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采用复合酶水解青鳞鱼蛋白及水解产物特性研究 摘要 在前人研究基础上进一步研究了采用复合酶水解青鳞鱼蛋白的条件及水解产物功能特 性和抗氧化活性，并尝试开发复合酸奶制品，为低值鱼高值化加工利用提供新的途径及理 论依据。 本研究主要内容如下： 1 、采用正交试验确立复合酶酶解的最适宜条件，并在最适条件下分析其水解产物的 水解度、产物的平均链长、产物的苦味及产物的游离氨基酸含量变化的影响。 2 、研究相同酶活的风味酶、木瓜蛋白酶及复合酶的不同水解时间对蛋白质的水解 度、产物的平均链长、产物的苦味变化的影响。 3 、研究复合酶水解动力学模型 4 、研究青鳞鱼复合酶改性蛋白的功能特性 5 、初步研究青鳞鱼水解蛋白的抗氧化活性 6 、青鳞鱼水解蛋白复合酸奶制品的开发 研究的结果： 1 、采用正交实验对青鳞鱼蛋白复合酶水解条件进行优化，确定了复合酶水解的最适 宜条件为：温度为4 5 ，酶用量为1 2 0 0 i u g 肉，酶量比( 活力比) 为1 ：3 ( p ： f ) ，p h 值为6 5 ，底物浓度( w v ) 为1 ：2 9 m l 。在最适宜条件下，对青鳞鱼蛋 白在不同时间条件下水解，得出在2 1 0 m i n 时可得到最大水解度，苦味值随时间 的增加而增大，水解产物的平均链长随d h 的增大而减小。游离氨基酸占总氨基 酸的1 0 8 0 ，必需氨基酸占总氨基酸的4 3 1 。 2 、在各酶的最佳条件下，选择风味酶、木瓜蛋白酶及复合酶的酶活力相同时，以时 间为变量，分析其酶解产物，复合酶水解青鳞鱼蛋白的d h 要大于木瓜蛋白酶和 风味酶，复合酶水解青鳞鱼蛋白的m l p l 要小于其它两种酶。 3 、得出复合酶水解动力学模型： r = f o 315 4 e 0 0 0 18 6 s o ) e x p ( - 0 1 7 0 d h ) d h = 5 8 8 2 1 n 1 + ( o 0 5 3 6 2 e 0 s 0 - 0 0 0 3 2 ) t 。 4 、青鳞鱼复合酶改性蛋白与母本蛋白相比，具有良好的溶解性、乳化性与乳化稳定 性和泡沫形成与稳定能力。 5 、以生育酚为对比，青鳞鱼水解蛋白具有良好的抗氧化能力，随着d h 的增大，抗 氧化能力越强，当d h 增大到一定程度时，抗氧化能力有所下降。 6 、以苹果汁和奶粉为主要原料，以青鳞鱼水解蛋白粉为营养添加剂，配以白砂糖、 稳定剂，经发酵制成的酸奶，最佳工艺配方为：苹果汁2 0 、发酵剂量1 、发酵 时间3 h 、水解蛋白粉量1 ，黄原胶0 0 1 、海藻酸钠0 0 5 、单甘酯0 0 8 、蔗 糖酯0 。1 5 。 关键词：青鳞鱼，复合酶，动力学，功能特性，抗氧化 s t u d y o n h y d r o l y 7 s a t e sa n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fp r o t e i n f r o mh a r e a g u l az u n a s ib l e e k e rb yc o m p o u n de n z y m e a b s t r a c t o nt h eb a s i so ff o r m e rr e s e a r c h ，i nt h i ss t u d yw ef o c u s e do ns t u d y i n gt h em e c h a n i s mo f t h ee n z y m o l y s i s ，f u n c t i o n a lp r o p e r t i e sa n da n t i o x i d a f i o na n dt r y i n gt oe m p o l d e rc o m p o u n d y o g h o u r to fp m t e i nf r o mh a r e n g u l az u n a s ib l e e k e rb yc o m p o u n de n z y m et h a to b t a i n e df r o m m i x t u r ew i t hp a p a i na n df l a v o r e a s ew a ss t u d i e d ，w h i c hw i l la f f o r dn e wa p p r o a c ha n dt h e o r e t i c a l b a s i so f t h eh i g ha d d i t i v ep r o c e s so f l o wv a l u ef i s h t h em a i nc o n t e n t s ： ( 1 ) t h eo p t i m u mc o n d i t i o no fc o m p o u n de n z y m ei se s t a b l i s h e db yt h eo r t h o g o n a lt r i a l s u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o na n dd i f f