（生物化学与分子生物学专业论文）鸡a干扰素成熟蛋白基因的表达.pdf

摘要 干扰素( i n t e r f e r o n ，简称i f n ) 是一种具有抗病毒、调节免疫、抑制细胞分裂和促进细胞凋亡等 多种生物学活性的细胞因子。信号肽是指在新合成的多肽链中指导蛋白质跨膜运输的氨基酸残 基，其长度绝大多数是2 0 3 0 个氨基酸残基，以含疏水氨基酸为主，位于n ”端。信号肽对蛋白 质的定位有着非常重要的作用，尤其是适当改造信号肽结构可以提高外源蛋白的分泌效率。多数 外源基因在大肠杆菌宿主中过量表达时，常常导致表达产物在胞内形成不溶性的聚集体，即形成 包涵体。包涵体表达具有表达量大的优点，但其中的重组蛋白缺乏生物学活性，需要进行变性和 复性才能恢复其活性。因此，改造包涵体重组表达质粒，向其中加入段l 天( 门) 冬酰胺酶i i ( a s p ) 信号肽，用以提高外源蛋白的分泌效率，这种方法对真核分泌蛋白尤为有效。 本研究设计一对特异性引物，从鸡肝脏中扩增出编码n 干扰素的成熟蛋白基因( c h i f n - 俚) ； 将扩增得到的鸡a 干扰素的成熟蛋白基因与原核表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 融合，构建成原核重组表达 质粒p e t - 2 8 a c h l f n 仅，并对其诱导表达，考察编码鸡u 干扰素的成熟蛋白基因的表达效果；在 此工作的基础上，通过设计一对特异性引物，从大肠杆菌中扩增出编码a s p 信号肽的基因片段， 将a s p 信号肽基因插入到p e t - 2 8 a c h l f n - a 质粒中构建成分泌型原核重组表达质粒p e t - 2 8 a c h l f n a s p ，并对其进行诱导表达，考察a s p 信号肽在重组表达质粒中的分泌表达作用和编码 鸡a 干扰素的成熟蛋白基因的表达效果。 研究结果表明，已构建的两种原核重组表达质粒均能表达鸡伍干扰素成熟蛋白。其中，原核 重组质粒p e t - 2 8 a c h i f n - a 的表达方式为包涵体型，蛋白表达最为2 7 ；重组质粒p e t - 2 8 a c h l f n a a s p 的表达方式为分泌型，蛋白表达量为3 8 。通过对这两种重组质粒的表达效果比较 得出，原核重组质粒p e t - 2 8 a c h l f n - a - a s p 对外源基因进行分泌型诱导表达，不形成包涵体，从 而简化了变性、复性过程，为筛选出鸡o t 干扰素成熟蛋白的高效表达菌株奠定了基础。 关键词：鸡i f n 吨，表达蛋白， 包涵体型，分泌型 ab s t r a c t i n t e r f e r o n ( i n t e r f e r o n , a si f n ) i sak i n do fa n t i v i r u s ，t h er e g u l a t i o no ft h ei m m u n e ，i n h i b i t i n gc e l l d i v i s i o na n dt h ep r o m o t i o no fa p o p t o s i s ，a n do t h e rb i o l o g i c a la c t i v i t yo fc y t o k i n e s s i g n a lp e p t i d e m e a n st h a tt h en e ws y n t h e t i cp e p t i d ec h a i ng u i d et r a n s m e m b r a n ep r o t e i nt r a n s p o r to fa m i n oa c i d s ，t h e v a s tm a j o r i t yo fi t sl e n g t hi s2 0t o3 0a m i n oa c i d s , c o n t a i n i n gm a i n l yh y d r o p h o b i ca m i n oa c i d ss i t e si n nt e r m i n a l s i g n a lp e p t i d et a r g e t i n gt h ep r o t e i nh a sav e r yi m p o r t a n tr o l e ，e s p e c i a l l ya p p r o p r i a t e r e c o n s t r u c t ss i g n a lp e p t i d es t r u c t u r eo ft h ep r o t e i nc a l li n c r e a s et h ee x p r e s s i n gp r o d u c t i o ne f f i c i e n c y m o s to ff o r e i g ng e n e si ne c o l ii ne x c e s so ft h eh o s t , o f t e nl e a d i n gt ot h ee x p r e s s i o no fi n t r a c