（微生物学专业论文）海洋细菌素1701生物合成条件优化.pdf

_ _ _ _ - _ 。一 一 i i i ii iii 1 l el ii i iu l 17 4 8 3 3 7 o p t i m i z a t i o no f t heb i o s y n t h e s i sc o nd i t i o nso f m a r i n eb a c t e r i o c i n17 01 s u b m i t t e di np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ri ns c h o o lo fl i f es c i e n c e s ，f a f u c o l l e g e ： s c h o o lo fl i f es c i e n c e s s p e c i a l i t y ：m i c r o b i o l o g y e n t r a n c ey e a r ：2 0 0 7 s u b m i t t e d ： i na p r i l ，2 010 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：_ 务 论文使用授权的说明 日期：弘卜。 - w j p j + b ) j = l 可见b p 网络的训练过程就是不断地调整权值w 和阈值b 的过程，通过反向学习调整w 和b 值， 使输入与输出之间建立映射关系。经过训练的b p 网络，只要给定一个输入，就能得到对应输出。 图1 2 三层b p 神经网络 f i g 1 - 2t h et h r e e - l a y e rb p n e u r a ln e t w o r k 图1 2 为具有三层b p 神经网络的结构示意图，包括输入层、隐含层和输出层。理论上已经证明 一个三层神经网络可以逼近任何有理函数1 1 9 1 。目前人工神经网络微生物发酵过程的建模已越来越 多，如英国的m o n t a q u l 等对菌丝体连续发酵过程的神经网络建模能很好地结出生物晕的精确估计： 我国的胡泽提出基于神经网络的连续发酵非线性自适应控制方法可心较好地使洒精产率维持在最优 值附近。 1 3 3 人工神经网络与遗传算法的结合 人工神经网络常常与各种算法进行结合，来解决各种优化问题2 0 1 。其中a n n 常与遗传算法 ( g e n e t i ca l g o r i t h m ，简称g a ) 结合来寻求符种复杂映射关系的极值。“遗传算法”最初是1 9 6 7 年由美幽m i c h i g a n 大学h o l l a n d 教授的学生b a g l e y 在其博十论文中提出，它是基于生物遗传和进化 机制的适合于复杂系统优化的自适应概率优化技术2 0 1 。遗传算法一般步骤如图 臣堕回 图1 3 遗传算法流稃图 f i g 1 - 3t h ef l o w c h a r to fg a 7 福建农林大学硕士毕业论文 如图1 3 遗传算法的基本过程是：首先对变量进行二进制编码，然后进行各种遗传操作( 重组、 、变异等) 得到新的个体，同时要建立适应度函数，新的个体与适应度比较以确定是保留还是 ，保留下来的个体，重新进行编码与遗传操作得到新个体再用适应度函数进行评价，这样不断 循环，直到得最优个体，最终留下的就是最优的个体，再解码，就可得到最优解。 将神经网络与遗传算法偶联起来就可以用于解决各种最优化问题【2 1 1 ，如图l - 4 ： 图1 - 4 人工神经网络与遗传算法的偶联 f i g 1 - 4t h ec o u p l i n go f a n n a n dg a 如图l - 4 所示，输入变量可以先进行二进制编码并初始化，再解码变成神经网络的输入值，并 练好的神经网络a = s i m ( n e t ，p ) 可以得一组输出，分配适应度，选择较优个体保留下来，这样经过 遗传，直至最优值不再变化。最后对变量进行解码，取得最优值时的各变景的输入。这种优化 输入可用来指导我们的发酵控制，以使生物合成水平最大化。目前遗传算法已在生物技术与生 、化学与化学工程、医学与医学工程、建模与模拟、人工智能等领域上得到广泛应用，成为求 局优化问题的有力- t 具之一1 2 2 j 。 本论文的研究目的与意义 本论文研究内容是根据实验室的前期研究基础，采用现代发酵工艺优化综合技术手段，对海洋 1 7 0 1 菌株的产素条件进行优化，目的是得到足够数量的抗菌活性成分粗品，便于进一步提纯精 品和开展后续结构研究。同时，发酵工艺优化研究结果有助于为将来对该菌株的产业化开发积 础发酵条件参数。 8 苫 福建农林人学硕：j ：毕业论文 第2 章单因素法筛选最优营养和培养条件 2 1 研究目的 通过单冈素法【1 4 1 筛选适合海洋细菌1 7 0 1 生物合成的碳源、氮源、无机盐等营养条件及营养温度、 初始p h 值等培养条件。 