e r e n tt i m e s ，t h ed h ，m l p l ，b i t t e r n e s sa n df r e ea m i n o - a c i d o f t h eh y d r o l y s a t ea l es t u d i e d ( 2 ) a tt h es a m ee w i z y m ea c t i v i t yo fp a p a i n ，f l a v o r e a s ea n dc o m p o u n de n z y m ea n d d i f f e r e n tt i m e ，t h ed h ，m l p l ，b i t t e r n e s sa n df r e ea m i n o - a c i do f t h eh y d r o l y s a t ea r cs t u d i e d ( 3 ) s t u d yo i lt h eh y d r o l y s i sk i n e t i cm o d e lo fp r o t e i nf r o mh a r e n g u l az u n a s ib l e e k e rb y c o m p o u n de n z y m e ( 4 ) s t u d yo nt h ef f m c t i o n a lp r o p e r t i e so fh y d r o l y s a t e so fp m t e i nf r o mh a r e n g u l a z u n a s i b l e e k e rb yc o m p o u n de n z y m e ( 5 ) e l e m e n t a r ys t u d yo nt h ea n t i o x i d a f i o no fh y d r o l y s a t e sf r o mp r o t e i no fh a r e n g u l a z u n a s ib l e e k e rb yc o m p o u n de n z y m e ( 6 ) e x p l o i t u r ec o m p o u n dy o g h o u r to ft h eh y & o l y z e dp r o t e i nf r o mh a r e n g u l az u n a s i b l e e k e r r e s u l t s ： ( 1 ) t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f c o m p o u n de n z y m ee x p r e s s e da s ：t e m p e r a t u r ei s4 5 c ，t h e d o s a g eo fe n z y m ei s1 2 0 0 i u gm e a t ，t h er a t i oo fe n z y m ea c t i v i t y ( p ：di s1 ：3 ，p hi s6 5 ，t h e c o n c e n t r a t i o no fs u b s t a n c e ( w v ) i sl ：2 9 m l u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o na n dd i f f e r e n tt i m e ，w h e n t h eh y d r o l y z e dt i m ei s2 1 0 m i n d hi sm a x b i t t e r n e s si sm o r ea n dm o r ef u r t h e rw i t l lt h e h y & o l y z e dt i m e m l p ld e c r e a s e sw i mt h eh y d r o l y z e dt i m e n l ef r e e a m i n o a c i do ft h e h y d r o l y s a t ea c c o u n tf o r1 0 8 0 o ft o t a la m i n o a c i d ，t h ee s s e n t i a la m i n o a c i do ft h eh y d r o l y s a t e a c c o u n tf o r4 3 1 o f t o t a la m i n o a c i d ( 2 ) u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n so fp a p a i n ，f l a v o r c a s ea n dc o m p o u n de n z y m ea n da tt h e s a m ee n z y m ea c t i v i t y , t h er e s u l t ss h o w st h a tt h ed hc o n t r o l l e db yc o m p o u n de n z y m ei sb