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微生物检验技术基础知识 制剂中心药检室张文20160225 目录 一 微生物基本介绍二 培养基三 菌种四 微生物限度检查法 一 微生物基本介绍 1 微生物的定义微生物是一些形体微小 以单细胞或简单多细胞 甚至是没有细胞结构的形式存在的低等生物的统称 2 微生物的分类微生物的主要分类单位 域 界 门 纲 目 科 属 种 变种 亚种 小种 型 菌株 品系 种 是最本的分类单位 例 大肠埃希菌 一 微生物基本介绍 3 微生物的特点体形微小 结构简单 生长繁殖快 种类繁多 分布广 适应性强 包括 细菌 酵母菌 霉菌 放线菌 立克次氏体 支原体和病毒等 一 微生物基本介绍 4 1细菌药典收录的有代表性的常见细菌有1大肠埃希菌2金黄色葡萄球菌3枯草芽孢杆菌4生孢梭菌5铜绿假单胞菌 1大肠埃希菌 大肠埃希氏菌 Escherichiacoli 通常被称为大肠杆菌 是Escherich在1885年发现的 在相当长的一段时间内一直被当作正常肠道菌群的组成部分认为是非致病菌 一般多不致病 为人和动物肠道中的常居菌 在一定条件下可引起肠道外感染 某些血清型菌株的致病性强 引起腹泻 统称致病性大肠杆菌 人体感染致病EHEC后 会发生严重的痉挛性腹痛和反复发作的出血性腹泻 同时伴有发热 呕吐等表现 多为EHEC产生的毒素所致 2金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌 可引起局部化脓感染 也可引起肺炎 伪膜性肠炎 心包炎等 甚至败血症 脓毒症等全身感染 金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 是人类的一种重要病原菌 隶属于葡萄球菌属有 嗜肉菌 的别称 是革兰氏阳性菌的代表 可引起许多严重感染 2金黄色葡萄球菌 典型的金黄色葡萄球菌为球型 直径0 8 m左右 显微镜下排列成葡萄串状 3枯草芽孢杆菌 枯草芽胞杆菌 是芽胞杆菌属的一种 单个细胞0 7 0 8 2 3微米 着色均匀 无荚膜 周生鞭毛 能运动 革兰氏阳性菌 芽孢0 6 0 9 1 0 1 5微米 椭圆到柱状 位于菌体中央或稍偏 芽孢形成后菌体不膨大 菌落表面粗糙不透明 污白色或微黄色 在液体培养基中生长时 常形成皱醭 需氧菌 4生孢梭菌 生孢梭菌 Clostridiumsporogenes 又译产孢梭菌 能够产生孢子 革兰氏染色阳性 以周生鞭运动 严格厌氧的梭菌 5铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌的学名是Pseudomonasaeruginosa 绿脓假单胞菌属为革兰染色阴性需氧菌 存在于土壤 尘埃 水和少数人体肠道中 亦可暂时寄生于皮肤 主要寄生在肛门 生殖器部位 腋窝和外耳道等处 在正常情况下一般不致病 当机体抵抗力低下时可致病 还可引起病人死亡 细菌鉴别革兰氏染色 格兰仕阳性菌例如 金黄色葡萄球菌 也称 金葡菌 细胞壁含90 的肽聚糖和10 的磷壁酸 其肽聚糖的网状结构比革兰氏阴性菌致密 染色时结晶紫附着后不被酒精脱色故而呈现紫色革兰氏阴性菌例如 大肠埃希菌的细胞壁肽聚糖层薄 交联度差 脂类含量高 所以紫色复合物被酒精冲掉然后附着了沙黄的红色 革兰氏染色 革兰氏染色法一般包括初染 媒染 脱色 复染等四个步骤 具体操作方法是 1 涂片固定 2 草酸铵结晶紫染1分钟 3 自来水冲洗 4 加碘液覆盖涂面染约1分钟 5 水洗 用吸水纸吸去水分 6 加95 酒精数滴 并轻轻摇动进行脱色 20秒后水洗 吸去水分 7 蕃红染色液 稀 染1分钟后 自来水冲洗 干燥 镜检 染色结果革兰氏阳性菌呈蓝紫色 革兰氏阴性菌呈红色 染色结果革兰氏阳性菌呈蓝紫色 革兰氏阴性菌呈红色 一 微生物基本介绍 4 2真菌 包括酵母菌和霉菌 1黑曲霉菌2白色念珠菌 1黑曲霉菌 黑曲霉 半知菌亚门 丝孢纲 丝孢目 丛梗孢科 曲霉属真菌中的一个常见种 广泛分布于世界各地的粮食 植物性产品和土壤中 2白色念珠菌 白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂白色念珠菌 白色念珠菌 Moniliaalbican或canidiaAlbicans 是一种真菌 通常存在于正常人口腔 上呼吸道 肠道及阴道 是医学全身性真菌感染病的重要途径 可以引起心膜炎 肺炎 尿布疹 鹅口疮 阴道炎 脑膜炎 及败血症 白色念珠菌 右图 白色念珠菌在该批念珠菌显色对照培养基表面培养48小时的生长形态 左图 白色念珠菌在该批念珠菌显色对照培养基表面培养24小时的生长形态 一 微生物基本介绍 5 微生物与我们每张人民币带细菌 900万个 人体体表及体内存在大量的微生物 皮肤表面 平均10万个细菌 平方厘米 口腔 细菌种类超过500种 肠道 微生物总量达100万亿 未清洗的手 清洗过的手 一 微生物基本介绍 二 培养基 1 培养基的制备培养基的配制 按处方配制 使用按处方生产的符合规定的脱水培养基 二 培养基 配制时注意 