2 2 实验材料 2 2 1 供试菌株 具有合成抗菌活性的海洋细菌1 7 0 1 及多重耐药菌t y ( 3 ) 5 、t v ( 3 ) 7 、e j ( 2 7 ) 、t u ( 3 ) 2 3 、t m ( 3 ) 4 、 e u ( 3 ) 2 5 、e l ( 3 ) i8 均由中山大学微生物分子生物学与生物技术实验( m m b l ) 提供。 2 2 2 实验仪器 g & gj j 1 0 0 型精密电子天平( 美国) a v a n t i t mj 2 5 摇床( 德国) h i r a y a m a 公司h v e 5 0 型高压灭菌锅( 日本) 2 3 实验方法 2 3 1 指示菌的选择 根据前期的研究t 作，海洋细菌1 7 0 1 抗活性的追踪选用的是耐药性较弱的初筛指示菌t y ( 3 ) 5 。 为了更好、有效地追踪1 7 0 1 的活性物质，从实验室保存的多重耐药菌巾再选择一株耐药菌辅助跟踪 细菌1 7 0 1 的抗菌活性。这些指示菌的耐药性能如表2 - 1 。 表2 - 1 指示菌的耐药性能1 3 1 t a b l e2 1a n t i b i o t i cr e s i s t a n c eo ft h ei n d i c a t o r s 磊j 蔼 氨卞青霉素钠四环素 氯霉素硫酸链霉素 乳糖酸红霉素 编呈 ! ! 旦竺型竺! ! ! 墨塑! ! ! 曼! 翌! ! ! ! 型竺! 鱼! ! 型竺! - _ _ - _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。_ 。_ _ - - _ 。- _ 。_ 。_ 。- _ 。1 。_ 。”。一一一 t y ( 3 ) 5 +一 t v ( 3 ) 7 + + +一卅 + + +卅 e j ( 2 7 ) + + + + t u ( 3 ) 2 3 卅+ + +卅卅 tm(3)4+ -+ eu(3)25+ + + + e l ( 3 ) 1 8 + + + + 一十+ + 注：“一表示菌株生长完全抑制；“+ ”表示菌株有少量菌落生长；“+ + ”表示菌株仍可以生长，但受到抑制；“卅” 表示菌株生长完全没有受到影响 9 最后根据抑菌圈的火小及透明 ( o d 值) 对培养时间作图， 体o d 值及抑菌活性，最后根 葡萄糖标准曲线的测定采用d n s 法1 2 4 j 2 3 5 甘油标准曲线的测定 甘油标准曲线的测定采用甘油铜法【2 5 】 2 3 6 确定培养基的水质 由于陈海水成分复杂且不稳定，不利后面的培养基优化，通过设计不同的水源与n a c l 浓度组一 以期能用淡水替代陈海水来配制培养基。不同的培养基组合方式如表2 2 。 表2 2 培养基配方 t a b l e2 - 2t h ec o m p o s i t e so fm e d i u m z o b e l l1z o b e l l2z o b e l l3z o b e l l4z o b c l l5 蛋白胨g 55555 酵母浸出粉g ll l l l 葡萄糖g 55555 n a c lg 2 51 2 5001 2 5 蒸馏水m l 1 0 0 05 0 00 5 0 0 1 0 0 0 陈海水m l 05 0 01 0 0 0 5 0 00 通过海洋细菌1 7 0 1 在上述不同的培养基中的菌体生长与抑菌活性物质合成的情况，来选择一 培养配方作为优化起始培养基。 2 3 7 碳源的筛选 由于各种碳源中碳原子的质量分数不同，为使实验结果具有可比性，对各种碳源进行碳质毒 算，即要求加入的各种碳源具自相同的碳质量【2 6 】。本实验共筛选了6 种碳源，每隔一定时问取柠 测菌体o d 值、还原糖浓度及上清液对指示菌的抑菌能力，利用3 个指标综合评价各种碳源的优： 1 0 一塑垄奎签奎堂堡主望些笙壅 - _ - - _ - _ _ 一一 2 3 8 有机氮源的筛选 由于各种氮源中氮原子的质量分数不同，为使实验结果具有可比性，对各种氮源进行氮质鼍换 算，即要求加入的各种氮源具有相同的氮质量2 7 1 。本实验共筛选了6 种氮源，每隔一定时l 日j 取样， 测菌体o d 值、甘油浓度及上清液对指示菌的抑菌能力，利用3 个指标综合评价各种氮源的优劣。 2 3 9 无机盐的筛选 无机盐的浓度参照工业微生物常用浓度f 2 8 】。方法类同碳源的筛选。 2 3 1 0 培养基质p h 值对细菌1 7 0 1 产素的影响 分别设置不同培养基初始p h ，每隔一定时间取样，测菌体o d 值、甘油浓度及上清液对指示菌 的抑菌能力，利用3 个指标综合评价各初始p h 的优劣。分别设置不同培养基初始p h ，从4 8 h 开始， 每隔2 4 h 调控培养基质的p h ，比较不同的调控方式对抑菌活性成分的影响。 2 3 1 1 单因子的叠加 根据各单因素法筛选到营养条件，对各单冈子进行叠加，分别设置不同的叠加方式，每隔一定 时间取样，测菌体o d 值、甘油浓度及上清液对指示菌的抑菌能力，最后确定单因素法筛选到的最 优冈子组合。