i g g e r t h a no t h e rt w oe n z y m e sa n dt h em l p lc o n t r o l l e db yc o m p o u n de n z y m ei ss m a l l e rt h a no t h e r t w oe n z y m e s ( 3 ) t h eh y d r o l y s i sk i n e t i cm o d e lc o n t r o l l e db yc o m p o u n de n z y m ee x p r e s s e da s ： r 2 ( o 3 1 5 4 e 0 0 0 1 8 6 s 0 ) e x p ( - 0 1 7 0 d h ) 、 d h = 5 8 8 2 1 n 1 + ( 0 0 5 3 6 2 e 0 s 0 0 0 0 3 2 ) t ( 4 ) c o m p a r i n gw i mt h eo r i g i n a lp r o t e i nf r o mh a r e n g u l az u n a s ib l e e k e r , m o d i f i e dp r o t e i n c o n t r o l l e dc o m p o u n de n z y m eh a sb e t t e rn s i ，e a ia n da e a i ，f pa n df s ( 5 ) c o n t r a s t i n g w i t l lt h ea n t i o x i d a t i o no fa - t o c o p h e r 0 1 t h eh y d r o l y z e dp r o t e i nf r o m h a r e n g u l az u n a s ib l e e k e r h a sb e t t e ra n t i o x i d a t i o n w i t ht h ei n c r e a s i n go ft h ed h ，a n t i o x i d a t i o n i sm o r ea n dm o r eb i g g e r , w h e nt h ed hr e a c h e sac e r t a i nd e g r e e ，t h ea n t i o x i d a t i o nd e c r e a s e s ( 6 ) a p p l ea n d m i l kp o w d e ra r eu s e da st h em a i nr a w m a t e r i a l ，t h em o d i f i e dp r o t e i ni su s e d a sn u t r i t i o na d d i t i v e ，m a t c h i n gw i t hg r a n u l a t e ds u g a r ，s t a b i l i z a t o ra n df e r m e n t i n g t h eo p t i m u m c o n d i t i o ni sa p p l e j u i c e2 0 ，t h ed o s a g eo f y o - f l e x1 ，f e r m e n tt i m e3 h ，m o d i f i e dp r o t e i nl ， x a n t h i cc o l l o i d0 叭，s o d i u ma l g i n a t e0 0 5 ，s i n g l ee s t e r0 0 8 ，s u c r o s ee s t e r0 1 5 k e yw o r d s ：h a r e n g u l az u n a s ib l e e k e r , c o m p o u n de n z y m e ，k i n e t i c s ，f u n c t i o n a lp r o p e r t i e s ， a n t i o x i d a t i o n 主要缩略词及其含义 l i p ：hy d r o l y z e dp r o t e i n ，水解蛋白 m l p l ：m e a nl e n g t ho f p e p t i d el i n k a g e ，平均链长 m p ：m o d i f i e dp r o t e i n ，改性蛋白 o p ：o r i g i n a lp r o t e i n ，母本蛋白 n s i ：ni t r o g e ns o l u b l ei n d e x ，氮溶指数 e a i ：e m u l s i f y i n g a c t i v i t yi n d e x ，乳化活力指数 a e a i ：乳化稳定性 f p ：f o a m i n gp o w e r ，起泡性 f s ：f o a ms t a b i l i t y ，起泡稳定性 湛江海洋大学 学位论文独创性及知识产权声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得本校或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢 意。 