e l l u l a r f o r m a t i o no fi n s o l u b l ea g g r e g a t e s ，i n c l u s i o nb o d i e sf o r m e d t h ea m o u n to fi n c l u s i o np r o t e i ni sh u g e ， b u tt h el a c ko fr e c o m b i n a n tp r o t e i nb i o l o g i c a la c t i v i t y ，t h en e e df o rr e h a b i l i t a t i o no fv a r i a b i l i t ya n dt o r e s t o r ei t sa c t i v i t y t h e r e f o r e ，r e c o n s t r u c t t i n gt h ei n c l u s i o no fr e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i d ，t ob e a d d e dt oas e c t i o no fl - a s p a r a g i n a s e ( r e f e r r e dt oa s p ) s i g n a lp e p t i d e ，t oi n c r e a s et h ee f f i c i e n c yo ft h e p r o d u c t i o ns o u r c eo fp r o t e i n , t h i sm e t h o di sp a r t i c u l a r l ye u k a r y o t i cc e l lp r o t e i ns e c r e t e de f f e c t i v e i nt h i ss t u d yd e s i g n sap a i ro fs p e c i f i cp r i m e r s ，f r o mc h i c k e nl i v e rw a sa m p l i f i e di nt h ec o d i n go ft h e m a t u r ep r o t e i ni n t e r f e r o n - ag e n e ( c h l f n - a ) ；w i l lb ea m p l i f i e db yt h ec h i c k e ni n t e r f e r o nat h em a t u r i t y o ft h eo r i g i n a lg e n ea n de x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 a ( + ) i n t e g r a t e di n t oc o n s t r u c t i o no fp r o k a r y o t i c r e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dp e t 一2 8 a c h l f n 一伍a n dt h e i ri n d u c t i o nt oi n s p e c tc h i c k e nne n c o d i n g t h em a t u r ep r o t e i ni n t e r f e r o ng e n ee x p r e s s i o nr e s u l t si nt h i sw o r k ；b a s e do nt h e s ew o r k s ，b yd e s i g n i n ga p a i ro fs p e c i f i cp r i m e r s ，f r o me c o i la m p l i f i e dc o d i n ga s ps i g n a lp e p t i d eg e n ef r a g m e n t , t h ea s p s i g n a lp e p t i d eg e n ew i l lb ei n s e r t e di n t ot h ep e t - 2 8 a c h l f n - ap l a s m i dt o s e c r e tt h ec o n s t r u c t i o no f p r o k a r y o t i cr e o r g a n i z a t i o ne x p r e s s i o np l a s m i dp e t - 2 8 a c h l f n 吨a s p ，a n di n d u c i n gi tf o re x p r e s s i o n , i n s p e c t e da s ps i g n a lp e p t i d ef u n c t i o ni nr e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i da