这些因子将成为下一步实验进一步优化。 2 4 实验结果与分析 2 4 i 指示茵及其生长曲线 海洋细菌1 7 0 1 发酵上清液对不同指示菌的抑菌能力如图2 - i 。 福建农林大学硕士毕业论文 1 6 0 0 1 4 0 0 指示菌 图2 1 海洋细菌1 7 0 1 发酵上清液的抑菌作用 f i g 2 - 1t h eb a c t e r i o s t a s i so f t h ef e r m e n t a t i o ns u p e r n a t a n to f m a r i n es t r a i n1 7 0 1 细菌1 7 0 1 发酵上清液对t u ( 3 ) 2 3 抑菌圈最大，而对e l ( 3 ) 8 基本没有抑菌作用。上清液对t u ( 3 ) 2 3 抑菌效果虽然明显，但由于抑菌罔太大系统误差也较大，且平板大小有限不利于在同一个平板放置 多个牛津杯，不宜选做指示菌。其中e u ( 3 ) 2 5 是超强耐药菌，抑菌圈大小适中且明亮适合用作指示 菌。最终确定使用e u ( 3 ) 5 和t y ( 3 ) 5 作为指示菌追踪细菌1 7 0 1 抗菌活性物质。两个指示菌在不同温 度下的生长曲线如图2 2 和图2 3 。 4 0 0 3 5 0 3 0 0 2 5 0 o o o 。2 0 0 1 5 0 1 0 0 o 5 0 0481 21 62 02 4 2 83 23 6 4 04 44 8 培养时间( h ) 图2 - 2 指示菌t y ( 3 ) 5 在不同温度下的生长曲线 f i g 2 2t h eg r o w t hc u r v eo fi n d i c a t o rt y ( 3 ) 5u n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s 1 2 2 o 8 6 4 2 o gev聪删臣姐晕 福建农林人学硕1 ：毕业论文 5 o o 4 5 0 4 o o 3 5 0 3 0 0 o 暑2 5 0 o o2 0 0 1 5 0 1 o o o 5 0 0 0 0 0 4 81 2 1 62 02 4 2 8 3 23 64 04 44 85 25 66 0 “6 87 27 6 培养时间( h ) 图2 3 指示菌e u ( 3 ) 2 5 在不同温度下的生长曲线 f i g 2 - 3t h eg r o w t hc u r v eo f i n d i c a t o re u ( 3 ) 2 5u n d e r d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s 如图2 - 2 和图2 - 3 ，指示菌t y ( 3 ) 5 和e u ( 3 ) 2 5 在2 2 下培养生长较好，作为指示菌，菌体须培 养至对数期，因此指示菌t y ( 3 ) 5 和e u ( 3 ) 2 5 的培养时间分别是1 2 h 和3 6 h 。 2 4 2 温度对细菌1 7 0 1 产素的影响 01 22 43 64 8 培养6 时0 间7 ( 2 ”8 4 9 61 0 81 2 01 3 21l o 一2 2 o 一2 5 6 2 8 铲3 1 一3 4 a a ta b e 2 刁2 d e z z 勿 圆4 d 目5 d c 培养温度( ) 6 o o 5 0 0 4 o o 3 肿量 o 2 0 0 0 1 o o o o o 1 0 0 2 o o 图2 4 培养温度对海洋细菌1 7 0 1 生物合成的影响 f i g 2 4t h ee f f e c to f c u l t u r et e m p e r a t u r eo i lb i o s y n t h e s i so f m a r i n es t r a i n17 0 1 注：ad t 表示对指示菌r y ( 3 ) 5 的抑菌直径 1 3 肿肿肿舯 l重王2，o 9 8 7 6 5 4 3 2 o ；i euj一。o司 福建农林大学硕十毕业论文 培养时间( h ) 01 22 43 64 86 07 28 49 61 0 81 2 01 3 2 ” j 、一d 二 三童 二一雪三二 舟 一豇 吨 囫2 d 囫3 d 圆4 d 目5 d 。 ： 一一 妻妻 a - 一 三 二 三 - 一一 三 囊 a 三 匿 三斑， j 一 cl ，一 多l ，一 a 圭 匡 薹 c p 一2 5 囊三匡三彦 6 2 8 俨3 1 o 一3 4 1 2 7 爿j 。 培养温度( ) 图2 5 培养温度对细菌1 7 0 1 生物合成的影响 f i g 2 - 5t h ee f f e c to fc u l t u r et e m p e r a t u r eo nb i o s y n t h e s i so fm a r i n es t r a i n17 01 注：ad e 表示对指示菌e u ( 3 ) 2 5 的抑菌直径 从图2 - 4 和图2 5 可以明显看出细菌1 7 0 1 随着培养温度升高菌体生长地越好，但是产素水平越 低。