本学位论文成果归湛江海洋大学所有。 指导教师签名；御奄衰 郴年1 月6 e t 湛江海洋大学硕士学位论文 1 绪论 1 1 蛋白质概述 蛋白质是生命的物质基础，一切生命活动无不与蛋白质有关。新陈代谢是生命活动的 主要特征，而构成新陈代谢的所有化学变化，都是在酶的催化下进行，除了个别酶外，所 有酶都是蛋白质，生长、运动、呼吸、免疫、消化、光合作用等，都必须通过蛋白质来实 现。因此，有关蛋白质的研究一直以来都是生物技术领域的研究热点。 蛋白质分子基本上是由2 0 种氨基酸以肽键的方式连接而成的大分子，其分子量一般 在几万至几十万d a 之间，小的如细胞色素c ，由1 0 4 个氨基酸组成，大的则含有8 3 0 0 个 氨基酸残基。它不但在食品工业上具有重要的加工功能特性，而且在生物学上也具有重要 的生物功能。肽与蛋白质都是由氨基酸通过肽键连接起来的大分子聚合物，在结构上，肽 处于氨基酸和蛋白质的中间位置。而生物活性肽( b i o a c f i v e p e p t i d e s ) 是指那些有特殊的生 理活性的肽类。其实绝大部分的蛋白质都是一些具有不同功能作用的生物活性肽的前体， 本身的肽链组成与结构中存在着一定功效的氨基酸序列片段( 功能区) ，在正常状态下， 蛋白质的肽片段没有释放出来，但是一旦通过某种方法，把功能片段单独从蛋白质肽链中 切断释放出来，就能显示出独特的生物活性，这就形成所谓的生物活性肽。自从1 9 7 9 年， b r a n t l 等人首先报道喂食牛乳酪蛋白酶解物的豚鼠的小肠中发现了具有类吗啡活性的短肽 以来，人们对蛋白酶解物开发生物活性肽方面的研究进展迅速，其生理功能越来越引起人 们的重视，并日趋成为保健药物以及食品工业领域的研究焦点。 蛋白质是人体必需的营养成分之一，f a o w h o 规定每人每天摄入蛋白质7 0 7 5 克， 而我国人们实际摄入量只有6 5 克，在我国人民膳食结构中，碳水化合物所占的比重还很 大，而蛋白质所占的比重还很小，再加上近年来蛋白资源的匮乏，因此开发食品蛋白资源， 改善人民膳食结构，提高我国人民蛋白质摄入数量和质量是一项紧迫的任务。多年来，众 多的研究者致力于此方面的研究，研究与开发植物蛋白、动物蛋白和其他蛋白资源，并取 得了一些成就，但这方面的研究工作还在进行，不断有新的成果出现，以便为人类的蛋白 资源的充分利用奠定理论基础u ，。 1 2 水解蛋白的研究现状 蛋白质是维持人体生命活动的重要物质，其水解中含有大量的氨基酸系列物质，可以 增强食品的鲜味，广泛用作食品调味料。此外，蛋白质水解物中的小分子多肽可由肠道直 接吸收消化，可作为肠道营养剂或以流质食物形式提供给需要人群，因此蛋白质水解物在 医药、保健食品中有广泛的应用。因此，也一直都是营养研究的重要课题。蛋白质经酶催 化等方法水解得到的产物称为水解蛋白或蛋白水解物( p r o t e i nh y d r o l y s a t e ) 。食物中的完 全蛋白质经酶解作用，主要达到两个目的：( 1 ) 降低分子量大小，改变分子结构，消除抗 原决定簇，最终降低免疫原性；( 2 ) 选择有特殊氨基酸组成的肽段，以利于特殊人群的蛋 白质、氨基酸的代谢啪。 采用复合酶水解青鳞鱼蛋白及水解产物特性研究 先来了解一下蛋白质酶解机理。蛋白质在水溶液中，在蛋白酶的作用下，其中的肽键 断裂，形成肽链长短不一的多肽及少量的游离氨基酸，如图卜1 所示： l0i l l liillll h r - hr 2h 弛h 融 e n z y m el + 也0 l h0 h o h0h0 l i i l i i0 i hr 1hr 2 h r 3 hr 4 一h + fl + h 十 r fl h + 图卜1 蛋白质酾解示意图 f i g 1 - 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f e n z y m a t i ch y d r o l y s i so f p r o t e i n 由图1 - 1 可以看出，蛋白质在水解过程中，随着其断裂为各种大小不等的多肽及少量 游离氨基酸，溶液中各种多肽和氨基酸的羧基和氨基逐渐显示出其效应，表现为水解液的 p h 值随着水解的进行而下降；同时溶液中的可溶性蛋白质的含量随水解进行逐渐增加“1 。 水解蛋白包括水解植物蛋白( h v p ) 和水解动物蛋白( h a p ) 。水解植物蛋白指在酸、 碱或酶的作用下，水解含蛋白质的植物组织所得到的产物。这些产物不但具有可适用的营 养保健成分，而且可用作食品调味料和风味增强剂。水解动物蛋白是指在酸、碱或酶的作 用下，水解含蛋白质的动物组织所得到的产物。 前一个时期蛋白水解物的开发以大豆蛋白、乳蛋白、蛋清蛋白为主，尤其以乳蛋白水 解物和活性肽的研究开发最为深入，近年来，有关畜血、水产蛋白水解物和活性肽的产品 研究和开发日益受到重视。因为我国海洋生物资源蕴藏量十分丰富，其中海洋蛋白资源种 类尤其繁多，由于海洋环境不同于陆地环境，为适应某些极端生境，海洋生物蛋白无论是 氨基酸组成还是氨基酸序列上都与陆地蛋白有很大不同，向海洋索取食物，功能蛋白和特 殊活性物质，已成为世界各沿海国家海洋开发的一项重要内容。 