不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基 常用的溶剂是纯化水 蒸馏水 避免使用自来水 因其中含有氯等抗菌物质 脱水型培养基应完全溶解于水中 再分装灭菌 加热助溶 注意不要过度加热 如需要添加其它组分 加入后应充分混匀 配制用的容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器 配制培养基一般要在1小时内完成 如果室温高 配制时间过长 易使培养基受污染 二 培养基 2 培养基的灭菌已配制好的培养基最好尽快灭菌 一般培养基采用湿热灭菌 即高压蒸汽菌 通常是121 15分钟 湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间 不可重复高温灭菌 高压蒸汽灭菌锅在使用时 内置物品不能太多 不要堆积形成死角 要定期对压力表等进行检定 检定周期一般为半年 定期对灭菌效果进行检验 可采用生物指示菌法 化学变色纸片 如湿热灭菌指示条 等进行验证 二 培养基 3 培养基的贮藏贮藏注意 灭菌后的培养基应迅速取出 避免长时间保存在灭菌锅内 造成过度灭菌 培养基保存前应标上名称和制备日期 或到期日期 琼脂培养基不得在0 或0 以下存放 琼脂平板最好现配现用 如置冰箱保存 在验证的期限内使用 药典规定3周内使用 有密封装置的培养基可以保存一年 二 培养基 4 培养的再融化方式水浴加热微波炉电热炉加热注意 固体培养基灭菌后的再融化只允许一次融化的培养基应置于45 50 的水浴中 不得超过8小时 二 培养基 5 培养基的性能评估所有购回的 配制好的培养基均应进行质量控制试验 培养基适应性检查 理化指标 P55 微生物学指标 P55 购买的成品培养基配方与药典配方核对 中检院购买的对照培养基 三 菌种 1 分类 概念 2019 12 19 31 可编辑 三 菌种 注意 标准储备菌株 工作菌株都应进行纯度和特性确认工作菌株的传代次数不得超过5代 从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代 1代 是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养 实验室必须建立和保存其所有菌种的进出 收集 贮藏 保存 确认试验及销毁的记录 三 菌种 标准菌株 冻干粉 图P63 甘油冻存管 图P64 三 菌种 菌种保藏机构 CMCC中国医学微生物菌种保藏管理中心GIMCC广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心ATCC美国典型菌种保藏中心例 CMCC B 26003菌种保藏机构细菌菌种编号 金黄葡萄球菌 三 菌种 2 菌种的鉴定金黄色葡萄菌CMCC B 26003甘露醇平板上划线分纯 典型菌落为黄色圆形突起 表面湿润光滑 革兰氏染色 阳性 球菌 血浆凝固霉酶实验 阳性 三 菌种 2 菌种的鉴定大肠埃希菌CMCC B 44102大肠埃希菌在麦康凯培养基上的菌落形态特征 鲜桃红色或微红色 菌落中心呈深桃红色 圆形 扁平 边缘整齐 表面光滑 湿润革兰氏染色 阴性 杆菌 大肠埃希菌 Escherichiacoli 供试液制备和增菌培养取供试品 照 非无菌产品微生物限度检查 微生物计数法 通则1105 制成1 10供试液 取相当于1g或1mL供试品的供试液 接种至适宜体积 经方法适用性试验确定的 的胰酪大豆胨液体培养基中 混匀 30 35 培养18 24小时 大肠埃希菌 Escherichiacoli 选择和分离培养取上述预培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中 42 44 培养24 48小时 取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上 30 35 培养18 72小时 大肠埃希菌 Escherichiacoli 结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长 应进行分离 纯化及适宜的鉴定试验 确证是否为大肠埃希菌 若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长 或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性 判供试品未检出大肠埃希菌 三 菌种 铜绿假单胞菌CMCC B 10104溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上划线分纯 典型菌落呈扁平 无定形 周边扩散 表面湿 灰白色 周围有蓝绿色素扩散 氧化酶实验 阳性绿脓菌素 阳性革兰氏染色 阴性 杆菌 三 菌种 白色念珠菌CMCC B 98001沙氏葡萄糖琼脂平板上划线分纯 典型菌落乳白色 表面光滑有浓酵母气味 革兰氏染色 阳性 菌体大 球菌 芽管试验 阳性 三 菌种 3 菌种的保藏A 甘油冷冻管保藏法保藏温度 30 80 