其中培养温度为2 2 c 、2 5 和2 8 ( 2 时产素水平之间没显著差异，考虑到要控制培养温度在2 2 。 稿m肿 & i 屯 王 z l n j 五 n 吼 & z & i 乱 王 z l m 暑暑v。q日 福建农林人学硕士毕业论文 如图2 - 6 ，匍萄糖浓度与o d 5 4 0 的线性关系可以描述为y = 0 0 0 6 4 6 + 0 0 5 5 8 5 x ，相关系数 r = 0 9 9 8 2 6 ，线性关系显著，可以用于下面实验的工作曲线。 2 4 4 甘油标准曲线 0 0 0 20 40 60 81 01 2 1 41 61 g2 0 o d 6 3 0 图2 7 甘油标准曲线 f i g 2 - 7t h es t a n d a r dc u r v eo fg l y c e r o lq u a n t i t a t i o n 如图2 7 ，甘油浓度与o d 6 3 0 的线性关系可以描述为y = i 1 4 3 3 4 + 2 9 7 1 7 7 3 + x ，相关系数 r = 0 9 9 8 9 5 ，线性关系显著，可以用于下面实验的工作曲线。 1 5 鲐钙柏如巧加b m 5 o rliii卸n)巡爱架# 2 6 o o 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 o o 1 6 0 0 言1 4 啪 三1 2 0 0 91 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 0 0 o 0 0 z o b e l l 5z o b e l l 4 培养基 z o b e l l 3z o b e l l 2 a a a b a z o b e i l lz o b e l l 2z o b e l l 3 z o b e l l 4 z o b e l l 5 培养基 曲线 a td i 行e r e n t o 0 0 2 d 1 o o 圆3 d 2 0 0 圆4 d 目5 d 3 0 0 目6 d 4 0 0 5 0 0 ，、 g 6 0 0 邑 7 0 09 8 0 0 9 0 0 1 0 o o 1 1 0 0 1 2 0 0 图2 - 9 海洋细菌1 7 0 1 发酵上清液的抑菌作用 f i g 2 9t h eb a c t e r i o s t a s i so ft h ef e r m e n m t i o ns u p e r n a t a n to fm a r i n es t r a i n17 01 注：d t 和d e 分别表示细菌1 7 0 1 发酵上清液对指示菌t y ( 3 ) 5 和e u ( 3 ) 2 5 的抑菌直径 1 6 jg暑暑v越蛏舞谛幂 福建农林人学硕士毕业论文 如图2 8 可见z o b e l l 4 中海洋细菌1 7 0 1 菌体生长最好，且利用底物最充分，而z o b e l l l 中菌体生 长相对较羞。从图2 - 9 可以看出z o b e l l 4 中细菌1 7 0 1 发酵上清液对指示菌的抑菌圈最小且与其他4 种培养基存在显著差异。其中z o b e l l 5 与z o l e l i i 培养基都是用蒸馏水配制，其上清液抑菌活性与 z o b e l l 3 ( 用陈海水配制) 没有显著差异，z o b e l l 5 的菌体生长要优于z o b e l l i ，因此最终确定用z o b e l l 5 作优化的起始培养基。具体配方见表2 - 2 。 2 4 6 碳源的筛选 6 o o 5 o o 4 0 0 3 0 0 o o 寸 8 2 0 0 1 0 0 o 0 0 1 0 0 o2 04 06 08 0l o o1 2 01 4 01 6 0 培养时间( h ) 8 0 0 7 0 0 6 0 0 5 0 0 4 0 0 3 o o 2 o o 1 0 0 ，_ 、 一 g 动 g v 型 袋 耀 婶 雅 图2 1 0 细菌1 7 0 1 菌体o d 6 0 0 值及基质中葡萄糖浓度随培养时间的变化曲线 f i g 2 1 0t h ec u r v eo f o d 6 o f m a r i n es t r a i n l7 0 1a n dg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni nm e d i u ma td i f f e r e n t i n c u b a t i o nt i m e 注：图中实线表示菌体o d 6 0 0 的变化曲线：虚线表示葡萄糖浓度变化曲线。 