鱼类蛋白质品质优良，其氨基酸比例与人体肌肉成分极为接近，人体吸收利用率较高。 鱼类蛋白质经过水解，其营养品质和功能特性将迸一步得以改善，因此对鱼类蛋白水解物 进行开发已经引起人们的关注。水解鱼蛋白方面的研究成果已经有很多“1 ：狭鳕( t h e r a g r a c h a l c o g r a m m a ) 广泛分布于北太平洋，鱼肉蛋白质含量达1 5 1 9 ，所含氨基酸齐全，具 有很高的开发利用价值。鳕鱼目前多用于制作鱼片和鱼糜等制品。在其加工过程中会产生 大量废弃物鳕鱼碎肉和鳕鱼排等。王长云等利用枯草杆菌a s m 重型蛋自酶水解鳕鱼 2 懈附 湛江海洋大学硕士学位论文 碎肉提取水解蛋白，用黄曲霉对鱼蛋白水解液进一步水解，有效地脱去了苦味。水解液经 真空浓缩及喷雾干燥得到水解蛋白粉，该制品可以作为蛋白强化剂应用于各类食品中。熊 光汉比较了胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对鲢鱼蛋白的水解效果，证明了胰蛋白酶水 解效果最好，水解产物蛋白质含量达到8 5 以上。衫山圭吉以沙丁鱼蛋白为原料，比较了 3 种碱性蛋白酶，2 种中性蛋白酶和3 种酸性蛋白酶的水解作用效果，证明了碱性蛋白酶 水解效果好，所得产物溶解性好，营养价值高。h o y l e 通过对鲱鱼蛋白水解的研究表明， 碱性蛋白酶的水解能力比中性蛋白酶强，水解产物的苦味相对较小。 当今鱼类资源的日益匮乏，加强对低值鱼和鱼类加工副产物的加工利用具有很重要意 义。 1 3 水解蛋白水解方式的研究现状 水解蛋白的水解方式主要有酸法、碱法和酶法。化学法是利用酸碱水解蛋白，虽然简 单价廉，但由于反应条件剧烈，生产过程中氨基酸受损严重，使l 一氨基酸形成d _ 氨基酸， 并能形成像氯丙醇等的有毒物质，且难以按规定的水解程度控制水解，故较少采用；而酶 法水解能在温和的条件下进行，能在定的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽，且水 解进程易控制，因而能较好地满足肽的生产需要。酶的选择、酶解过程的控制是酶解法制 备生物活性肽的关键技术时1 。 例如，水解植物蛋白中，酶法处理棉籽蛋白很好的提高棉籽蛋白吸收率，改善发泡性 和乳化性，可制备食品工业急需的发泡剂和乳化剂“1 。酶法水解优点较多：氨基酸不易被 破坏也不消旋，反应最终产物无需中和，而且酶解法反应条件温度、p h 值等温度容易控制， 有效地降低了工艺难度和能耗，此外，酶反应有高效性，且由于对蛋白质进行了分解而提 高营养价值，易消化吸收，同时，可以通过控温反应使其风味得到进一步提高。因此采用 酶水解是一种理想的方法。 总的来说，酶对蛋白质的水解作用使蛋白质具有以下三种特性；分子量降低，离子性 基团数目增加、疏水性基团暴露出来。这样可使蛋白质的官能性质发生变化，因此而达到 改善乳化性效果、增加保水性、提高热反应能力及摄食时易为人体消化吸收等目的。酶切 蛋白质的肽键使其成为小分子肽的情况，可用蛋白质的水解程度水解度( 阴) 来表示。 d h 值越高表示肽键被切断的数目越多，有许多游离氨基酸，低分子量肽生成，完全水解的 蛋白质d h 为1 0 0 。 另外，蛋白酶水解法也是提取水解鱼蛋白的主要方法。蛋白酶水解法制得的水解鱼蛋 白的具有很高的营养价值和良好的理化性质。如鳕鱼水解蛋白是一中优良蛋白制品，可作 为各类食品的蛋白强化剂，模拟海鲜调料等嘲。 因此，普遍采用条件较为温和的酶法制造水解鱼蛋白。能在一定条件下实现蛋白质的 定位水解产生特定的肽，即有效控制水解，控制水解反应的进程，使得反应产物的功能特 性得到良好的改善，并具有特殊的理化性质和生物活性，已经成为了海洋低值蛋白质资源 有效利用的主要手段和重点研究的热点。 采用复合酶水解青鳞鱼蛋白及水解产物特性研究 1 4 蛋白水解产物功能特性的研究现状 自从四十年代二战期间起，一些西方学者开始在蛋白改性方面进行研究，用酶改性蛋 白来补充极其缺乏的鸡蛋，但当时还未获得技术上的突破，可能是由于水解过程不易控制， 同时水解产生的苦、臭味影响了其风味。在6 0 年代末，蛋白酶应用与脂肪、骨和鸡蛋的 分离、肉的嫩化、食品功能性质的改善等，随后酶改性蛋白的研究一直是众多学者关注的 问题，随着生物技术的进步和生命科学的发展，蛋白水解产物的功能特性受到越来越多的 重视嘲。 蛋白质的功能特性是指在配置、加工、制取和贮藏过程中，对食品质量能产生影响的 某些物理、化学性质。这些性质具体表现为溶解性、吸油性、吸水性及乳化稳定、起泡性 与泡沫稳定性等。蛋白产品的这些功能性好坏，直接影响到它在食品行业中的应用。 蛋白水解产物功能特性如溶解性、粘性、乳化性、泡沫性、凝胶性和风味特性是完全 蛋白质常见的，但由于酶的水解，这些特性不同于原蛋白质，最重要的功能性质之一是它 在比较宽p h 范围、温度范围、蛋白质浓度和较高离子强度下的溶解性。所以它们很大程 度上取决于分子大小或水解度。蛋白质水解物的功能特性也受蛋白质水解所用的酶、完全 蛋白质的物理、化学本质和水解条件的影响。另外，高度水解的蛋白质的乳化能力急剧下 降，受热情况下不发生凝胶变性，其粘度不受温度影响。蛋白质水解物具有易消化、易吸 收、抗过敏性、治疗低血压和降低胆固醇等作用，故国外关于蛋白水解物的开发极为活跃。 