n dt h ec o d eo fc h i c k e n sa m a t u r eg e n ee x p r e s s i o nr e s u l t si nt h es e c r e t i o no fi n t e r f e r o n t h er e s u l t ss h o wt h a tc o n s t r u c t e dt w op r o k a r y o t i cr e o r g a n i z a t i o ne x p r e s s i o nv e c t o r sc a nb ee x p r e s s e d c h i c k e ni n t e r f e r o n - am a t u r ep r o t e i n t h ep r o k a r y o t i cr e c o m b i n a n tp e t - 2 8 a ，c h i f n 伍e x p r e s s i o nf o r t h ei n c l u s i o no fp r o t e i ne x p r e s s i o na n dt h ee x p r e s s i o nc o n t e n ti s2 7 ：t h er e c o m b i n a n tp e t 2 8 a c h i f n - a a s pm e a n so fe x p r e s s i o nf o rt h es e c r e t e dp r o t e i ne x p r e s s i o na n dt h ee x p r e s s i o nc o n t e n ti s3 8 b yc o m p a r i n gt h e s et w or e c o m b i n a n te x p r e s s i o n s , i tc a l lb e 鸵et h a tt h ep r o k a r y o t i cr e c o m b i n a n t p e t - 2 8 a | c h l f n - a - a s ps e c r e t e de x p r e s st h ef o r e i g ng e n e 。w h i c hd i dn o tf o r mi n c l u s i o nb o d i e s , t h u s s i m p l i f y i n gt h ed e g e n e r a t i o np r o c e s so fr e h a b i l i t a t i o n , f o rs e l e c t e dc h i c k e ni n t e r f e r o nam a t u r ep r o t e i n h i g h l ye x p r e s s e db a c t e r i u ms e r i n gi naf o u n d a t i o n k e yw o r d s ：c h i c k e n si f n a ，e x p r e s s i n gp r o t e i n ，i n c l u s i o ne x p r e s s i o n ，s e c r e te x p r e s s i o n 英文缩写 a m p b p b s a d n t p e d t a i p t g k b l m i n m l r p m 此 l x m o i l o d o r f p a g e p c r s d s t e m e d x g a l 英文全称 中英文缩略词表 a m p i c i l i n b a s ep a i r b o v i n es e r u l na l b u m i n d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d i s o p r o p y l t h i o 一肛d - g a l a c t o s i d e k i l o b a s ep a i r s l i t e r m i n u t e m i l l i l i t e r r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e m i c r o l i t e r m i c r o m o l e l i t e r o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p o l y m e m s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e n ，n ，n ，n - t e r a m e t h y le t h y l e n ed i a m i n e 5 - b r o m a - 4 c h l o r o - 3 一i n d o l y - a - d - g a l ac t o s i d e 中文名称 氨苄青霉素 碱基对 牛血清白蛋白 