c hb r a n c h e n z y m em r n a 5 f r o mt h eg e n e r a t i o nt r a n s g e n i cs e e d s t h ea c t i v i t yo fs t a r c hb r a n c he n z y m ew a sa s s a y e d u s i n gt h ed i v i d i n gr a ym e t h o d t h er e s u l ti n d i c a t e st h a tt h ea c t i v i t yo fb r a n c he n z y m eo f t r a n s g e n i cm a i z ew a s4 8 9 5 u 7 3 9 4 5 u 4 8 0 1 5 u 9 6 1 1 ua n d1 0 5 2 4 u w h i c hd e c r e a s e db y 8 5 7 8 8 5 7 1 6 8 w h e nc o m p a r e dt ot h e3 3 2 8 5 uo fc o n t r 0 1 a n dt h ea c t i v i t y i n d i c a t e st h a tt h ei n s e r to f i n t r o d u c e dh a se f f i c i e n t l y r e s t r a i n e dt h ee x p r e s s i o no f s t a r c hb r a n c h e n z y m e 6 t h ec o n t e n to fd i r e c tc h a i ns t a r c ha n db r a n c hc h a i ns t a r c hw e r ea l s oa s s a y e df r o mt o g e n e r a t i o nt r a n s g e n i cm a i z eu s i n gd o u b l ew a v e l e n g t hm e t h o dt ot e s t t h er e s u l to f t r a n s g e n i c s t a r c hc o n t e n ti n d i c a t e st h a tt h et o t a ls t a r c hc o n t e n ta r e6 8 0 m g 6 9 0 r a g 6 7 3 m ga n d 6 8 7 m g n e tc o n t e n t r e s p e c t i v e l y t h e r ei sb a s i c a l l yn os h a r pc h a n g ec o m p a r e dt ot h ec o n t r o l 6 9 3 m g g n e tc o n t e n t t h ec o n t e n to fd i r e c tc h a i ns t a r c hh a sb e e nr a i s e do b v i o u s l y t h a to f t h eo r i g i no n ei s2 3 a n dr e a c h e dr e s p e c t i v e l y5 0 4 7 5 1 4 3 4 1 t h a ti n d i c a t e s t h eu s eo fa n t is e n s ea n dr n a it e c h n o l o g yh a se f f e c t i v e l yr e g u l a t e dt h ec o m b i n a t i o np r o c e s s o f c o r ns t a r c h a n dr a i s e dt h ec o n t e n to f d i r e c tc h a i ns t a r c h k e yw o r d s s t a r e hb r a n c he n z y m eg e n e a n t i s e n s ee x p r e s s i o nv e c t o r s l i g h ti n t e r f e r e n c e r n a p r o m o t e r t r a n s g e n i cp l a n t s v 内容提要 1 本研究克隆了玉米淀粉分支酶基因的启动子序列 并构建了与 f l u s 基因编码区连接的 融合表达质粒p s b e g u s 经农杆菌介导法转化烟草 获得了转基因植株 g u s 活性检测 表明 该启动子具有种子特异性表达的功能 2 应用p c r 技术扩增了玉米淀粉分支酶的基因片段 成功构建了反义表达载体和s i r n a 的表达体系 通过农杆菌介导法和花粉管通道法将其导入玉米自交系 通过p c r 检测和 s o u t h e r n 杂交分析 证明外源基因已整合到基因组中 对转基因植株t l 代的p c r 分析 结果表明 外源基因在转基因后代中能够遗传 其分离比基本符合孟德尔的遗传规律 以转基因玉米籽粒的总r n a 为模板 与d i g 标记的探针进行n o r t h e r n 杂交 发现转基 因植株内源s b em r n a 含量明显下降 证明外源基因在转基因植株中能正常转录 