蛋白质经酶水解能提高它从食品原料中的回收率和改进它的功能性质。通过水解改性还 可改变分子空间构象，并将分子量降到一个适当的范围，获得表面活性较为理想的水解蛋 白。棉籽蛋白水解改性，不仅可获得良好的起泡性、乳化性等功能特性，用于制备食品工 业急需的发泡剂和乳化剂，而且能提高蛋白的生物学效价“。 近些年，有关蛋白水解产物的功能特性的研究很多。例如j o s t “”a n dk c s t e r “以乳清 蛋白为原料，c h o b c r t “”以酪蛋白为原料，a d l e r - n i s s e n “”以大豆蛋白为原料，q u a g l i n “”研 究了沙丁鱼蛋白水解物的水解度对结构和乳化特性的影响结果表明随着水解度的增加，乳 化稳定性降低。水解度较低的水解物具有较高的乳化特性，并且疏水性也高，并表明分子 量较高的水解物在乳化性质方面起重要的作用。s h a h i d i “”以毛鳞鱼为原料分辨研究了其蛋 白水解物和母本蛋白的溶解性的关系：曲永洵“”、冯志彪“”得出水解产物与母本蛋白相比 粘性急剧下降。赵玉红等“”研究了以鲢鱼下脚料中蛋白质为原料，加酶水解制成蛋白水解 物，从而研究其母本蛋白和蛋白水解物的功能特性。主要包括：具有很好的溶解性，在 p h 2 0 1 0 0 的范围内溶解性均大于9 4 ；具有优良的热稳定性和冷藏稳定性；黏性变小， 起泡性为初始体积的3 4 0 4 3 0 倍，但泡沫稳定性在酸性条件下变差。据赖小玲报道， 在酶用量4 0 0 0 i o g ，温度6 0 。c ，p h 9 0 ，水解4 h ，获得的猪血球水解蛋白乳化度为9 1 3 ， 并且有良好的乳化稳定性和发泡能力。徐洛报道骨质水解蛋白可促进原发性血小板减少紫 癜患儿体内血红蛋白和游离铁的结合蛋白的产生，加速有害物质的排泄。1 。因此，蛋白质 的酶法水解可以在不降低营养价值的前提下改善其理化和功能性质，扩展在食品加工中的 应用范围，以及用于新产品开发。 1 5 蛋白水解产物的生物活性肽的研究现状 4 已 湛江海洋大学硕士学位论文 生物活性肽是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，它小至由两个氨基酸组成，大 至数百个氨基酸通过肽键连接而成，具有十分重要的生物学意义。生物活性肽的生物学意 义主要体现在其吸收机制优于氨基酸和具有主要有类吗啡样活性、激素和调节激素的作 用，对生物体内的酶具有调节和抑制功能，改善和提高矿物质运输和吸收，抗细菌和病毒， 提高免疫力，抗氧化，清除自由基等。 长期以来，人们认为人和动物所摄入的蛋白质必须被降解成游离氨基酸后才能被吸收 和利用，且游离氨基酸是主要的吸收方式；到了上世纪5 0 年代，n e w a y 和s m i t h 棚发现肽 可被完整吸收，且二肽与三肽的吸收方式与氨基酸的吸收方式大相径庭；此后又有许多学 者通过酶学等方法证实了肽的吸收机制较氨基酸的吸收机制存在较大区别n 日。目前的研究 结果表明。：人体对氨基酸的吸收机制与对小肽的吸收机制是相互独立的，通常氨基酸的 吸收有中性氨基酸、碱性氨基酸、酸性氨基酸和亚氨基酸四种运输模式，且运输载体依靠 的是浓度梯度进行运输，因此具有吸收慢、易饱和、能耗高等特点；而肽的吸收依赖于同 向运输，因此具有吸收快、运输载体不易饱和、能耗低等特点，且各种肽之间无竞争性与 抑制性，因此肽更有利于被人体吸收和利用。这些肽不仅能提供人体生长、发育所需的营 养物质，同时具有防病治病、调节人体机能的功能；有些是原蛋白质或其组成氨基酸所没 有的独特的生理机能。特别是活性肽的组成氨基酸并不一定是必需氨基酸，这就为人们更 为广泛和充分地利用蛋白资源，尤其是那些原来被认为生物价不高的蛋白质资源的利用提 供了新的机遇。 蛋白质经酶解后可产生具有活性的多肽，生物活性肽具有免疫调节、抗癌等多重功效 “1 。蛋白质的水解方法有酸、碱和酶法，其中以酶水解方法最佳，这主要是因为水解条件 温和，酶水解过程控制较为方便，而酸碱等化学水解方法水解蛋白质时水解程度难以控制 且水解过程中形成l y s i n o a l a n i n e 等毒性物质“1 ，因此，水解蛋白质制各活性肽一般都采用 酶水解的方法。许多具有生理活性的多肽已通过蛋白酶解而生产出来。来自陆地蛋白源的 酶解产物，近年来已经就此研究的进展进行了综述瓣。 海洋中的生物种类繁多，资源极其丰富，而且生物链基本健全，再生能力强，每年全 球海洋浮游生物产量约5 0 0 0 亿t ，近1 0 多年来，全世界每年从海洋获取的鱼、虾、贝、 藻已达8 干多万t 。海洋生物长期处于海水这样一个特异的闭锁环境里，在进化过程产生 了与陆上生物不同的代谢系统和机体防御系统，因此海洋生物中蕴藏着许多功能特异、结 构新颖的生理活性物质，从海洋生物中分离鉴别出近5 0 0 0 种新型的生理活性物质，主要 为肽类、生物碱类、大环聚酯类、聚醚类、多糖类、多烯类不饱和脂肪酸等化合物。因此， 应当充分利用海洋生物资源，开发海洋生物活性肽，这是实现海洋生物资源可持续性发展 重要途径之一。1 。 