（材料学专业论文）介孔硅分子筛pva复合膜固定化漆酶电极的研究.pdf

摘要 摘要 漆酶传感器可以方便快速地检测废水中的酚类、芳香胺类、有机磷化合物( 农 药) 以及二嗯英等有毒物质，因此，研究高响应性能( 如高灵敏度、低检测线、 宽检测线以及快速响应等) 的漆酶电极在环境保护方面具有十分重要的意义。 为了提高漆酶电极的响应性能，制备出具有高性价比的实用性漆酶传感器， 本论文采用水热法合成了具有优良特性的介孔硅m c m 4 1 、镁离子改性介孔硅 m g - m c m 4 1 和亚甲基蓝改性的介孔硅m b m c m 一4 1 ，同时借助p v a 的良好成 膜性，首次将其用于漆酶电极的构建，并通过低温n 2 吸附、s e m 、t e m 以及电 化学方法对其进行了研究。 m c m 4 1 p v a l a c 电极的研究结果表明：在含有0 0 5 m m 的邻苯二酚p h 4 8 0 的p b s 中，m c m 4 1 p v a l a c 修饰电极表面发生的是一电子一质子的电极过程。 在最佳实验条件下，该酶电极对底物邻苯二酚表现出了良好的响应性能，初步改 善了漆酶电极的灵敏度、响应速度、线性范围以及最低检测限等，有希望用于废 水的实际检n 监测。 m g m c m 4 l p v a l a c 电极的研究结果表明：m g 2 + 引入到有序介孔分子筛 m c m 4 1 后，不仅有效地促进了l a c 的催化氧化，而且改善了酶与电极间的电子 传递速率；与m c m 4 i p v a l a c 电极相比，m g m c m 4 1 p v a l a c 电极表现出了 对底物邻苯二酚更高的亲和性和灵敏度、更短的响应时间、更宽的线性范围以及 更低的检测极限。从而为漆酶电极提供了一种优良的固定化基体材料。 m b m c m 4 1 p v a l a c 电极的研究结果表明：m b 引入到有序介孔m c m 4 1 后，有效地促进了漆酶的催化氧化，加速了电子的传递，改善了纯硅m c m 4 1 固定化漆酶的灵敏度、响应时间以及检测极限等，从而为漆酶电极的研究提供了 又一种优良的固定化基体材料。 关键词：介孔硅分子筛m c m 41 m g m c m 41 m b m c m 41 p v a 漆酶电极 摘要 a b s t r a c t l a c c a s eb i o s e n s o rh a sc a p a b i l i t yo fd e t e c t i n gab r o a dr a n g eo ft o x i cs u b s t r a t e s r a p i d l ya n dc o n v e n i e n t l yi nw a s t e w a t e ri n c l u d i n gp h e n o l i cc o m p o u n d s ，a r y l a m i n e s ， o r g a n i cp h o s p h o n i cc o m p o u n d s ( p e s t i c i d e ) ，d i o x i n s ，a n ds oo n s o ，i ti sv a l u a b l et o f a b r i c a t el a c c s em o d i f i e de l e c t r o d ew i t he x c e l l e n tp r o p e r t i e ss u c ha sh i g hs e n s i t i v i t y ， l o wd e t e c t i o nl i m i t ，b r o a dl i n e a rr a n g ea n dr a p i dr e s p o n s eb e c a u s eo fi t si m p o r t a n t a p p l i c a t i o ni np r o t e c t i n ge n v i r o n m e n t t h r e ek i n d so fm e s o p o r o u ss i l i c as i e v e s ，m c m - 4 1 ，m c m - 4 1 c o n t a i n i n gm 9 2 + ( d e n o t e dh e r e a f t e ra sm g - - m c m - 41 ) a n dm c m - 41c o n t a i n i n gm e t h y l e n eb l u e ( d e n o t e dh e r e a f t e ra sm b m c m - 41 ) ，w e r es y n t h e s i z e db yt h em e t h o d so f h y d r o t h e r m a is y n t h e s i sa n dw e r eu s e d t of a b r i c a t ee x c e l l e n tl a c c a s em o d i