3 以t o 代转化的籽粒为材料 对转基因植株的淀粉分支酶活性和淀粉含量进行了检测 结果显示 转基因玉米的分支酶活性与对照相比有明显的下降 总淀粉含量与对照基本 没有变化 但直链淀粉的含量却有明显的提高 证明利用反义技术和r n a 干扰技术有效 地抑制了淀粉分支酶基因的表达 调控了玉米淀粉的合成过程 提高了直链淀粉的含量 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的研究成果 除玟 r t l 已经注明引用的内容外 本文不包含任何其他个人或集体已 经发表或撰写过的研究成果 也不包含获得占林农业大学或其他教育机构的学位 证书而使用过的材料 与本人一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确说明并表示谢意 学位论文作者签字 签字日期 年月同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许 论文被查阅和借阅 本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复印手段保存 汇编学位 论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签字导师签字 签字日期 年月 日签字日期 年月同 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话 邮编 塑苎查些奎兰堡圭燮塞 至鲞堕塑坌壅竺苎里查茎塑丝箜堑壅 引言 淀粉是世界绝大多数人口的主要食物来源 同时也是食品和化学工业的重要原料 淀粉在不同领域中的应用取决于其分子结构 淀粉分子结构的重要参数包括 直链淀粉 和支链淀粉的比例 直 支比 直链淀粉的聚合度 支链淀粉分支链长及分布等等 这些参数影响淀粉加工的理化和功能特性 其中 直 支比是淀粉分子结构最重要的分 子结构参数 一般普通玉米淀粉直 支比为1 3 直 支比大于l 的是高直链淀粉 高直 链淀粉具有更快的凝胶化作用 凝胶强度高 作为食品添加剂在改善食品的质地和结构 方面具有独特的效果 许多类型的胶卷中使用高直链淀粉 是因为其具有独特的透明性 柔韧性 拉伸强度及防水性 目前人们对环保日益关注 高直链淀粉生产的可再生 可 降解膜可以减少工业废气及减弱温室效应气体的释放 正开益引起人们的兴趣 支链淀 粉具有更好的黏性 可增加膨化食品的体积 作为食品添加剂具有不同于直链淀粉的效 果 在粘台剂领域具有较多的应用 此外 那些介于直链淀粉和支链淀粉之间的中间成 分 其淀粉分支链的长度和分支程度等物理参数有所不同 可能会有不同的理化性质 因而有着不同的用途 当天然淀粉满足不了某一功能需求时 就需要对淀粉实行化学 改性 而这些加工过程会增加耗费 加重环境污染 另一产生具有不同理化特性淀粉的 途径就是从遗传上改变淀粉的代谢途径 随着淀粉合成过程中相关酶基因的克隆以及各 种植物遗传转化体系的相继建立 使利用基因工程调控淀粉合成过程 改良淀粉品质成 为可能 为创造新型淀粉提供有效的手段 在高等植物中 淀粉合成的主要场所是淀粉体和叶绿体 其合成过程受到一系列酶 的调控 在叶绿体中 参与淀粉合成的碳源物质是通过卡尔文循环固定c 0 2 而在淀粉 体中 由于它自身不能进行光合作用固定c o z 所以依赖蔗糖作为淀粉合成的碳源 经 水解后的蔗糖以磷酸葡萄糖的形式进入淀粉体中参与淀粉的合成 在淀粉合成最后阶段 的关键性调节酶为 a d p g 焦磷酸化酶 a d pg 1 c p y r o p h o s p h o r y l a s ea g p p 淀粉合成 酶 s t a r e h s y t h a s e s s 淀粉分支酶 s t a r c hb r a n c h i n ge n z y m e s b e 和淀粉去分 支酶 s t a r c hd e b r a n c h i n ge n z y m e s d b e 淀粉分支酶是植物淀粉生物合成过程中的 一个起关键性调节作用的酶 它催化葡萄糖以n 一 1 6 键连接 形成分支结构 目 前 对淀粉分支酶基因和淀粉分支酶已从分子水平和生物化学方面进行了一定的研究 为人们利用基因工程技术对其实行遗传操作奠定了基础 由于反义技术 a n t i s e n s e 吉林农业大学博士学位论文 玉米淀粉分支酶基因表达调控的研究 t e c h n i q u e 和r n a 干扰 r n ai n t e r f e r e n c e r n a i 技术提供了直接有效的人为控制基 因表达的方法 可以封闭特定基因的表达 引起基因转录后沉默 p o s t t r a n s c r i p t i o n a l g e n e s il e n c i n g p t g s 所以 应用反义技术和r n a 干扰技术来抑制淀粉合成的关键 酶基因的表达 进而控制淀粉的合成途径 实现应用基因工程手段改良淀粉品质 以满 足工业生产和人民生活的各种不同需求 这是常规育种所无法达到的 显示出在植物品 种改良中具有广阔的应用前景 在玉米淀粉分支酶基因表达调控机制研究中另一个有价值的课题是淀粉分支酶基 因顺式作用元件的研究 我们知道 真核基因表达是严格按一定时间 空间顺序发生的 事件 转录调控是通过顺式作用元件与反式作用因子的相互作用来实现的 而启动子是 调控基因高效表达的关键元件 分为组成型启动子 