已研究出的来自鱼贝类的抗高血压肽有： c 1 i 肽( 沙丁鱼) ：t y r - l y s s e r p h e i l e l y s g l y t y r p r o v a l m e t ： 巴肽( 沙丁鱼) ：l e u - l y s v a l g l y v a 卜l y s g i n t y r ： c 8 肽( 南极鳞虾) ：p r o - t h r _ h i s 1 1 e l y s t r p - g l y - a s p ：c 3 ：l e u l y s _ t y r 因原料蛋白、所用酶类及分离精制方法的不同可获得具有不同生理功能的产品。目前 已从酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、玉米蛋白、卵白蛋白、丝蛋白、胶原蛋白、 采用复合酶水解青鳞鱼蛋白及水解产物特性研究 水产蛋白等的酶解物中制得一系列功能各异的生物活性肽。除生理功能外，生物活性肽还 具有较好的酸、热稳定性、水溶性等优点，因而易于作为功能因子添加到各类食品中，市 场前景极好”。 当前对酶解海洋生物活性肽的研究主要集中在四个方面：一是酶解工艺及其产物的功 能特性：二是营养效价方面的研究：三是生理活性方面的研究；四是分离纯化技术的研究。 大量研究表明，各种蛋白酶解物具有良好的加工功能特性，如溶解性、稳定性、乳化性、 风味等。例如，h o y l e 等对鲱鱼蛋白水解物的质量进行了研究，表明水解前将脂肪抽提会 降低水解度。朱碧英等人研究了用胃蛋白酶、胰蛋白酶水解醍鱼蛋白制备可溶性肽类水解 物，测得水解产物中肽类相对分子量在7 4 0 0 d a 以下o ”。b e n i a k u l 研究了牙鳕废弃物的利用， 将其废弃物( 包括鱼头、皮、骨、内脏和肌肉组织) 绞碎，分别用中性和碱性蛋白酶水解， 选择了最优酶和最佳水解条件，所得产物蛋白质含量高( 7 9 7 9 ) ，氨基酸组成与鱼肌肉 十分相近。 1 6 蛋白水解产物及其抗氧化活性的研究现状 1 6 1 衰老的机理 人为什么会衰老? 古人认识“1 ：中医学关于衰老机理的学说甚多，大致可归纳为四 种：( 1 ) 气血滓液郁滞说。这种学说甚于“流水不腐、户枢不蠹”理论，认为人体衰老四 流通着的物质( 气血津液) 郁滞的结果。( 2 ) 阴亏说。这种学说认为，人之阴精充足则生 命力旺盛，阴精不足则生命力低下，衰老早至。( 3 ) 阳虚说。明张介宾类经附翼大 宝论：“凡万物之生由乎阳，万物之死亦由乎阳，非阳能生万物，阳来则生，阳去则死 矣。人是小乾坤，得阳则生，失阳则死。”强调人体阳气充盛，则机能旺盛，否则多 病损年。( 4 ) 先天禀赋不足说。清代医家徐大椿认为人的寿命长短是有定数的，这定数是 由先天禀赋的，即父母遗传的，定数大则寿长，定数小则寿天。其医学源流论谓：人 “形成之时，即有定数”。他所说的定数，与现代生物学中的细胞分裂次数相似，当细胞 分裂达到一定次数后，生命即告结束。这一理论揭示早衰与先天禀赋不足有关。上述学说 从不同角度阐述了中医学对衰老机理的认识，包括着极丰富的实践内容，具有较高的学术 价值。 近代学者均认为衰老原因首先是由遗传因素决定的，其次是外部因素。而外部因素有 多种学说，其中自由基学说颇受重视。自由基是具有一个以上的奇数电子的分子或原子的 总称。在人体内代谢过程中可以产生多种自由基如羟自由基、脂自由基和过氧化氢，氧气 在一定条件下被还原成为超氧阴离子。然而在人体内存在着天然抗氧化系统如超氧化物歧 化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶，这些酶可以把上述自由基消灭。但当这 些自由基一旦过剩，就会引发一系列有害物质，一系列自由基反应，使不饱和脂肪酸形成 过氧化脂质等危机细胞功能，导致衰老。这些自由基反应还可能使蛋白质、核酸分子变性、 损伤，失去其原有的功能，导致人体衰老。 6 湛江海洋大学硕士学位论文 1 6 2 抗氧化活性物质的研究现状 抗氧化剂是一种重要的食品添加剂，其主要作用是组织或延缓油脂的自动氧化，还可 用于防止因食品中的油脂氧化而使食品发生褐变、褪色和营养遭到破坏等。抗氧化剂现己 广泛地应用于食品工业，而且需求量逐年增加，美国1 9 7 9 年抗氧化剂的消耗为5 4 0 0 万美 元，1 9 9 0 年增加到1 3 0 0 0 万美元。年增长率为7 8 9 6 。食品工业目前主要使用人工合成的抗 氧化剂，我国目前常用的三种抗氧化剂为b h a ( 丁基羟基茴香醚) ，b h t ( 二丁基羟基甲 苯) 和p g ( 没食子酸丙酯) 。七十年代以来人们逐渐发现所有经合成的抗氧化剂皆有一定 的毒性，如b h a 对白鼠有致癌作用。日本1 9 8 2 年5 月曾规定b h a 可用于棕榈油和棕榈仁 油，不能用于其他食品，而许多植物中的天然抗氧化活性物质已成为当今食品科学发展的 必然。 活性氧自由基( 主要是超氧阴离子和羟自由基) 对机体产生一系列的有害作用，如进 攻多不饱和脂肪酸可引起脂质过氧化，导致生物膜结构和功能的改变，损伤蛋白质的巯基 和氨基使蛋白质变性、交联，使酶的活性丧失；损伤d n a 可导致细胞突变。种种有害后果 与许多疾病如肿瘤、炎症、衰老的发生有密切的关系，因此生物体内活性氧的生成与清除 的平衡对生命过程进行是十分重要的o ”。 目前抗氧化、抗自由基活性物质的研究已成为生命科学研究的热门课题嘲。国内外学 者大量研究表明一些富含多酚类、黄酮类、皂苷类、鞣质类、生物碱类、多糖类等成分的 天然食物有较强的抗氧化能力。