f i e d e l e c t r o d e f i r s t l y w h e n p o l y ( v i n y la l c o h 0 1 ) ( p v a ) w a s i n p r e s e n c e n 2 a d s o r p t i o n d e s o r p t i o n 、s e m 、t e ma n de l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sw e r eu s e dt o c h a r a c t e r i z et h e s em o d i f i e de l e c t r o d e s t h er e s u l t so fm c m - 41 p v ai m m o b i l i z e dl a c c a s em o d i f i e de l e c t r o d e ( d e n o t e d h e r e a f t e ra sm c m - 4 1 p v a l a c ) s h o w e dt h a to n ep r o t o np a r t i c i p a t e di nt h ee l e c t r o n t r a n s f e rp r o c e s so nm c m - 4 1 p v a l a cm o d i f i e de l e c t r o d es u r f a c ei np h4 8 0p b s c o n t a i n i n g0 0 5 m mc a t e c h 0 1 u n d e ro p t i m i z a t i o no ft h ee x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r s ， m c m 一41 p v a l a ce x h i b i t e de x c e l l e n tr e s p o n s ep r o p e r t i e st oc a t e c h o la n di m p r o v e d s e n s i t i v i t y ，r e s p o n s er a t e ，l i n e a rr a n g e ，d e t e c t i o nl i m i ta n ds oo n m c m 一4 1 p v a l a c h a sa na t t r a c t i n ga p p l i c a t i o ni nd e t e c t i n ga n d i n s p e c t i n gw a s t e w a t e r t h er e s u l t so fm g - m c m 41 p v ai m m o b i l i z e dl a c c a s em o d i f i e de l e c t r o d e ( d e n o t e dh e r e a f t e ra sm g - m c m - 41 p v a l a c ) s h o w e dt h a tm g pp r o m o t e dc a t a l y t i c o x i d a t i o no fl a c c a s ea n di m p r o v e de l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nl a c c a s ea n de l e c t r o d e ， m o r e o v e r ，m g - m c m - 41 p v a l a ce x h i b i t e db e t t e ra f f i n i t yt oc a t e c h o l ，h i g h e r s e n s i t i v i t y ，f a s t e rr e s p o n s e ，b r o a d e rl i n e a rr a n g ea n dl o w e rd e t e c t i o nl i m i tt h a n m c m - 4 1 p v a l a c m g m c m - 4 1 p r o v i d e dan o v e ls u p p o r tf o ri a c c a s em o d i f i e d e l e c t r o d e t h er e s u l t so fm b m c m 4l p v ai m m o b i l i z e dl a c c a s em o d i f i e de l e c t r o d e ( d e n o t e dh e r e a f t e ra sm b m c m 一41 p v a l a c ) i n d i c a t e dt h a tm bp r o m o t e dc a t a l y