（海洋生物学专业论文）斜带石斑鱼ghrelin的酵母表达及表达产物的活性研究.pdf

中山大学硕士学位论文2 0 1 0 年5 月 论文题目：斜带石斑鱼g h r e l i n 的酵母表达及表达产物的活性研究 专业：海洋生物学 姓名：武丽娟 导师：林浩然院士 协助指导老师：李文笙教授 摘要 斜带石斑鱼在东南亚和中国南部，是重要的经济海水鱼种之一，斜带石斑鱼 具有巨大的经济价值，国内外有不少学者对其进行研究报道。脑肠肽( g h r e l i n ) 是一种活性多肽，s e r 3 具有辛酰化修饰，这种酰基化修饰结构是其与受体结合以 及功能发挥所必须，前体p r e - p r o g h r e l i n 除了形成g h r e l i n p b ，还会通过不同的翻 译前剪切修饰形成另外两种不同形式的多肽：d e s a e y lg h r e l i n 和o b e s t a t i n ，到目 前为止，大量研究表明g h r e l i n 是促摄食的调节剂，但是对于d e s a c y lg h r e l i n 和 o b e s t a t i n 在促摄食方面的影响目前了解的比较少，甚至存在比较大的分歧。本论 文以斜带石斑鱼d e s a c y lg h r e l i n 为对象，主要研究结果如下： 1 在本实验室前期工作的基础上，以已经克隆得到g h r e l i n 的e d n a 为模板， 分别在上游引物和下游引物带上酶切位点( ) ( b a i ，n o t i ) ，以e d n a 为模板扩增出 目的条带，构建了毕赤酵母表达载体p p i c z o a o g h r ，并获得了诱导型分泌表达 重组d e s a c y lo h r e l i n 的x - 3 3 菌株，筛选出高拷贝的阳性克隆，表达目的蛋白， 优化表达条件。 2 给斜带石斑鱼腹腔注射不同剂量的i ) e s a c y lo h r e l i n ( 1 蚓gb w 和2p g 倌 b w ) 3 h ，6 h 后均能使斜带石斑鱼垂体的生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，g h ) m r n a 的表达水平升高，而且剂量越高，作用时间越长，这种作用越明显。腹腔注射不 同剂量的d e s a c y lg h r e l i n ( 1p g 儋b w 和2 鸺gb w ) 3 h , 6 h 后均能使斜带石斑 鱼下丘中的神经肽y ( n e u r o p e p t i d ey ，n p y ) m r n a 的表达水平降低其中注射 中山大学硕士学位论文 2 0 1 0 年5 月 不同剂量d e s a c y lg h r e l i n ( 1 u g g b w 和2 u g gb w ) ，作用时间为6 h 与对照组相比， 表现出极显著差异( p 0 0 1 ) ；腹腔注射d e s a c y lg h r e l i n ( 2r t g gb w ) 作用时间 6 h 后斜带石斑鱼下丘中生长抑素i 型前体( p r e p r o s o m a t o s t a t i ni ，p s s i ) m r n a 表 达量升高与对照组相比表现出显著差异( p o 0 5 ) ；腹腔注射不同剂量的d e s a c y l g h r e l i n ( 1p g 儋b w 和2p g 儋b w ) 6 h 后均能使斜带石斑鱼下丘中的促生长激 素释放a 型受体( g r o w t hh o r m o n es e c r e t a g o g u er e c e p t o r ，g h s r - l a ) m r n a 的 表达水平降低表现出极显著差异( p o 0 1 ) 3 对斜带石斑鱼下丘碎片和垂体细胞进行孵育实验，不同剂量的d e s a c y l g h r e l i n 孵育下丘脑的碎片时，随着d e s a c y lg h r e l i n 剂量的增高，n p y 的m r n a 的水平逐渐降低，在1 0 0 0 n m 的时候n p y 的m r n a 表达水平达到最低值，与对 照组的n p y 的m r n a 的水平相比有极显著差异( p 0 0 1 ) ；抑制下丘脑g h s r - l a 的m r n a 的表达，在d e s a c y lg h r e l i n 浓度达到1 0 0 0 n m 的时候g h s r - i am r n a 与对照组的g h s r - l a 的m r n a 的水平相比有显著差异( p 0 0 5 ) ；促进下丘 脑p s s i 的m r n a 的表达，在d e s a c y lg h r e l i n 浓度达到1 0 0 0 n m 时与对照组相比 有显著差异( p 0 0 5 ) ；随着剂量的增高，g h 的m r n a 的水平也逐渐增高， 在1 0 0 0 r i m 的的时候g h 的m r n a 表达水平达到最高值，与对照组的g h 的 m r n a 的水平相比有极显著差异( p 0 0 1 ) 。 4 化学合成了斜带石斑鱼g h r e l i n 以及s e r 3 非辛酰化修饰的d e s a c y lg h r e l i n 蛋白，采用喷涂法拌入常规饵料中，对鱼龄八个月的石斑鱼进行5 0 天的投喂实 验显示d e s a c y lg h r e l i n 对鱼的体重，体长有明显的促进作用，g h r e l i n 则无明显 作用；投喂含有斜带石斑鱼g h r e l i n 的饵料，检测g h ，n p y ，g h s r - l a 的m r n a 水平发现，其均有促进作用，d e s a c y lg h r e l i n 对g h ，g h s r 1 a 的m r n a 无明显 的影响作用，但是对n p y 有促进作用。 