抗氧化活性的研究领域多集中在农作物方面如大豆、杨梅、 花生、果蔬等，以及真菌多糖的抗氧化活性的研究。已经证实，黑木耳多糖、银耳多糖、 虫草多糖、金针菇多糖等可直接或间接地清除体内过剩的氧自由基，从而起到增强体质和 延缓衰老的作用。而海产品领域的研究剐刚起步。近年来，蛋白水解物的研究越来越受到 人们的关注。研究发现大豆蛋白酶解物在体外具有抗氧化活性，c h e n ”1 等发现大豆蛋白酶 解物具有抗亚油酸脂质过氧化，并且从中分离得到了6 种抗氧化活性肽，其中分子量最小 的是5 肽( l e u l e u p r o h i s h i s ) 。郭兴风等研究了菜籽蛋白酶水解产物具有一定的抗氧 化活性。花生蛋白酶水解产物抗氧化活性研究，采用中性蛋白酶、a s l 3 9 8 、碱性蛋白酶 对花生蛋白进行水解，研究结果证明花生蛋白的酶水解产物具有一定的抗氧化性能m ，。 蛋白质水解物、氨基酸和m a i l l a r d 反应产物也引起人们兴趣。山口直彦等用9 种蛋白 酶将大豆蛋白进行不同程度水解后，发现水解度为1 7 7 组分具有较强抗氧化作用。其他 学者对蛋白质水解物和氨基酸抗氧化性能进行研究，发现脯氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨 酸、蛋氨酸等抗氧化性能较强，氨基酸的组成及分子量大小会影响肽的抗氧化能力，分子 量在5 0 0 3 0 0 0 内的肽抗氧化性能最佳。有学者从m a i l l a r d 反应生成物中分离出一种类黑 精，其抗氧化能力与b h a 相当“。另外，在大豆油的研究中，色氨酸和组氨酸显示出较高 的活性，甘氨酸和丙氨酸显示较弱的活性。然而，从某种程度上讲，所有的氨基酸均显示 了抗氧化活性，这种活性可能影响了n h 。r 的抗氧化活性的本质。所以蛋白质或蛋白水解物 的应用在功能物质领域对提高抗氧化活性要比氨基酸的应用更加的实际，应用广泛，因为 蛋白质和氨基酸有许多其它的功能特性“”。 在寻找抗氧化物质的进程中，许多学者的目光已转向海洋这一资源宝库。近3 0 年来， 从海洋生物中分离出许多具有抗氧化活性的物质，如多糖及其衍生物：螺旋藻多糖、甲壳 采用复合酶水解青鳞鱼蛋白及水解产物特性研究 质及其衍生物、鼠尾藻多糖和铜藻多糖、硫酸多糖类：维生素类：维生素e 、类胡萝h 素； 氨基酸、肽、蛋白质及酶类：牛磺酸、谷胱甘肽、扇贝多肽、k o n b a m i d e s ，k e r a m a m i d e s b ，c ，d 、 铜蓝蛋白、金属硫蛋白、超氧化物歧化酶；其他如：翅碱蓬提取物、贻贝多活素、灿d i s i i l 、 软珊瑚胆甾烯、鲨鱼软骨提取物。这些研究成果为海洋抗氧化药物的开发和利用提供了理 论依据。海洋生物资源丰富，我们有理由相信：2 l 世纪海洋抗氧化剂的开发和利用前景十 分广阔。 国外有研究从鳕鱼下脚料中得到水解蛋白，它具有一系列的生物活性：抗氧化活性和 a c e 抑制活性。国内近年来的研究，如一些低值鱼类鲐鱼、鳕鱼、青鳞鱼等都进行了许多 方面的研究，研究证明其酶解蛋白是一种极易为人体吸收利用的短肽类蛋白，有望在食品 医药、蛋白添加剂或氨基酸补充液中应用。张希琴等研究了2 5 种海产品抗氧化能力，发 现有1 0 种海产品都具有较强的抗氧化活性m 1 。在最近文献中，也报道了从鱼骨胶的酶解 物中提取的肽也具有抗氧化活性“”。这就更加激励我们从丰富的海洋资源中来研究和开发 更多的海洋蛋白资源以及它所具有的生物活性，为开发海洋功能食品奠定基础。 1 6 3 抗氧化活性的测定方法 目前常用的测定抗氧化活性体外的方法有m 1 ：有硫氰酸盐测定法”1 、硫代巴比妥酸法 删、b 一胡萝卜素褪色法以及用消除自由基能力来表示抗氧化活性的d p p h 法 铷等。 1 7 水解产物的苦昧机制及其脱苦研究 1 7 1 苦昧的机理 蛋白质在水解前没有苦味，酶法水解后经常会产生苦味，是因为水解前疏水性氨基酸 残基被包围在蛋白质的四级结构内，不能与味蕾接触，没有苦味。水解后疏水性氨基酸残基 的暴露使某些肽片段的疏水性增大而产生苦味“1 。 这使酶法水解蛋白在食品工业上的应用受到了严重的限制。酶法水解蛋白产生苦味与 否以及苦味的大小与蛋白质的种类、酶的类型、水解度及分离方法等因素有关。苦味的形 成与蛋白质的种类、酶的类型和水解度( d h ) 有关。 苦味肽的长度从几个氨基酸残基n - - - 十几个氨基酸残基不等，这些苦味肽一个共同的 特点是疏水性残基所占的比例比较大。有研究证明，水解液的苦味产生与其疏水性氨基酸 的量和侧链的位置有关，当疏水性氨基酸含量相对低或位于肽链的末端位置时苦味较低 嘞1 。选择合适的酶，用多酶进行复合水解，使疏水性氨基酸位于肽链末端或尽可能少进入 水解产物中，不会随着水解度的提高水解液苦昧增加，该方面的研究国内尚未报道。 m u r r a y 和b a k e r 在研究酶法制取蛋白质水解物时发现，由胶原蛋白和鸡蛋卵清蛋白制 得的水解物口味平淡：而乳白蛋白和酪蛋白的水解物产生苦昧。当这些带苦昧的水解物用 活性炭处理后，口味得到改善，并从活性炭中洗脱出极苦的多肽。这一研究揭示了是多肽 而不是游离氨基酸，并且这些肽可用疏水吸附加以分离。对酪蛋白水解的进一步研究，证 实苦味物质是肽类。g o r d o n