1 7 福建农林大学硕士毕业论文 g g 、i ( o 司 图2 1l 海洋细菌17 0 1 发酵上清液的抑菌作用 f i g 2 - l lt h eb a c t e d o s t a s i so ft h ef e r m e n t a t i o ns u p e r n a t a n to f m a r i n es t r a i n17 01 注：d t 和d e 分别表示细菌1 7 0 1 发酵上清液对指示菌t y ( 3 ) 5 和e u ( 3 ) 2 5 的抑菌直径。 如图2 1 0 以甘油作为碳源时细菌1 7 0 1 菌体生长最好，结合图2 1 l 可以看出以甘油作为碳源时 其上清对指示菌的抑菌能力最强，且与其他的碳存在显著差异。因此适合细菌1 7 0 1 菌体生长和产素 的碳源应该选用甘油。 1 8 珀甜鲥甜 囫囫圆目日言暑、qq 福建农林大学硕士毕业论文 2 4 7 氮源的筛选 01 22 43 64 86 07 28 4 9 6 1 0 81 2 0 培养时间( h ) 7 o o 6 5 0 6 0 0 5 5 0 5 0 0 4 5 0 4 0 0 3 5 0 3 瑚 2 5 0 2 o o 1 5 0 1 0 0 0 5 0 0 0 0 图2 - 1 2 细菌1 7 0 1 菌体o d 6 0 0 值及基质中甘油浓度随培养时间的变化曲线 f i g 2 1 2t h ec u r v eo f o d 6 0 0o f m a r i n es t r a i ni7 0 1a n dg l y c e r o lc o n c e n t r a t i o ni nm e d i u ma td i f f e r e n t i n c u b a t i o nt i m e 注：图中实线表示菌体o d 6 0 0 的变化曲线；虚线表示甘油浓度变化曲线。 g g 。 o 司 x lx 2x 3 x 4 x 5 氮源 囫2 d 物3 d 圆4 d 目5 d 暑 s - 乙 凸 司 图2 一1 3 海洋细菌1 7 0 1 发酵上清液的抑菌作用 f i g 2 - 13t h eb a c t e r i o s t a s i so ft h ef e r m e n t a t i o ns u p e r n a t a n to fm a f i n es t r a i nl7 01 注：a d r t f l l a d e 分别表示细菌1 7 0 1 发酵上清液对指示菌t y ( 3 ) 5 和e u ( 3 ) 2 5 的抑菌直径：x l = 啤酒酵母粉；x 2 - - ：夤羊 鱼蛋白胨：x 3 = 鲜牛骨蛋白胨：x 4 = 酵母提取物；x 5 = 酵母提取粉。 1 9 - “ 一，1基奄曼毯爱震扭 卯 如 卯 卯 如 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 i o n 8口oo 福建农林大学硕士毕业论文 如图2 1 2 和图2 1 3 ，其中以x 5 作为氮源菌体生长最佳，但相对应的发酵上清液的抑菌能力却 相对较弱。而以x 2 作为氮源菌体生长虽然相对较差，但其发酵上清液的抑菌能力却是最强，且与 其它氮源相比存在显著差异。因此以细菌1 7 0 1 发酵的有机氮源以x 2 ( 鲜鱼蛋白胨) 为佳。另外有 机氮源往往搭配使用，因此设计如下实验： 7 o o 6 0 0 5 0 0 4 0 0 o o 口 o q 3 0 0 2 0 0 1 o o 0 o o - x l o1 22 43 64 86 07 28 49 61 0 81 2 0 培养时间( h ) 一 g 动 蜊 避 震 虹 图2 1 4 海洋细菌1 7 0 1 菌体o d 6 0 0 值及基质中甘油浓度随培养时间的变化曲线 f i g 2 1 4t h ec u r v eo f o d 6 0 0o f m a r i n es t r a i n1 7 0 la n dg l y c e r o lc o n c e n t r a t i o ni nm e d i u ma td i f f e r e n t i n c u b a t i o nt i m e 注：图中实线表示菌体o d 6 0 0 的变化曲线：虚线表示甘油浓度变化曲线。 7 6 5 4 3 2 o 福建农林大学硕：l = 毕业论文 g 量 - ( o 司 图2 1 5 海洋细菌1 7 0 1 发酵上清液的抑菌作用 f i g 2 - 151 1 1 eb a c t e r i o s t a s i so f t h ef e r m e n t a t i o ns u p e m a t a n to fm a r i n es t r a i n17 01 注：d t 和d e 分别表示细菌1 7 0 1 发酵上清液对指示菌t y ( 3 ) 5 和e u ( 3 ) 2 5 的抑菌直径； x i = 啤酒酵母粉：x 2 = 鲜鱼蛋白胨；x 3 = 细菌学蛋白胨；x 4 = 啤酒酵母粉+ 酵母提取粉( 氮的物质的量比为3 ：1 ) ；x 5 = 鲜鱼蛋白胨+ 酵母提取粉( 氮的物质的量比为3 ：1 ) ：x 6 = 细菌学蛋白胨+ 酵母提取粉( 氮的物质的量比为3 ：1 ) 。 