保藏菌种有效期 1 2年优点 保存期较长 反复传代导致菌种变异的风险较小 缺点 操作相对复杂 成本较高 B 斜面低温保藏法保藏温度4 左右 保藏时间1 3个月 但铜绿假单胞菌不宜用本法保存 优点 操作简便 成本低 比较容易掌握 缺点 保存期比较短 反复传代有引起变异的可能 甘油冷冻管保存菌种 甘油冷冻管保存菌种 甘油冷冻柜保存菌种 三 菌种 4 菌种的使用和销毁过期菌种应及时销毁 销毁时应经121 30分钟的生物灭活处理 121 45min高温蒸汽灭活 并进行菌种销毁记录 四 微生物限度检查法 1 定义微生物限度检查法 系检查非规定灭菌制剂及其原料 辅料受微生物污染程度的方法 2 检查项目定量检查 细菌数 霉菌及酵母菌数定性检查 控制菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 白色念球菌 检验环境 与无菌检查相同 四 微生物限度检查法 3 检验量指一次检验用量 10g或10ml 膜剂为100cm2 贵重药品 微量包装药品的检验量可以酌减 4 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物特性 采取适宜的方法制备供试液 供试液制备若需加温时 应均匀加热 且温度不超过45 四 微生物限度检查法 制备原则 简便 快速 供试液从制备至加入检验用培养基 不得超过1小时 四 微生物限度检查法 供试品分类液体供试品固体 半固体或黏稠性供试品需用特殊供试液制备方法的供试品非水溶性供试品膜剂供试品肠溶及结肠制剂供试品气雾剂 喷雾剂供试品贴膏剂供试品具抑菌活性的供试品 培养基稀释法 离心沉淀法 薄膜过滤法 中和法 四 微生物限度检查法 5 方法验证5 1验证菌株大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉5 2计数方法的验证当建立产品的微生物限度检查法时 应进行细菌 霉菌及酵母菌计数方法的验证 以确认所采用的方法适合于该产品的细菌 霉菌及酵母菌数的测定 若产品的组分或原检验条件发生改变可影响检验结果时 计数方法应重新验证 四 微生物限度检查法 试验组薄膜过滤法计数时 取规定量的供试液 过滤 冲洗 在最后一次的冲洗液中加入50 100cfu试验菌 过滤 按薄膜过滤法测定其菌数 菌液组测定所加的试验菌数 50 100cfu 供试品对照组取规定量供试液 按菌落计数方法测定供试品本底菌数 稀释对照组用相应的稀释液替代供试品 加入50 100cfu试验菌 按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数 四 微生物限度检查法 验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试验 并分别计算试验菌每次试验的回收率不低于70 若任一次试验中试验组的菌回收低于70 应采取适宜的方法消除供试品的抑菌活性 并重新进行进行方法验证 四 微生物限度检查法 5 3控制菌检查法验证当建立药品的微生物限度检查法时 应进行控制菌检查方法的验证 以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查 采用薄膜过滤法时 取规定量供试液 过滤 冲洗 试验菌 10 100cfu 应加在最后一次冲洗液中 依法操作 若上述试验检出试验菌 按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查 若试验组未检出试验菌 应采用相应方法消除供试品的抑菌活性 并重新进行方法验证 四 微生物限度检查法 5 4细菌 霉菌及酵母菌检查检查方法 平皿法和薄膜过滤法按已验证的计数方法进行供试品的细菌 霉菌及酵母菌菌数检查 四 微生物限度检查法 菌落报告规则 细菌 酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu 霉菌宜选取平均菌落小于100cfu的稀释级 作为菌数报告 即两位有效数字 的依据 如各稀释级的平板均无菌落生长 或仅最低稀释级的平板有菌落 但平均菌落数小于1时 以 1乘以最低稀释倍数的值报告菌数 四 微生物限度检查法 例 菌数报告规则表1 四 微生物限度检查法 5 4 2薄膜过滤法滤膜孔径不大于0 45 m 直径一般为50mm 若需要用冲洗液冲洗滤膜 总冲洗量不得超过1000ml 每张滤膜每次冲洗量不超过100ml 贴膜菌面朝上于相应的琼脂培养基平板上培养 每种培养基至少制备一张滤膜 阴性对照试验 不得有菌生长 菌落报告规则每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu 若滤膜上无菌生长 以 1乘以稀释倍数的值报告菌数 四 微生物限度检查法 5 5控制菌检查供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行 增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证 阳性对照试验 加菌量