c o n s t i t u t i v ep r o m o t e r 组织或器官特 异性启动子 t i s s u eo ro r g a n s p e c i f i cp r o m o t e r 和诱导型启动子 i n d u c i b l ep m m o t e r z 类 在组成型启动予控制下 结构基因的表达大体恒定在一定的水平上 在不同组织部位表 达水平也没有明显差异 即表达不具时空特异性 也不受外界因素的影响 诱导型启动 子是在某些特定的物理或化学信号的刺激下 可以大幅度地提高基因的转录水平 在组 织特异性启动子控制下 基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位 并往往 表现出发育调节的特性 高等植物细胞分化的分子本质是不同基因差异表达的结果 大 多数发育调控基因的表达都具有时间性和空间性 采用分子生物学对农作物进行遗传操 作改良的过程中 常常希望插入的外源基因能够限制在特定的组织中表达 这就需要通 过有效的组织特异性启动子对靶基因的表达进行调控 目前 在植物组织表达载体中广 泛应用的启动子是组成型启动子 在这些组成型启动子的控制下 外源基因在转基因植 物的所有部位和所有的发育阶段都会表达 然而外源基因在植物体内持续 高效的表达 不但造成浪费 往彳丰还会引起植物的形态发生改变 影响植物的牛长发育 为了使外源 基因在植物体内有效发挥作用 同时又可减少对植物的不利影响 目前人们对特异表达 启动子的研究和应用越来越重视 因此 分离和克隆玉米淀粉分支酶基因的启动予 一 方面可为淀粉分支酶基因表达调控机制的研究提供有用的元件 另一方面也为植物基因 工程中现有表达载体启动子的改造奠定基础 具有非常重要的理论和实践意义 第一篇文献综述 1 淀粉分支酶的生物化学与分子生物学研究进展 1 1 淀粉分支酶的基础生物化学研究 淀粉是玉米籽粒的主要成分 根掘结构的差异分为直链淀粉和支链淀粉两种 其合 成过程受到一系列酶的调控 淀粉分支酶是淀粉生物合成过程中的一个关键酶 它催化 葡萄糖以q 1 6 键连接 形成分支结构 4 淀粉分支酶有s b e a 和s b e b 两大 家族 6 s b e a 家族包括玉米s b ei ia 玉米s b e1 ib 水稻s b e i h n 豌豆s b ei 而s b e b 家族包括玉米s b e 水稻s b e1 和豌豆s b e l i 等 通过对水稻s b ei 和水稻s b e i i i 的氨 基酸序列比较分析发现 s b ei 和s b e i i i 成熟蛋白大小相近 分别由7 5 6 个氨基酸和7 6 0 个氨基酸构成 其中四个催化位点具淀粉分解酶的保守序列 两者前体均含类似 g 1y a l a v a l a r g 四残基重复顺序的转运肽 四残基结构很可能是s b e 前体转移至造粉 体的靶信号 s b ei 和s b e i i i 氨基酸序列虽十分相似 但在蛋白分子的中心区 两者结构 仍存在差异 如s b e i i in 端具有约7 0 残基的特殊序列并缺少近5 0 残基的c 端序列1 7 j 玉米s b e 有三种同工酶 s b ei s b e i i b 主要在胚乳中存在 s b e i i a 主要在叶片中 存在 它们共同参与支链淀粉的合成 8 19 1 g a o 等1 1 0 j 由s b e i i ac d n a 推测的s b e i i a 氨基 酸序列与从玉米胚乳纯化而来的s b e i i a 蛋白序列相吻合 虽然s b ej i a 和s b e i i b 分子 量接近8 0 k d 氨基酸组成及酶切图谱也相似 但因s b e i i a 含有4 9 个氨基酸的n 端延伸 和基本序列区的差异而与s b e i i b 有所差异 正足结构的差异使它们在支键淀粉合成 i 起不同作用 s b ei 作用的底物是直链淀粉 它能使较长的糖苷链转移到直链淀粉上 但转移到支链淀粉上的能力很弱 s b ei 在直链上产生分支的效率是在支链上产生分支 的十倍以上 与之相反 s b e i i 作用的底物是支链淀粉 能使较短的糖苷键转移到支 链淀粉上 而且s b e i i a 的活性大大高于s b e l l b s b e l i b 对胚乳直链淀粉含量的作用最 大 其编码基因的突变 玉米a p 突变体 可使玉米胚乳中直链淀粉的含量达到5 0 9 6 a 玉米s b e 2 b 基因在不同遗传背景下对直链淀粉的含量的效应明显不同 可以使直链淀粉 的含量达到2 0 到7 0 l l j 吉林农业大学博士学位论文 玉米淀粉分支酶基因表达调控的研究 1 2 淀粉分支酶基因的分子生物学研究 近年来s b e 基因已从玉米 水稻 马铃薯 木薯 豌豆等 1 5 1 8 1 植物克隆出柬并进行 了序列分析 虽然同工酶问氨基酸序列同源性较高 但同义密码子的使用造成核苷酸序 列的差异较大 关于玉米胚乳s b e i i a 和s b e i ib 的来源有两种对立假说 p r e i s s i 押l 提 出两者差异来自转录后调控 即所谓单基因假说 另一相对的二基因假说则认为两者出 不同的结构基因编码 玉米a 日突变体胚乳缺乏s b ei jb 活性丽s b e1 ia 水平保持正常有 力证实了后一假说1 2 在植物不同组织以及同一组织的不同发育时期 s b e 同工酶基因 的表达存在差异 玉米s b e 2 am r n a 水平在胚组织中为胚乳中的