t i c i i 摘要 o x i d a t i o no fl a c c a s ea n dk e p te f f e c t i v ee l e c t r o nt r a n s f e ro fl a c c a s em o d i f i e de l e c t r o d e ， m o r e o v e r , m b - m c m 41i m p r o v e dr e s p o n s ep r o p e r t i e so fm c m - 41 p v a l a cs u c ha s s e n s i t i v i t y ，r e s p o n s et i m ea n dd e t e c t i o nl i m i ta n ds oo na n dp r o v i d e da n o t h e rn o v e l s u p p o r tf o rl a c c a s em o d i f i e de l e c t r o d e k e yw o r d s ：m e s o p o r o u ss i l i c as i e v e s m c m 一4 1 m g - m c m 一4 1 m b - m c m 4 1 p 溺l a c c a s em o d i f i e de l e c t r o d e i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学雠文储虢l 勺妈签郏期：如0 7 年月御 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丕鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤建盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名1 习嘏 签字日期：茹净多月牛日 导师签名： 签字日期：盯彳职晰 第一章绪论 1 1 酶电极 第一章绪论 生物传感器i l 】是指用固定化的生物体成分( 如：酶、抗原、抗体、激素等) 或 生物体本身( 如细胞、细胞器、组织等) 作为分子识别元件，对被分析物具有高度 选择性的分析仪器。生物传感器研究和开发的目的是向社会提供采用生物传感器 原理的新仪器和分析控制方法。生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、 电子、材料技术等多种学科相互渗透成长起来的新学科，这种交叉学科在理论上 和技术上均有许多新的问题要进行探索和开发，在应用上有极为宽广的领域可以 进行开拓。 生物传感器中研究得最多的为电化学生物传感器，曾经达到过7 0 ，现在的 比例仍在3 0 ，占据生物传感器研究的主导地位【2 】。酶电极是电化学生物传感器 研究中最重要的一部分。因而，研究高性能的酶电极对电化学生物传感器的发展 具有重要意义。 酶电极是第一代生物传感器，它是以酶作为分子识别器件的电化学生物传感 器，由一个固定化的酶敏感膜和与之密切结合的电极组成的换能系统，它把固定 化酶和电极结合在一起，因而具有独特的优点： ( 1 ) 它既有不溶性酶体系的优 点，又具有电化学系统的高灵敏性；( 2 ) 由于酶的专属反应性，使其具有很高 的选择性，能够直接在复杂试样中进行测剧3 | 。 根据换能器的不同酶电极可分为电流型和电位型两类。 1 1 1 电流型酶电极 电流型酶电极是指酶促反应产生的物质在电极上发生氧化或还原反应产生 的电流信号，在一定条件下，与被测物质浓度呈线性关系。用氧化酶制备的大多 为电流型。其基础电极主要是采用氧电极、金属电极、碳材料电极等。它的发展 主要包括三个阶段，其区别见图1 1 【2 1 第一章绪论 申 困 底物产物 图1 1 酶电极的三个发展阶段( 依次为第一代、第二代、第三代) f i g 1 一i t h r e ed e v e l o p m e n tp e r i o do f e n z y m em o d i f i e de l e c t r o d e ( t h ef i r s t ，t h es e c o n da n dt h et h i r d , r e s p e c t i v e l y ) 1 1 1 1 经典酶电极 第一代酶电极是1 9 6 2 年c a r k 4 首先提出的，它建立在氧还原基础上，以葡 萄糖氧化酶( g o d ) 催化葡萄糖为例，它的感应器是含有葡萄糖氧化酶的膜， 转换器是氧电极。当传感器插入待测溶液中时，溶液中的溶解氧和待测底物葡萄 糖将同时渗入到感应器膜。葡萄糖遇到酶，并有氧存在时便立即催化氧化为葡萄 糖酸内酯，同时消化氧气而产生过氧化氢。这时转换器氧电极即测出氧的还原电 流的下降，从下降的幅度，可以求出葡萄糖的浓度。 1 1 1 2 介体酶电极 第二代酶电极为介体型酶电极 5 - 1 0 1 ，它是利用人为加入电子媒介体来解决传 递电子的问题。