关键词：斜带石斑鱼、d e s a c y lg h r e l i n 、毕赤酵母、表达、活性分析 h 中山大学硕士学位论文2 0 1 0 年5 月 t i t l e ：s e c r e t o r ye x p r e s s i o n o fr e c o m b i n a n td e s a c y lg h r e l i no f o r a n g e - s p o t t e dg r o u p e r ( e p i n e p h e l u sc o i o i d e s ) i np i c h i ap a s t o r i sy e a s t a n da n a l y s i so fi t sb i o l o g i c a le f f e c t s m a j o r ：m a r i n eb i o l o g y n a m e ：w ul i j u a n s u p e r v i s e r ：p r o f l i nh a o r a n ( a c a d e m i c i a n ) c o s u p e r v i s o r ：p r o f l iw e n s h e n g a b s t r a c t o r a n g e - s p o t t e dg r o u p e r , e p i n e p h e l u sc o i o i d e s ，i so n eo ft h ep o p u l a rm a r i n e a q u a c u l t u r et e l e o s t si ns o u t h - e a s ta n ds o u t hc h i n a b e c a u s eo fi t si m p o r t a n t c o m m e r c i a lv a l u e ，m a n ys t u d i e so fg r o u p e rh a v eb e e nc a r r i e do u t g h r e l i ni sa g a s t r o i n t e s t i n a lh o r m o n e ，o fw h i c ht h et l l i r ds e r i n er e s i d u ei su n i q u e l ym o d i f i e db y o c t a n o y l a t i o n , a n dt h i sa e y l a t i o ni se s s e n t i a lf o rb o t l lb i n d i n g t oi t sr e c e p t o rg h s r i a a n de l i c i t i n gb i o l o g i c a la c t i v i t y b e s i d e sg h r e l i nt h e r ea r et w om o r ed i f f e r e n t m o l e c u l e st h a to r i g i n a t ef r o mt h es a m ep r e c u r s o rm o l e c u l e ，p r e - p r o g h r e l i n d i f f e r e n t m e a n so fp o s t - t r a n s l a t i o n a lp r o c e s s i n gr e s u ri nt h ef o r m a t i o no fd e s a c y lg h r e l i na n d o b e s t a t i n u n t i lt o d a y ，t h e r ea l es t u d i e so n l yf o rg h r e l i np r o v i d i n gw e l l e s t a b l i s h e d a n dr e p e a t e d l yv a l i d a t e di n s i g h t so ni t sr e g u l a t o r ye f f e c to ns a t i e t ya n df o o di n t a k e t h es i g n a lt r a n s d u c i n gp a t h w a y so fg h r e l i nh o w e v e ra r co n l yi np a r tw e l li d e n t i f i e d y e tt h ee f f e c t so fd e s a c y lg h r e l i na n do b e s t a t i no nf e e d i n gb e h a v i o rs t i l lr e m a i n l a r g e l yu n k n o w na n da r eb e i n gc o n t r o v e r s i a l l yd i s c u s s e di nt h er e c e n tl i t e r a t u r e i n t h i st h e s i s ，t h em a j o rr e s u l t sa r e 鹄f o l l o w s ： i 中山大学硕士学位论文2 0 1 0 年5 月 i i nt h ee a r l ys t u d yo fo u rl a b o r a t o r y ，t h eo r a n g e s p o t t e dg r o u p e rc d n aa n d g e n es e q u e n c e so fg h r e l i nh a v eb e e nc l o n e d t h ee d n af r a g m e n te n c o d i n gt h em a t u r e d e s a c y lg h r