如图2 1 4 和图2 1 5 ，其中x 5 、x 6 的氮源组合菌体生长相对较好，但其对应的上清液对指示菌 的抑菌直径却并非最大。其中以x 2 作为氮源，菌体生长相对较差，但其上清液对指示菌的抑菌圈 却是最大，综合考虑菌体生长与产素水平，最终确定以x 2 ( 鲜鱼蛋白胨) 作为细菌1 7 0 1 发酵用的 有机氮源。对无机氮源的筛选如下： 2 l l-一 福建农林大学硕上毕业论文 8 0 0 7 o o 6 o o 5 0 0 o 84 0 0 o o 3 0 0 2 o o 1 0 0 o 0 0 o1 22 43 64 86 07 28 49 61 0 81 2 0 培养时间( 1 1 ) 9 0 0 8 0 0 7 0 0 6 0 0 皇 e u d g 5 m 面 忸 4 0 0 亲 土 3 0 0 2 0 0 1 0 0 图2 1 6 海洋细菌1 7 0 1 菌体o d 6 0 0 值及基质中甘油浓度随培养时间的变化曲线 f i g 2 16t h ec u r v eo fo d 6 0 0o f m a r i n es t r a i n17 0 1a n dg l y c e r o lc o n c e n t r a t i o ni nm e d i u ma td i f f e r e n t i n c u b a t i o nt i m e 注：图中实线表示菌体o d 6 0 0 的变化曲线；虚线表示甘油浓度变化曲线。 ，、 e e q 司 无机氮源 不加无机氮( n h 。) 2 c 2 0 , h 2 0k n 0 3n h 4 c i 无机氮源 n h , n 0 3 囫2 d 囫3 d 圆4 d 目5 d ，、 g g 、白 q q 图2 1 7 海洋细菌1 7 0 1 发酵上清液的抑菌作用 f i g 2 - 1 7t h eb a c t e r i o s t a s i so f t h ef e r m e n t a t i o ns u p e m a t a n to f m a f i n es t r a i n1 7 0 1 注：ad t 和d e 分别表示细菌1 7 0 1 发酵上清液对指示菌t y ( 3 ) 5 和e u ( 3 ) 2 5 的抑菌直径 2 2 福建农林大学硕士毕业论文 1 6 1 7 n h 如图2 一 和图2 可以看出有4 + 存在无机氮菌体生长相对较好，而且确加尢机氮源比没羽 加无机氮源其上清对指示菌的抑菌直径要大，且存在显著差异。但各无机氮源其上清液对指示菌的 抑制作用没有存在显著差异，而以n h 。c i 作为无机氮源其上清液对指示菌的抑菌直径均值一直是最 大，因此选用n h 4 c i 作为细菌1 7 0 1 发酵的无机氮源。 2 4 8 无机盐的筛选 培养时间( h ) 一、 j g 瓷 e 、- ， 刨 避 曩 = 图2 1 8 海洋细菌1 7 0 1 菌体o d 6 0 0 值及基质中甘油浓度随培养时间的变化曲线 f i g 2 18t h ec u r v eo fo d 6 0 0o f m a r i n es t r a i n 17 01a n dg l y c e r o lc o n c e n t r a t i o ni nm e d i u ma td i f f e r e n t i n c u b a t i o i lt i m e 注：图中实线表示菌体o d 6 0 0 的变化曲线；虚线表示甘油浓度变化曲线 2 3 舶 加 肿 肿 吼 & z & - 4 3 2 o o。口qo 福建农林大学硕士毕业论文 ，、 g 仨 、乞 。 司 无机盐 x lx 2x 3x 4x 5 x 6 无机盐 图2 1 9 海洋细菌17 0 1 发酵上清液的抑菌作用 f i g 2 19t h eb a c t e r i o s t a s i so ft h ef e r m e n t a t i o ns u p e r n a t a n to f m a r i n es t r a i n17 0 1 注：d t 和d e 分别表示细菌1 7 0 1 发酵上清液对指示菌t y ( 3 ) 5 和e u ( 3 ) 2 5 的抑菌直径 x i - - 不加无机盐；x 2 = m g s 0 4 7 h h 2 0 ；x 3 = f e s 0 4 4 h h 2 0 ；x 4 = c u s 0 4 5 h h z o ；x 5 = z n s 0 4 8 h h z o ；x 6 = c a c 0 3 如图2 1 8 可以明显看出在添加有无机盐硫酸镁的培养基中细菌1 7 0 1 菌体生长和利用底的能力 相对较好。