脱氧核糖核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 异丙基硫代- p 阻半乳糖苷 千碱基对 升 分钟 毫升 转分 微升 微摩尔升 光密度 开放阅读框 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 十二烷基磺酸钠 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 5 溴- 4 氯3 吲哚a - d 半乳糖苷 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 研究生签名：奎确 时间： 加g 年6 月( 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位 论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：套历 时间：硇g 年6 月f 日 导师签名： 耋钕 时间：z 西9 年厂月日 宁夏大学硕十学位论文笫一牵引育 第一章引言 1 干扰素概述 干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质( 主要是糖蛋白) ，是一种e l j 单核细胞和淋巴细胞 产生的细胞因子。它们在同种细胞上，具有广谱的抗病毒、影响细胞生长和分化、调节免疫功能 等多种生物活性。干扰素的分类，根据干扰索蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其 分为：i r n - a 、i f n p 、i f n 吖。 i f n - 属于i f n ( i t 家族，其结构和大小与其它i f n - a 稍有差异， 但抗原性有较大的不同。现在公认i f n p 和i f n - t 只有一个亚型，而i f n a 有约二十余个亚型。 1 1 干扰素的发现 本世纪初许多病毒学家在研究两种病毒感染同一宿主细胞时发现，普遍存在两种病毒相互拮 抗的现象，从此导出了病毒间干扰( i n t e r f e r e n c e ) 现象的概念。许多学者食图寻找这种引起干扰 现象的活性物质，一直没有成功。直至19 5 7 年，i s a a c s 和l i n d e n m a n n 在研究流感病毒时，先把流 感病毒加温灭活，然后与鸡胚绒毛尿囊膜块一起培养，将没有吸附到细胞的灭活病毒彻底洗去， 在3 7 条件下几小时之后去掉膜块，另外加入新鲜的鸡胚绒毛尿囊膜块，3 7 培养过夜后用活 病毒进行攻击，结果发现流感病毒的繁殖明显地被抑制了。这清楚地说明，灭活的流感病毒作用 于细胞后，细胞产生了一种可溶性物质干扰了病毒的繁殖。当时，他们把这种物质称之为i f n ， 也就是我们现在所称的i f n - a 。1 9 6 5 年，w h e c l o c k 报道了用p h a 刺激人白细胞时产生一种对酸不 稳定的i f n 丫，又名免疫i f n 。与a 、p 型i f n 类似，i f n 丫也具有抑制病毒复制、抑制细胞分裂以 及免疫调节作用，且其抑制细胞分裂以及免疫调节活性比i f n a 、p 高约1 0 0 倍；对某些病毒( 如 痘苗病毒) 的抑制活性比i f n a 、b 高。在临床上可用来治疗某些病毒性疾病、免疫系统疾病( 免 疫功能低下、免疫缺陷) 等等，尤其对肿瘤性疾病的治疗更加令人瞩卧。1 9 8 0 年国际干扰素命 名委员会正式将干扰素定义为一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又 受基因的调节与控制。即干扰素是一类能诱导人及动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的类激素蛋 白，具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等生物学活性。 1 2 干扰素的基本特性和分类 干扰素( i n t e r f e r o n ，简称i f n ) 是种抗病毒、抑制细胞分裂、调节免疫和促进细胞凋亡等多 种生物学活性的细胞因子。干扰素是一种糖蛋白，分子量2 0 - - 1 0 0 k d ；不能通过普通透析膜，可 通过滤菌器，干扰素比病毒粒小，沉淀病毒的离心力不能沉降干扰素；干扰素在热稳定方面，一 般5 6 可3 0 分钟不被灭活，- - 2 0 可长期保存；在p h 稳定性方面，i 型干扰素耐酸，在p h = 2 0 1 0 0 中很稳定，i i 型干扰素对p h 2 0 不稳定，在5 6 下3 0 分钟被破坏；干扰素一般由1 5 0 1 6 0 个氨基酸组成，含1 7 种以上的氨基酸，其中的天冬氨酸，谷氨酸和亮氨酸含量较高，不含核酸， 所以不被d n a 酶或r n a 酶破坏，但易被胰蛋白酶、乙醚、氯仿、酮基等破坏；干扰素具有广谱 性，即干扰素作用于机体有机组织细胞后，可使获得抗多种病毒和微生物的能力，但干扰素仅作 宁夏大学硕。 = 学位论文第一章弓i 言 用于异常细胞，对正常细胞的作用很小，也就是说，干扰素对于个体细胞具有，眦格的选择性，而 且，具有相对的种属特异性，既由某一种生物细胞产生的十扰素只作用于同种牛物细胞，使其获 得保护力对他种生物细胞则无作用，因而其应用受到限制。 