e l i nw a ss u b c l o n di n t ot h ev e c t o rp p i c z o a a f t e rt r a n s f o r m a t i o na n d s c r e e n i n g ，h i g he x p r e s s i o nx 一3 3e n g i n e e r e ds t r a i n sw a so b t a i n e d ，w h i c hc a nh i g h l y e x p r e s st h er e c o m b i n a n td e s a c y lg h r e l i n w i t l ls e c r e t a r yf o r m 2 t h ee f f e c t so fd e s a c y lg h r e l i ni nt h eo r a n g e s p o t t e dg r o u p e rh y p o t h a l a m u sa n d p i t u i t a r yw e r ei n v e s t i g a t e db yi nv i v oo fi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n f o rt h e nv i v o s t u d i e s ，t h ed o s eo f1l x g gb wa n d2l - t g gb w d e s a c y lo h r e l i nc a ni n c r e a s et h e e x p r e s s i o no fg hm r n as i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) a f t e ri n j e c t i o nd e s a c y lo h r e l i n3 h r o r 6 h r d e s a c y lg h r e l i nc a u s e das i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nt h el e v e l so fg h m r n ao f p i t u i t a r yi nb o t hd o s ea n dt i m e - d e p e n d e n tm a n n e r s ( p 0 0 5 ) t h ed o s eo f1l a g gb w a n d2j - t g gb w ：d e s a c y lg h r e l i nc a nd e c r e a s et h ee x p r e s s i o no fn p ym r n a s i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) a f t e ri n j e c t i o nd e s a c y lg h r e l i n3 h r ，w h i l ed e s a c y lg h r e l i nc a n d e c r e a s et h ee x p r e s s i o no f n p ym r n a s i g n i f i c a n t l y ( p o 0 1 ) a f t e ri n j e c t i o nd e s a c y l g h r e l i n6 h r t h ed o s eo f1l a g gb wa n d2p gb w d e s a c y lg h r e l i nc a nd e c r e a s e t h ee x p r e s s i o no fg h s r - lam r n a s i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) a f t e ri n j e c t i o nd e s a c y l g h r e l i n6 h r t h ed o s eo f2j t g gb w ：d e s a c y lg h r e l i nc a l li n c r e a s et h ee x p r e s s i o no f p s s im r n a s i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) a f t e ri n j e c t i o nd e s a c y lg h r e l i n 6 h r 3 t h ee f f e c to fd e s a c y lg h r e l i ni nt h eo r a n g e s p o t t e dg r o u p e rh y p o t h a l a m u sa n d p i t u i t a r yw a si n v e s t i g a t e db y nv i t r os t a t i cc u l t u r e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t10 0 0 n m d e s a c y lg h r e l i nl e dt os i g n i f i c a n td e c r e a s en p ym r n al e v e la t6 h ri f , 0 01 ) t h e d o s eo f10 0 0 n md e s a c y lg h r e l i ns i g n i f i c a n t l yd e c r e a s et h ee x p r e s s i o no fg h s r - la m r n ai nh y p o t h a l a m u s ( p o 0 5 ) a t6 h r h o w e v e r ，t h ed o s eo f10 0 0 n md e s a c y l g h r e l i ns h o w e dt h es i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nt h ee x p r e s s i o no ft h ep s s im r n ai n h y p o t h a l a m u si f , o 0 5 ) d e s a c y lg h r e l i nc a ni n c r e a s eg h m r n al e v e l ，w h i l et h e h i g i ld o s e o fl0 0 0 n md e s a c y lg h r e l i ns h o w e dt h e s i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nt h e e x p r e s s i o no ft h eg hr n r n a i np i t u i t a r y ( p o o1 ) a t6 h r 4 w ea r t i f i c i a l l ys y n t h e s i z e dt h ep r o t e i n so fo r a n g e s p o t t e dg r o u p e rg h r e l i na n d d e s a e y lg h r e l i n ，o fw h i c ht h e “r ds e r i n er e s i d u eh a sn o to c t a n o y l a t i o n w i t hm i x i n g a n ds t i r i n gm e t h o d s ，w eb l e n d e dt h ep r o t e i n 晰t l lr o u t i n ed i e t ，a n df e e d e dt h e 中山大学硕士学位论文 2 0 1 0 年5 月 o r a g e s p o t t e dg r o u p e r sa tt h ea g eo fe i g h tm o n t h sf o r v c l lw e e k s d e s a c y lg h r e l i n h a si m p a c to nb o d yw e i g h ta n db o d yl e n g t hb u tg h r e l i nh a sn ot h i sf u n c t i o n h o w e v e r , g h r e l i nc a ni n c r e a s et h eg hm r n a ，n p ym r n a a n dg h s r - lam r n al e v e l ，w h i l e d e s a c y l o h r e l i ne a r lo n l yi n c r e a s et h e e x p r e s s i o n o ft h en p ym r n ai n h y p o t h a l a m u s k e yw o r d s ：e p i n e p h e l u sc o i o d e s ；d e s a c y lg h r e l i n ；p i c h i ap a s t o r i sy e a s t ；e x p r e s s i o n ； b i o l o g i c a la c t i v i t y v 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：试确桶 e l 期：- 弘, o 年6 月 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，i l l ：l ：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：试矾强 日期：枷p 年6 月岔日 中山大学硕士学位论文2 0 1 0 年5 月 前言 刖吾 1d e s a c y lg h r e l i n 研究进展 鱼类的生长和哺乳动物相似，是一个受多种因素影响的高度协同的复杂生理 过程。各种因素对生长的调节最终是通过神经内分泌信号的整合、调控来实现的。 研究发现下丘脑( 分泌各种神经内分泌因子) 一垂体( 分泌生长激素) 一肝脏( 分 泌类胰岛素样生长因子) 组成的神经内分泌轴是调控生长的核心。脑肠肽 ( g h r e l i n ) 是由胃肠道合成和分泌，通过血液循环进入中枢神经系统与外周组织。 早期研究发现，中枢神经系统中，g h r e l i n 与受体g h s r - i a 结合，促进g h 生长轴的 中心环节- 生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，g h ) 的释放。g h r e l i n 有两种不同的形 式，它们都是由同一前体p r e p r o g h r e l i n 得到，由于翻译后进行了不同的修饰形成 了不同形式的g h r e l i n 和d e s a c y lg h r e l i n 。哺乳动物中g h r e l i n 是一段由2 8 个氨基酸 组成的活性多肽，s e r 3 具有辛酰化修饰。早期研究表明，s e r 3 被辛酰化修饰是 g h r e l i n 具有生物学活性的必要条件，而s e r 3 没有被辛酰化修饰的d e s a e y lg h r e l i n 没有生物学活性。 到目前为止，有关于g h r e l i n 在促进生物体摄食方面的研究已进行的很详细， 但是对于g h r e l i n 的信号介导途径还不是很清楚。