从图2 1 9 细菌1 7 0 1 在添加有不同的无机盐的培养基中其上清液对指示菌的抑菌圈直径 没有显著差异，但从影响细菌1 7 0 1 菌体生长的角度最终还是选择m g s o + 7 h h 2 0 作为细菌1 7 0 1 发 酪培养基的无机盐。另外磷酸盐种类比较多，特别作了如下实验设计： 2 4 福建农林大学硕。i ：毕业论文 0 _ 一不加无机盐 。一k h 2 p q 8 0 0 7 o o 6 o o ，、 j g 5 0 0 竽 01 22 43 6 4 86 07 28 49 61 0 8 1 2 01 3 2 培养时间( h ) 1 0 0 图2 2 0 海洋细菌1 7 0 1 菌体o d 6 0 0 值及基质中甘油浓度随培养时间的变化曲线 f i g 2 2 0t h ec u r v eo fo d 6 0 0o f m a r i n es t r a i n17 0 1a n dg l y c e r o lc o n c e n t r a t i o ni nm e d i u ma td i f f e r e n t i n c u b a t i o nt i m e 注：图中实线表示菌体o d 6 0 0 的变化曲线；虚线表示甘油浓度变化曲线。 g g 凸 司 无机盐 x 1 x 2x 3x 4x 6 无机盐 囫2 d 囫3 d 隧溺4 d 目5 d g g 、- 乞 q 司 图2 2 l 海洋细菌1 7 0 1 发酵上清液的抑菌作用 f i g 2 2 1t h eb a c t e r i o s t a s i so ft h ef e r m e n t a t i o ns u p e m a t a n to f m a r i n es t r a i nl7 01 注：ad t 和ad e 分别表示细菌1 7 0 1 发酵上清液对指示菌t y ( 3 ) 5 和e u ( 3 ) 2 5 的抑菌直径； x i = 不加无机盐；x 2 = k h 2 p o , ；x 3 = n a h n a h 2 p 0 4 ；x 4 = k 2 h p 0 4 3 h h 2 0 ：x 5 = n a 2 h p 0 4 1 2 h h 2 0 ；x 6 2 k c i 2 5 避蛏景# 4 3 2 如 如 卯 卯 卯 卯 置 5 t 4 3 3 2 2 l o o 。qo 福建农林大学硕士毕业论文 从图2 2 0 可以明显看出添加有磷酸二氢盐的培养基明显不利于细菌1 7 0 1 的菌体生长，这可能 与h + 的浓度有关，因此根据各无机盐的使用浓度作了如下分析： 表2 3 培养基中加入各种离子的浓度及第2 4 h 对应的菌体o d 值 t a b l e2 3t h ei o nc o n c e n t r a t i o n so fm e d i u ma n dt h eo dv a l u e sa t2 4 h x lx 2x 3x 4x 5x 6 o d 6 2 2 0 50 6 2 0o 7182 4 6 3 2 2 3 22 4 3 8 a = k + ( m o l l ) 0 0 0 1 5 40o 0 3 0 800 0 1 5 4 b = n a + ( m o l l ) 0 0o ol5 400 0 3 0 80 c = h + ( m o l l ) 0 0 0 3 0 80 0 3 0 80 0 15 4 o 0 15 40 d = p 0 4 3 ( m o l l ) 0 0 0 1 5 40 0 1 5 40 0 1 5 40 0 1 5 40 e = - c 1 ( t o o l l ) 0 0000o 0 1 5 4 表2 - 4 逐步回归分析及显著性检验 t a b l e2 - 4s t e p w i s er e g r e s s i o na n a l y s i sa n dt e s to fs i g n i f i c a n c e m o d e l r rs q u a r e u n s t a n d a r d i z e dc o e f f i c i e n t st s i g bs t d e r r o 引入c 0 8 5 2 0 7 2 7 c o n s t a n t2 6 0 60 3 2 77 9 6 60 01 c5 3 6 5 31 6 4 5 23 2 6 10 0 3 l 再引入d 0 9 9 20 9 8 4c o n s t a n t2 3 2 2 0 0 9 92 3 4 8 50 0 0 0 c10 8 9 9 49 0 7 8一1 2 0 0 70 0 0 1 dl1 0 6 8 21 5 7 2 37 0 4 00 0 0 6 由表2 4 知，遂步回归方程第。一步引入t c = h + ，复相关系数r = 0 8 5 2 。