干扰素是第一个被发现的介导天然免疫的细胞凶子，因其具有干扰病毒感染和复制的能力而 被称为干扰素( i n t e r f e r o n ，简称i f n ) 。目前，根据产生干扰素的动物种类、细胞来源不同、抗原 特性和分子结构的差异，分为i 型干扰素和i i 型干扰素两类。在特定的型内，有氨基酸序列或组 成差异时又可分为亚型。i 型干扰素分为a 、p 、5 、t 和、i ，五型，各型结构类似，均为无内含子的 单拷贝或多拷贝基因；i i 型干扰素迄今为止只发现廿干扰素( i f n 吖) 一种【2 l ，在基因组中以3 个 内含子、4 个外显子的单拷贝形式存在。i f n a 存在多种结构序列不同的亚型，分别命名为a l 、吨、 0 l 3 等，目前已经鉴定的i f n a 亚型至少有2 3 种之多。由病毒、微生物及其产物诱导产生的l 型i f n 主要参与抗病毒、抗肿瘤活性，如诱导合成抗病毒蛋白；1 由淋巴细胞受有丝分裂原或特异抗原刺 激产生的i i 型i f n 主要参与诱导m h c 类抗原的表达和免疫调节效应，但其抗病毒作用比i 型i f n 弱【3 】a 1 3 干扰素的分子结构 人和动物干扰素都是一种分泌性蛋白，即细胞合成出干扰素后，就分泌到细胞外。它的基因 结构与其他分泌性蛋白的基因是相类似的，即由5 端非编码区、分泌信号肽编码区、干扰素多肽 编码区和3 端非编码区组成。信号肽能够引导i f n a 通过细胞膜而分泌到细胞外，然后信号肽通 过蛋白分解，保留成熟的i f n 蛋i 兰t 1 4 1 。 白细胞i f n a 的各亚型均含1 6 5 1 6 6 个氨基酸残基，结构相似；i f np 含1 6 6 个氨基酸残基；i f n 含1 7 2 1 7 4 个氨基酸残基。不同类型i f n 分子具有不同程度的氨基酸同源性( ( i f n a 与i f np 分子同 源性为2 8 ，与i f n t , o 分子同源性高达6 0 ) 。人的i f n a 与i f nb 的结构基因均定位于第9 对染色体 的短臂上，而且都不含有内含子，即其基因编码是连续的。i f n 丫基因定位于第1 2 号染色体上， 共含有3 个内含子。目前已鉴定出的l f n a 非等位基因至少有1 5 个，而i f np 和i f n 丫均由单基因 编码。哺乳动物i f n 丫基因的4 个外显子编码数目相近的氨基酸。第一个外显子包含5 u t r ，1 9 个氨基酸的信号序列和2 2 个氨基酸的成熟蛋白质。外显子2 4 分别编码2 3 ，6 0 ，4 0 个氨基酸，外 显子4 也编码终止子与y u t r ，外显子2 与4 的氨基酸序列具有高度保守性，分别为5 6 5 与 4 2 5 。三个内含子准确插入两个密码子之间的开放阅读框。内含子都具有保守性序列，包括5 g t 与3 a g 。尽管氨基酸序列存在差异，但i 型i f n 具有相似的三维结构，都由紧密排列的c t 螺旋结构 域构成，并表现出相似的生理、生化特征，如对p h 的稳定性和对同类细胞表面受体的识别。i f n 丫 是一同型二聚体，每一个原体细胞中含有与i f np 排列相似的螺旋区，它的细胞表面结合受体也 不同于i 型i f n ! 引。 1 3 1 干扰素基因与其编码的氨基酸数目 不同型别的干扰素基因所编码的氨基酸数目是不同的：h u l f n 一似人干扰素) 基因编码1 6 5 1 6 6 个氨基酸，h u l f n - p 基因编码1 6 6 个，h u l f n - 丫基因编码1 4 3 个；m u l f n - a ( d x 鼠：1 ：扰素) 基因编 2 ，j 。夏大学硕仁学位论文第一章弓f 言 码1 6 6 1 6 7 个，m u l f n p 基凶编码1 6 1 个，m u l f n 7 基凶编码1 3 6 个；r a t l f n 嘶大鼠干扰素) 基 凶编码1 6 2 个；b o v l f n p ( 牛干扰素) 基因编码1 6 5 个，b o v l f n 1 ，为1 4 6 个；p o l i f n a l ( 猪a l 型 干扰素) 基因编码1 8 9 个氨基酸。c a l f n a ( 犬干扰索) 基因编码1 6 6 1 7 2 个氨基酸。c h l f n ( 鸡干 扰素) 基因编码1 9 3 个氨基酸，包括前端的3 1 个氨基酸为信号肽。本研究的c h l f n a 基因编码1 6 2 个为成熟氨基酸蛋白。 1 3 2n 端糖基化位点对干扰素活性的影响 在h u l f n a 的a ，b ，c ，d ，e ，g ，k 及l 等亚型中没有n 糖基化位点x t s ) ，但是，h u l f n a h 有两个糖分子结合位点。m u l f n al 在7 8 8 0 位有n 糖基化位点。而在m u l f n o a 中则无。r a t l f n a i 的1 6 7 1 6 9 位也有n x ，t s 位点。h u l f n p 中有3 个n 糖基化位点。b o v l f n p 的第l l o 和1 5 3 位 也有n 糖基化位点。h u l f n 丫中有两个强的n 糖基化位点。