对于s e r 3 没有被辛酰化修饰的 d e s a c y lg h r e l i n 由于早期认为其没有生物学活性，所以研究的更少，学者们对于 d e s a c y lg h r e l i n 在调节生物体摄食行为的研究方面存在很大的分歧。最近有学者 从生理学和药理学等方面研究表g 且d e s a c y lg h r e l i n 存在生物学活性，研究表明其 具有可以促进脂肪的生成，阻止内皮细胞凋亡，抑制肝脏细胞的葡萄糖输出，抑 制乳癌细胞的增殖等生物学活性( g a u n ae ta 1 ，2 0 0 5 ) 。最近关于d e s a c y lg h r e l i n 的 生物学活性的研究，见表1 1 中山大学硕士学位论文2 0 1 0 年5 月 表l 一1s t u d i e sa s s e s s i n gt h ep h y s i o l o g i c a le f f e c t so f d e s a c y lg h r e l i n r e f e r e n c e p h y s i o l o g i c a le f f e c t so f d e s a c y lg h r e l i n ( c a s s o n ie ta 1 ，2 0 01 ) i n h i b i t i o no ft h ep r o l i f e r a t i o no fb i e a s tc a n c e rc e l l s ( b a l d a n z ie ta 1 ，2 0 0 2 )c y t o p r o t e c t i v ee f f e c t so nc a r d i o m y o c y t e s a n de n d o t h e l i a lc e l l s ( b e d e n d ie ta 1 ，2 0 0 3 ) r e d u c t i o no f t e n s i o no f c a r d i a lp a p i l l a r ym u s c l e s ( c a s s o n ie ta 1 ，2 0 0 4 ) c o n t r o lo fc e l l u l a rg r o w t hi np r o s t a t i cc a r c i n o m a ( t h o m p s o ne ta 1 ，2 0 0 4 ) i n h a n c e m e n ti nb o n em a r r o wa d i p o g e n e s i so fl o n gb o n e s ( g a u n ae ta 1 ，2 0 0 7 )r e g u l a t i o no fg l u c o s em e t a b o l i s ma n di n s u l i ns e c r e t i o n 硬骨鱼中，已经在金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 、日本鳗鲡( a n g u i l l a j a p o n i c a ) 、 鲶鱼( i c t a l u r u sp u n c t a t u s ) 、虹鳟( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 、尼罗罗非( t i l a p i a o r e o c h r o m i sn i l o t i c u s ) 、莫桑比克罗非( o r e o c h r o m i sm o s s a m b i c u s ) 、黑鲷 ( a c a n t h o p a g r u ss c h l e g e l i ) 、黑鲈( d i c e n t r a r c h u sl a b r a x ) 、以及斜带石斑鱼 ( e p i n e p h e l u sc o i o i d e s ) 中鉴定出g h r e l i n 基因。越来越多的证据表明，外周组织 中，g h r e l i n 通过g h s r - l a 以及其它受体，调节机体能量平衡以及营养代谢过程。 同时，g h r e l i n 还具有能改善睡眠与记忆，参与消化系统，心血管系统，免疫系统 以及生殖系统等生物学功能。 1 1 d e s a c y lg h r e l i n 的发现 1 1 1 促生长激素释放素( g h s ) 1 9 8 0 年，b o w e r s 等发现一些类吗啡多肽衍生物虽然没有类吗啡的活性，但这 些类吗啡多肽衍生物可以促进生长激素释放，他们把这类物质统称为促生长激素 释放素( g r o w t hh o r m o n es e c r e t a g o g u e ，g h s ) ( b o w e r se ta 1 ，1 9 8 0 ) 。早期合成的 g h s 对g h 的刺激效果非常微弱，只能在离体实验中检测到其促进生长激素释放 的功能。1 9 8 4 年，b o w e r s 等通过人工合成得到一种六肽，无论是在在体条件还是 在离体条件下，这种人工合成的六肽均能强烈的刺激g h 释放，这一发现预示着 将g h s i 临床运用成为可能( b o w e r se ta 1 ，1 9 8 4 ) 。1 9 9 5 年，p a t c h e t t 等发现一种非肽 2 中山大学硕士学位论文2 0 1 0 年5 月 类g h s ( m k 0 6 6 7 ) ，它对g h 的刺激更加明显，口服就能发挥功效( p a t c h e t tc ta 1 ， 1 9 9 5 ) ，非肽类g h s ( m k 0 6 6 7 ) 是第一个运用于临床研究的g h s ( t h o r n e re ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。 