第二步再向方程引入t d = p o 。孓，使复相关系数r 提高到0 9 9 2 ，系数的标准误差下降，显著性进一步提高。经过遂步回归后，引 入t c = h + 和d = p o 。3 。，而排除了其它离子对o d 值的影响。h + 的系数项为负，说明对菌体o d 值为负 贡献即对菌体生长不利。p 0 4 3 - 的系数项为正，说明对菌体o d 值为正贡献，对菌体生长有利。进一步 对该遂步回归作方差分析如表2 5 。 表2 5 逐步回归方程的方差分析 t a b l e2 - 5t h ea n o v ao fs t e p w i s er e g r e s s i o ne q u a t i o n m o d e lssdfm s f s i g 引入c r e g r e s s i o n 2 7 3 1l2 7 3 l1 0 6 3 5 o 0 3 l r e s i d u a l1 0 2 742 5 7 t o t a l 3 7 5 85 再引入d r e g r e s s i o n 3 6 9 921 8 59 4 6 4 6 0 0 2 r e s i d u a l 0 0 5 9 30 0 2 t o t a l3 7 5 85 由表2 5 知，该遂步同归方程达到显著水水平( p = 0 0 2 0 0 5 ) 。遂步回归方程在引入c 的基础 上再引入d 显著性进一步提高。所以上面的结论是可信的。上面分析都在统计软件s p s s l 3 0 中进 行。 由于使用磷酸二氢盐初期对菌体生长不利，尽管最终的抑菌直径都较大，但没有达到显著水平。 另外遂步回归分析认为磷酸根对菌体积累有利，而且钾离子对菌体积累和产素水平没有影响，因此 不再引入钾离子以免给日后的分离纯化带来不必要的麻烦。综合上述考虑把磷酸氢二钠作为p b 设 计的一个网子考虑。由于h + 浓度的直观反映足培养基质的p h 值，因此作了如下实验： 2 6 塑堡奎签奎堂婴生望些笙塞 一 一一一 2 4 9 培养基质p h 对细菌1 7 0 1 产素的影响 培养时问 图2 - 2 2 海洋细菌1 7 0 1 菌体o d 6 0 0 值及基质中甘油浓度随培养时间的变化曲线 f i g 2 2 2t h e c u r v eo f o d 6 0 0o f m a r i n es t r a i n1 7 0 1a n dg l y c e r o lc o n c e n t r a t i o ni nm e d i u m a td i f i e r e n t i n c u b a t i o nt i m e 注：图中实线表示菌体o d 6 0 0 的变化曲线；虚线表示甘油浓度变化曲线 1 0 o o 9 6 0 9 2 0 8 8 0 8 4 0 8 0 0 趔7 6 0 毛7 2 0 6 8 0 6 4 0 6 0 0 5 6 0 5 2 0 01 22 43 6 4 86 0 7 28 49 61 0 81 2 0 培养时间( h ) 图2 2 3 培养基质中p h 值随时间的变化曲线 f i g 2 2 3t h ec u r v eo fp hv a l u ei nm e d i u m a td i f f e r e n tt i m e s 2 7 (1)趑避曩# 舶 舯 罨； 舯 引 酣 副 小 土 z l n 。口qo 福建农林大学硕士毕业论文 _ 、 g 邑 h 凸 司 p h 5 6p h 6 4p h 7 2p h 8 0p h 8 8p h 9 6 初始p h 图2 2 4 海洋细菌1 7 0 1 发酵上清液的抑菌作用 f i g 2 - 2 4t h eb a c t e r i o s t a s i so f t h ef e r m e n t a t i o ns u p e m a t a n to f m a r i n es t r a i n17 0 1 注：ad t 和d e 分别表示细菌1 7 0 1 发酵上清液对指示菌t y ( 3 ) 5 和e u ( 3 ) 2 5 的抑菌直径 如图2 2 2 ，可以明显看出细菌1 7 0 1 在酸性条件下菌体生长较差，而碱性条件下生长较好，在初 始p h 8 8 时菌体长最好。另从图2 2 3 可以看出培养基质中p h 值随着培养时间都有趋向中性的趋势。 从图2 2 4 看出控制初始p h 在8 0 对指示菌e u ( 3 ) 2 5 抑菌直径最大，而控制初始p h 在8 8 时对指示 菌t y ( 3 ) 5 的抑菌直径最人，但两者没有达到显著水平。如果考虑日后工业控制的工艺难易则显然控 制初始p h 值在8 0 更为方便。因此选择初始p h 8 0 作为下p b 设计的因子初始值。如果进一步考虑 不同时间段对培养基质p h 进行调控，作了如下实验设计： 2 8 一一 福建农林大学硕士毕业论文 1 0 0 0 9 o o 8 o o 7 o o 6 o o 5 0 0 4