m u l f n - 7 中第1 9 位和7 l 位也有两个n 糖基化位点。本研究中的c h i f n 仅有4 个n 糖基化位点。关于干扰素的糖基化作用，目前尚不清 楚，由大肠杆菌产生的r i f n 丫，无糖基化却具有完全的抗病毒活性【6 l 。 1 3 - 3 半胱氨酸( c y s ) 的位置对干扰素活性的影响 半胱氨酸的位置在不同干扰素分子中也不一样，h u l f n a 含有4 个分别处在1 ，2 9 ，9 9 和1 3 9 位，并且在1 9 9 ，2 9 1 3 9 之间形成二硫键，其中2 9 1 3 9 之间的二硫键对于干扰素的生物活性更 为重要，但是h u l f n - a d a1 的第8 6 位多一个c y s 巯基游离。p o l f n 畎猪干扰素) 同样存在以上两 种情况。陈涛【7 】等报道，在含8 6 位c y s 情况下大肠杆菌中表达猪i f n a ，产物活性较低；将第8 6 位半胱氨酸变成中性氨基酸，生物学活性有明显提高。h u l f n o r b 中第3 个c y s 位于9 8 位。m u l f n - a 中有5 个c y s ，位置与h u l f n - a d 完全一样。r a t l f n - al 中5 个c y s 的位置也与h u i f n - a d 一样。 h u l f n - 3 分子中有3 个c y s 一样，分别位于1 7 ，3 l 和1 4 1 。在3 1 1 4 1 形成的二硫键相当于h u i f n a 的2 9 1 3 9 之间形成的二硫键，它对干扰素活性的发挥十分重要，在1 7 位的c y s 改成s e r 后，对活 性没有影响，并可使分子稳定。m u i f n p 中只有一个c y s ，在1 7 位。b o v i f n p 中c y s 的位置与 h u i f n p 相同。h u i f n 吖分子中无c y s 。m u i f n - 1 , 有3 个c y s ，位于l ，3 ，1 3 6 ，而b o v i f n 丫则无 c y s 。本研究中的c h i f n a 有6 个c y s 。 1 4 干扰素作用特点 作为机体最重要的细胞因子之一，干扰素主要生物学功能体现为广谱的抗病毒活性和免疫调 节功能，其作用特点可概括为i s - g i ： ( 1 ) 干扰素属诱生蛋白，正常细胞一般不自发产生干扰素，在受诱生剂( 包括病毒、细菌和某 些化学合成物质) 激发后，干扰素基因去抑制而表达。 ( 2 ) 干扰素系统是目前所知的发挥作用最快的第一病毒防御体系，可在很短时间( 几分钟内) 使 机体处于抗病毒状态，并且机体在1 - 3 周时间内对病毒的重复感染有抵抗作用。 ( 3 ) 干扰素的抗病毒效应是通过与靶细胞受体结合，诱导抗病毒蛋f l ( a v p ) 而问接发挥作用， 3 0 。夏大学顶十学岱= 论文第一章弓f 言 曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼蔓舅曼量l i l m ,_ 一i i 一_ 一h 量童 对病毒起抑制作用而非杀灭。 ( 4 ) 干扰素具有种属特异性，某一种属动物( 或组织细胞) 产生的i f n 只能对同种属或种属非常 接近的动物或细胞有保护力，e p i f n 活力在同种细胞上高，在异种细胞上低【1 0 1 。并且不同病毒、 不同细胞对干扰素敏感性不同。 ( 5 ) i 型和i i 型干扰素发挥不同效应，不能相互替代。 1 5 干扰素生物学活性 干扰素在1 9 5 7 年被发现时，抗病毒活性被认为是其唯一特性，但随后研究发现干扰素除具 有抗病毒增殖作用外，还有一系列其他生物学活性，如抗肿瘤、免疫调节作用等。大量研究表明， 干扰素的生物学活性的发挥有赖于其诱导的多种效应蛋白质的合成【1 1 1 。干扰素活性很高，并且其 活性呈明显的多样性。 1 5 1 抗病毒活性 干扰素本身并非直接抗病毒物质。病毒感染首先导致干扰素的产生，同时病毒感染细胞导致 被感染细胞的死亡、崩解，干扰素也随之释放。干扰素分子向附近扩散，并随血液循环至全身。 干扰素与周围细胞膜上的受体结合，起着第一信号的作用，活化细胞膜腺苷酸环化酶，促使c a m p 的形成。c a m p 作为第二信使，从而激活细胞内抗病毒作用机制，产生一组抗病毒蛋白( a n t i v i r a l p r o t e i n ，a v p ) 。 l 型和l l 型干扰素基因均可经诱导剂激活而表达，表达产物通过特定信号转导通路，激活干扰 素诱导基因的转录，机体合成多种具阻断病毒复制功能的抗病毒酶和蛋白质，抵抗病毒对机体细 胞的感染l i2 。 i 型干扰素的抗病毒作用最强，主要是通过旁分泌作用。在这种情况下，病毒感染的细胞分 泌干扰素保护邻近细胞不再受感染，即干扰素使邻近细胞处于抗病毒状态，而i f n - t 的抗病毒作 用有种属特异性【l 习。一般来说，作用于同一种属的细胞时活性最强，其种属屏障比i f n 吨、i f n p 严格。i f n - 丫能够诱导病毒感染的细胞表达病毒抗原，增加免疫系统识别和杀伤感染细胞的能力 i f n - t 还能通过其它未知的途径抗病毒繁殖【 4 - 1 5 1 。 