1 1 2 促生长激素释放素受体( g h s r ) 1 9 9 7 年，h o w a r d 等用克隆表达的方法找到g h s 的受体g h s r - l a ，g h s r - 1 a 是典型的七次跨膜g 蛋白偶联受体。原位杂交显示，g h s r 的基因在垂体，下丘， 海马回中均有表达( b e n n e t te ta 1 ，1 9 9 7 ；g u a ne ta l ，1 9 9 7 ) 。此外，g h s r 基因还存 在第二种转录本g h s r - l b ，但g h s r - l b 无法与g h s 结合，也没有促g h 释放的活力 ( h o w a r dc ta 1 ，1 9 9 6 ) ，一般认为g h s r - l b 是一种非活性形式。因此，对于g h s r - l b 的研究也相对比较少。 1 1 3g h s r 内源配体g h r e l i n 1 9 9 9 年，k o j i m a 等在大鼠与人类的胃组织中成功分离得至i j g h s r 的内源性配 体，命名为g h r e l i n 。它是一段由2 8 个氨基酸组成的活性多肽，其第三位丝氨酸被 辛酰化修饰，是目前发现唯一被辛酰化修饰的多肽( k o j i m ae ta 1 ，19 9 9 ) 。g h r e l i n 的发现历史，见表1 2 表1 2t h eh i s t o r yo fg h r l e i nd i s c o v e r y ( g h r e l i n 的发现史) 年份进展文献 3 中山大学硕士学位论文2 0 1 0 年5 月 1 9 9 3第一个非肽g h s ( s m i t h e ta 1 ，1 9 9 3 ) 1 9 9 5 发现更加高效的非肽( p a t c h e t te ta 1 ，19 9 5 ) g h s ，m k 0 6 6 7 19 9 6发现g h s 受体，g h s r ( h o w a r de ta 1 ，19 9 6 ) 19 9 9 发现g h r e l i n ( k o j i m ae ta l ，19 9 9 ) 1 2d e s a c y lg h r e l i n 的结构 1 2 1d e s a c y lg h r e l i n 基因 d e s a c y lg h r e l i n 的核酸序列与g h r e l i n 是一样的，只是d e s a c y lg h r e l i n 缺少s e r 3 的辛酰化修饰。人类g h r e l i n 基因以单拷贝定位于染色体3 p 2 5 - 2 6 。同样，g h r e l i n 受体基因g h s r 也在第3 染色体，定位于q 2 6 - 2 7 位置( k o j i m a e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。人类与 小鼠的g h r e l i n 基因很相似，都是由5 个外显子组成( s m i t he ta 1 ，1 9 9 7 ；k a n a m o t oe t a 1 ，2 0 0 4 ) 。其中，外显子1 仅长2 0 b p ，编码5 非翻译区，2 8 肽的g h r e l i n 功能蛋白 由外显子2 和3 编码。( g h r e l i n 基因结构见图1 1 ) 。同时，人类与大鼠g h r e l i n 基 因在5 侧翼含有一段保守的t a t a t a a 序列，是t a t a - b o x 类似序列，作为启动子， 与多个转录因子结合。由此可见，哺乳动物的g h r e l i n 基因在外显子和内含子组成 上很相似，启动子在结构上是高度保守的。硬骨鱼中，已报道g h r e l i n 基因序列 与外显子内含子结构的种类有四种，金鱼( t a n a k ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 、尼罗罗非鱼 ( u n n i a p p a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 、虹鳟( p a r h a re ta 1 ，2 0 0 3 ) 、黑鲷( k a i y ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。与哺 乳动物相同，虹鳟g h r e l i n 基因由5 个外显子和4 个内含子组成。而金鱼，尼罗罗非， 黑鲷g h r e l i n 基因仅包含4 外显子和3 个内含子，没有发现类似哺乳类g h r e l i n 基因的 非编码区段外显子1 。 4 巾山大学碰学位论文2 0 1 0 年5 月 o0345 l ，li-卦 c r j , “5 j ”d n 0 p r 。p 。o g hr c i “ 1 n r e dl _ _ 45 1 ，5 1 ， _ tm m s _ o l 7 b2 9 o _ m d t 9 hr e f i ncq h f e l i n 1 z o 一 1 图卜1 g e n e t i cs t r u c t u r e a n d p r o t e i n p r o c e s s i i l go f h u m a n g h r e l i n ( 人类g h r e l i n 基因结构与蛋白剪切图，参, 照( y e u n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) ，有修改) 122d e s a e y lg h r e l i n 前体蛋白 哺乳动物d e s a e y lg h r e l i n 前体氨基酸序列高度保守，人类和啮齿动物d e s a c y l g h r e l i n 前体包含1 1 7 个氨基酸，它是由2 3 个氢基酸组成的信号肽，2 8 个氨基酸组 成的d e s a c y lg h r e l i n 成熟肽和6 6 个氨基酸组成的c 末端构成的( p e m b e r t o n a n d r i c h a r d s ，2 0 0 8 ) 。