1 5 2 抗肿瘤活性 i f n 通过各种机理产生抗肿瘤效应，包括对肿瘤的直接抗增殖效应。可能有以下机制l l o l ： ( 1 ) 有些肿瘤的发生与病毒有关，这些病毒的核酸往往需要整合到细胞的d n a 中去，形成病 毒基因，这些基因持续存在是肿瘤的发生原因之一。抑制病毒繁殖，从而抑制肿瘤的发生与成长。 ( 2 ) 抑制肿瘤细胞分裂，i f n 作用于细胞膜，刺激腺营酸环化酶，使c a m p 增加，抑制d n a 的合成及细胞分裂，故有抗肿瘤作用。 ( 3 ) 调动机体免疫系统，提高机体抗肿瘤免疫力。i f n 能增强巨噬细胞及n k 细胞的杀伤性， 增加细胞表面抗原和受体的表达，抑制b 细胞的功能，从而降低肿瘤细胞表面封闭抗体的水平。 4 宁疆大学硕十学位论文第一章引言 抗肿瘤作用以i f n - t 为最强。i f n p 和i f n 1 ，可以使肿瘤细胞直接融解。可是，对于引起直接 溶解的能力，i f n 丫比i f n p 具有更强的活性。只是在干扰素浓度相对较高和细胞内浓度较低的时 候才能观察到各个干扰素的细胞溶解作用。然而，i f n 丫和i f n 0 【或i f n p 的联合具有明显的细胞溶 解作用，即使此时干扰素浓度较低【1 6 】。i f n y 对迅速分裂的肿瘤细胞有选择性的抑制作用，从而 抑制肿瘤的发生与成长；能改变瘤细胞表面的性能，诱发新的抗原，从而易被免疫监视细胞识别， 并加以排斥；还可以调动机体免疫系统，提高机体抗肿瘤免疫力【1 7 1 。i f n 1 ，对癌基因转化的细胞 的生长和癌基凶的表达均有抑制作用。i f n 丫的抗肿瘤作用是多方面的，包括多方面抑制肿瘤细 胞生长和诱导多方面抗肿瘤的免疫应答。 1 5 3 免疫调节活性 干扰素具有很强的免疫调节作用，它可以调节t 、b 淋巴细胞的功能，小剂量起促进作用， 大剂量起抑制作用。l 型干扰素可增强m h ci 类分子表达，而强烈抑制m h ci i 类分子表达；i i 型干 扰素可促进m h ci i 类分子表达，两类干扰素的协同调节作用，使机体处于最佳免疫应答状态。 i f n 吖能显著增加a p c 表达m h ci i 类抗原的数量，增强a p c 与t 细胞的相互作用，增加辅 助t 细胞( t - h e l p e rc e l l ，t h ) 的数量和增强迟发型超敏反应( d e l a y e dt y p eh y p e r s e n s i t y ，d t h ) ， 进而增强t 细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒t 细胞产生的能力【限1 9 1 。i f n y 可增加单核细胞和 巨噬细胞表面x g gf c 受体数，参与调节免疫复合物的清除、吞噬作用和抗体依赖细胞介导的细 胞毒( a n t i b o d y d e p e n d e n tc e l l m e d i a t e dc y t o t o x i c i t y ，a d c c ) 作用。此外i f n - 丫的有着广泛的免疫 调节作用，包括对抗原提呈细胞( a n t i g e n - p r e s e n t i n gc e l l ，a p c ) 、巨噬细胞、n k 细胞、b 细胞 的膜分子表达、活化和分化的影响，比i 型干扰素强数百倍；它的生成可促进t h 0 细胞向t h l 分化， 而抑制t h 2 的生成，由于t h l 和t h 2 分别介导机体细胞免疫和体液免疫，因此i 附丫可根据不同病 原感染，与其它细胞因子( 如i l 4 等) 共同作用，对机体进行免疫干预，实现免疫系统防御功能。i 型和l i 型干扰素均可刺激n k 细胞( 自然杀伤细胞) 并增强其杀伤功能，有利于机体清除病毒感染； 此外i f n 吖是主要的巨噬细胞活化因子m a f ( m a c r o p h a g e a c t i v a t i n gf a c t o r ) ，促进巨噬细胞吞噬能力 和炎症反应，并可直接促进t 、b 细胞分化和c t l 成熟，刺激b 细胞分泌抗体，从而增强机体免疫 机制捌。 1 5 4 其他活性 ( 1 ) 抑制细胞生长。i f n 能抑制细胞生长，这种活性参与其对癌症和感染的抑制作用，i f n 对培养细胞表现出的抗增生作用对不同的细胞系差异很大，目前还未能鉴定出由i f n 诱导产生 的，直接参与抗增殖活性的基因产物，但i f n - a 能针对细胞周期的控制体中的特异因子发生作用， 包括c m y c ，p r b ，d 3 和c d c 2 5 a 蛋白，来抑制细胞的增殖。 ( 2 ) 控制细胞凋亡。i f n 在细胞对病毒或其他病源微生物的反应起关键作用，还包括控制细胞 的死亡这一最终层次上，i f n 具有抑制或促进细胞凋亡的双重活性，发挥哪种活性取决于细胞的 分化状态等因素，例如i f n - 丫便因血清存在与否和i f n 吖受体水平高低对人t 细胞有促进增殖或促 进死亡作用【2 。 5 - 宁夏大学硕十学位论文第一章引言 2 禽类干扰素研究进展 禽类十扰素是2 0 世纪5 0 年代最早观察到的细胞因子，在推动人和动物干扰素的研究进程中 起到了关键作用。迄今为止，已有多种禽类干扰素基凶被克隆、表达。尤其近年来，鸡基因工程 重组干扰素的抗病毒效果以及机体干扰素丰度叮作为细胞免疫应答指标等研究尤为引人注目1 2 2 】。 我国“8 6 3 ”、“十五”攻关项目也资助了畜禽基因工程莺组干扰素及其产业化研究。为了推进禽类干 扰素的研究与应用，下文综述了禽类基因工程重组十扰素的研究进展。 2 1i 型干扰素 1 9 9 4 年，s e k e l l i c k 等人通过比较已知哺乳动物a 、p 氨基酸序列选择保守区域并设计引物，从 病毒诱导的鸡胚中，首次成功克隆和表达了鸡i f n a ( c h l f n n ) 基因，并进行了结构分析。s i c k 等 ( 1 9 9 6 ) 也将鸡体内至少存在的两种不同血清型的l 型十扰素分别命名为c h l f n1 和c h l f n 2 并广泛 开展了c h l f n a 生物学功能的研究。1 9 9 5 年，s c h u l t z 等克隆了鸭l 型干扰素基因。另外，还有火鸡 i 型干扰素基凶的研究报道。国内夏春等人成功报道了丝羽乌骨鸡( 2 0 0 0 ) 、惠阳胡须鸡i f n a ( 2 0 0 0 ) ， 发现两种新亚型鸡i f n t t ，并克隆了北京鸭i f n 。a 基1 天t ( 2 0 0 0 ) 。克隆得到的鸡i f n a ，1 ，全长基因 分别由约5 8 2 和4 9 5 个核苷酸组成；同时对禽类i f n 基因的同源性进行了分析，确定了一些新的 亚型：序列比对发现，不同品种鸡的同类i f n 核苷酸同源性在9 0 以上，与相应的鸭i f n 同源性在 7 0 左右，提示同种不同品系禽类之间i f n 基因序列变异不大。表l 展示了已克隆的鸡i 型干扰素 基因1 2 2 1 。 表1 1 鸡干扰素基因与序列差异 t a b l e1 0 1c h i c k e ni n t e r f e r o ng e n e sa n ds e q u e n c ed i f f e r e n c e 注：3 所有序列差异均与s h - c hi f n a 4 ( a b 0 2 11 5 3 ) 氨基酸序列比较 2 2i i 型干扰素 1 9 9 5 年，d i g b y 等克隆了鸡 ，型干扰素戢q ( g g i f n d 。k a i s e r 等( 1 9 9 8 ) g 寸鸡i f n - 丫基因 6 一 ，j 。夏大学硕f = 学何论文 第一章引言 组结构进行了研究，从基凶组d n a 克隆得到了鸡i f n 1 ，基凶的全序列，并与哺乳动物基因组d n a 进行了比较，证明其结构与哺乳动物的非常相似。从而表明鸡i f n y 也是一个单拷贝基因，是由 4 个外显子和3 个内含予组成。 i f n - 1 ，基因完整的阅读框为4 9 2 个核苷酸，推测成熟蛋白为1 4 5 氨基酸，分子量为1 6 8 k d 。 分析与马和人氨基酸序列的同源性分别为3 5 和3 2 ，且有一些高度保守的序列，如c 末端的 k r k r 序列，而与l 型干扰素的同源性仅为1 5 。因此根据核苷酸和氨基酸序列的变异，可以推算 出干扰素基因的进化过程。据估计单拷贝d n a 变异率为o 1 百万年，所以推断，两种主要类型 干扰素( i 型和i i 型) 的出现要早于发生在3 5 0 亿年以前的鸡与哺乳动物的分化【2 3 1 。 2 3 禽类重组干扰素及其抗病毒效果 当前家禽病毒感染引起的鸡新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎、流感等给养禽业带 来了每年数十亿元的经济损失，是当前养禽业发展的大敌。如何有效治疗家禽肿瘤和病毒感染性 疾病一直是困扰禽病防治的重大难题之一。干扰素为这些疾病的防治提供了新的手段。 ( 1 1 航水泡性口炎病毒( v s v ) s c h u l t z 等( 1 9 9 5 ) 将鸡i f n a c d n a 克隆、在大肠杆菌和c o s 细胞中表达。随后，采用鸩胚成 纤维细胞( ( c e f ) - 滤泡性口炎病毒( ( v s v ) 系统测定了其重组基因工程干扰素( r g g i f n - a ) 的抗v s v 效价，活性在1 0 8 1 u m g ；并证明了r g g i f n a 是糖蛋白。 ( 2 ) 抗劳斯肉瘤病毒( r s v ) p l a c h y ，w e i n i n g 等( 1 9 9 9 ) 进行了鸡重组干扰素防治r s v 肿瘤的研究。用1 0 0 1 u m l i f n a 处 理c e f 细胞后再用r s v 攻毒。经i f n a 处理后r s v 的滴度未比处理的对照降低2 5 倍；同时， 采用每间隔2 d 静注1 0 0 0 0 i ur g g i f n - a 治疗已发生r s v 肿瘤的鸡，结果表明高剂量的r g g i f n 旺 不仅可以抑制肿瘤，还可以使一些鸡的r s v 肉瘤完全消失。 ( 3 ) 抗新城疫病毒0 q d v ) m a r c u s ，h e i d e 等( 1 9 9 9 ) 采用饮水法投喂r g g i f n a 防治n d v 。每天通过饮水给予1 日龄雏鸡 浓度分别为1 0 1 0 0 , 5 0