d e s a c y lg h r e l i n 前体经过内质网后，信号肽被切掉，形成由9 4 个氨基酸组成的d e s a c y l g h r e l i n 原蛋白。随后，激素原转化酶1 3 ( p c i 3 ) 潲1 剪 切位点p r 0 2 7 - a r 9 2 8 ，在a r 9 2 8 _ a l a 2 9 位置切开d e s a c y l g h r e l i n 原蛋白，形成d e s a c y l g i n - d i n 成熟肽与c 末端多肽( k o j i m a a n d k a n g a w a 2 0 0 5 ) 。c 未端多肽可由6 6 个氪 基酸组成的完整形式存在于循环系统，也能进一步剪切形成由2 3 个氨基酸组成的 多肽o b e s t a t i n ，两种形式可能均有重要生理功能( z h ue ta l ，2 0 0 6 ) 。人类d e s a c y l g h r e l i n 蛋白剪切过程见图1 i 。硬骨鱼中，d e s a c y l g h r e l i n 前体蛋白氨基酸长度 存在很大差异，大西洋鲑鱼为1 1 1 个氨基酸，而金鱼仅为1 0 3 个氩基酸。和哺乳动 物一样，d e s a c y l g h r e l i n 前体蛋白由信号肽，d e s a c y l g h r e l i n 成熟肚，c 末端多 肽组成。其中，c 术端多肽保守性不高，而且没有哺乳类中明显的蛋白剪接位点。 值得注意的是斑马鱼d e s a c y lo h r e l i n 的c 术端具有一段类似哺乳类o b e s m t m 的氨 基酸序列，且在胚胎发育阶段发挥功能，推测鱼类中同样存在o b e s t a t 鲥s o a r e sa n d 中山大学硕士学位论文2 0 1 0 年5 月 l e i t e - m o r e i r a , 2 0 0 8 ) 。 1 2 3d e s a c y lg h r e l i n 成熟肽 哺乳动物中，d e s a c y lg h r e l i n 是一个由2 8 个氨基酸组成的多肽，它的氨基酸 序列与g h r e l i n 是一样的，只是在s e r 3 未被辛酰化修饰。s e r 3 被辛酰化修饰的 g h r e l i n 可以与促生长激素分泌受体g h s r - l a 结合，促进生长激素g h 的释放；相 反的d e s a e y lg h r e l i n 却不能与促生长激素分泌受体g h s r 1 a 相互作用。基于 d e s a c y lg h r e l i n 不能与促生长激素分泌受体g h s r 1 a 相互作用，起初对于d e s a c y l g h r e l i n 没有做进一步的研究，而且d e s a c y lg h r e l i n - - 直被认为是g h r e l i n 降解过程 中产生的中间产物( k o j i r n ae ta 1 1 9 9 9 ) 。 d e s a c y lg h r e l i n 是由胃黏膜和血浆中的g h r e l i n 通过脱酰基作用形成的，参与 这一脱酰基的酶有酯酶和溶血磷脂酶i ( d ev r i e s ee ta 1 ，2 0 0 4 ；s h a n a d oe ta 1 ， 2 0 0 4 ) 到目前为止还没有证据显示这种脱酰基作用是否是d e s a c y lg h r e l i n 形成的 唯一途径或者这种途径是从前体p r o g h r e l i i l 形成d e s a c y lg h r e l i n i 拘直接方式。根据 最近的研究显示，d e s a c y lg h r e l i n 不是g h r e l i n 形成过程中的中间代谢产物，前体 p r o g h r e l i n 在进入到高尔基体前就被g h r e l i n 酰基转移酶( g o a t ) 催化修饰，之 后进入高尔基体被激素原转化酶1 3 ( p c i 3 ) 识别剪切，形成成熟的g h r e l i n 多肽， 随后g h r e l i n 耋；肽被高尔基体分泌离开细胞( y a n ge ta 1 ，2 0 0 8 ) 。而在这之前就有学 者指出m e l i i l 的翻译后修饰与前体p r o g h r e l i n 的蛋白水解过程没有关系，随后的 证据显示在g h r e l i n 的形成过程中存在d e s a c y lp r o - g h r e l i n 而非d e s a c y lg h r e l i n ( z h u e ta 1 ，2 0 0 6 ) 虽然到目前为止还不知道d e s a c y lg h r e l i n 确切的形成部位，但是已经 检测到d e s a c y lg h r e l i n 广泛存在于胃肠道，血浆，下丘和脑垂体q b ( h o s o d ae ta 1 ， 2 0 0 0 ；d a t ee ta 1 ，2 0 0 0 ；k o r b o n i t se ta 1 ，2 0 01 ；d a t ee ta 1 ，2 0 0 2 ；s a t oc ta 1 ，2 0 0 5 ； a r i y a s ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 d e s a c y lg h r e l i n 在生物体的总量要大大多于g h r e l i n 在生物体的总量，大约 5 0 6 0 的g h r e l i n 在胃黏膜细胞内贮存，而相当于生物体g h r e l i n 总量的 8 0 9 8 的d e s a c y lg h r e l i n 存在于血浆中( h o s o d ae ta 1 ，2