介体型酶电极增加了化学修饰层，其目的是为了扩大基体电极检 测化学物质的范围，同时也提高了测定的灵敏度。对介体最基本的要求是有低的 氧化还原电势和高的电化学反应速率并且反应可逆，通常可用直流循环伏安法 ( d i r e c tc u r r e n tc y c l i cv o l t a m m e t r y ) 来考察介体的电化学性质。媒介体按作用的机理 可分为两大类：一是含有过渡金属元素的化合物或配合物，通过过渡金属的价态 变化来传递电子，如二茂铁及其衍生物、钌和锇等金属的配合物、铁氰酸盐等； 二是含有特殊官能团的分子，通过其结构的变化来传递电子，如醌及其衍生物、 有机染料、四硫富瓦烯、有机导电盐等。但是媒介体的加入也有其不足和缺点如 媒介体的流失、生物相容性以及生物中毒等问题会导致酶电极的性能有所下降。 1 1 1 3 直接电化学酶电极 第三代酶电极为直接电化学酶电极( d i r e c te n z y m ee l e c t r o d e ，d e t ) 或直接 2 蘑 鬣一 第一章绪论 电化学生物传感器。其特点表现为酶分子直接吸附固定到电极表面，是酶的氧化 还原活性中心与电极直接“交流”，能够更快地进行电子传递，从而使酶电极的 响应速度更快、灵敏度更高，成为真正“无试剂分析”，以本论文研究的漆酶电 极为例，其电催化工作原理如下： 醮中。讯，者。熟， 电极上 。熟，寺。德，嚣c 军需体， 由于漆酶固定在电极上，当底物进入酶膜发生反应，产生的电子传递过程便 通过电极转换成了响应电流，而响应电流与底物浓度之间又存在线性关系，从而 可以检测底物的量。 与第一代和第二代酶电极相比，直接电化学酶电极既不需要氧分子，也不需 要化学介质分子作为电子传递体，通常也不需要固定化载体，并且，在介体酶电 极中，介体有时会介导非特异性电子传递，而直接电化学酶电极电化学过程中的 电子传递直接在电极和酶的氧化还原中心之间发生，不需要介体，降低了系统非 特异性反应倾向【2 j 。但是酶通常具有较大的分子量，酶分子的电活性中心深埋在 分子的内部，且在电极表面吸附后易发生变形甚至失活，所以酶与电极间难以直 接进行电子转移【7j 。然而，蛋白质直接电化学研究在生物电化学中具有重要地位， 对于蛋白质结构功能研究、蛋白质电子传递过程的热力学和动力学研究都有着 重要意义，而且是研制第三代电化学生物传感器的基础【1 1 1 。因此，对酶的直接 电化学研究，会成为酶电极领域的重要发展趋势。 实现蛋白质与电极之间直接快速的电子传递可以通过以下两个方面加以实 现，蛋白质与电极之间直接快速的电子传递可以通过以下两个方面加以解决：一 是使用或制备不同的电极材料如石墨【1 2 j ；二是是对电极或蛋白质分子进行修饰 使得在裸电极表面引进一种既利于蛋白质固定，又能有效地保证其生物电活性的 物质，这也是目前研究最多的一种方法。 l i u 掣j 在银纳米粒子修饰的电极上在获得了细胞色素c 的直接电化学，并发 现细胞色素c 电子传递速率较快。 碳纳米管是一类一维碳纳米材料，具有特殊的纳米效应。目前已有很多研究 表明很多蛋白质在碳纳米管修饰电极上都具有良好的电化学响应【l4 1 ，包括细胞 色素c 、肌红蛋白、血红蛋白、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶以及漆酶等i l 孓埔j 。 尽管碳纳米管具有优良的电导性能，是当前的研究热点，但是目前碳纳米管的制 备成本仍较高，导致制备酶电极的成本较高，从而限制了其大批量的应用。 第一章绪论 介孔分子筛是2 0 世纪9 0 年代由m o b i l 公司的研究人员首次研发的8 ，1 9 j ，它的 出现为酶直接电化学提供了新的机遇，由于其特殊的性能，既能为酶提供一个能 保持其生物活性的优良微环境，又能为电子的有效传递提供有序的纳米通道，从 而有望成为第三代酶电极研究的优良的酶的载体材料【2 1 | 。但是，目前对介孑乙分子 筛固定化酶电极的研究尚处于初级阶段，其对促进电子传递的机理以及实际应用 缺乏必要的理论和实验研究。 因而，本论文用介孔分子筛m c m 4 1 以及用镁离子m 9 2 + 和亚甲基蓝( m b ) 改性的m c m 4 1 固定化漆酶( 1 a c c a s e ) 构建了漆酶( 1 a c c a s e ) 电极，目的是既可 以拓展介孔分子筛的应用领域，完善介孔分子筛固定化酶修饰电极的理论，又能 为实用性漆酶( 1 a c c a s e ) 电极的研究提供优良的基体材料。 1 1 2 电位型酶电极 电位型酶电极【j j 是指将酶促反应所引起的物质量的变化转化成电势信号输 出，电势信号大小与底物浓度的对数值呈线性关系。用脱氨酶或脱羧酶制备的大 多属于电位型。所用的基础电极主要有p h 电极、氨气酶电极、c 0 2 电极、离子 选择性电极或场效应管等。基础电极能影响酶电极的响应时间、检测下限等性能， 而固定化酶的膜层厚度、致密性、孔径大小、电荷、亲水性、甚至形貌等对酶电 极的响应、稳定性、寿命都有影响。 以尿素传感器为例， ( n h 2 ) 2 c o + 3 h 2 0 堕2 n h 4 + + o h 。+ h c 0 3 。 它的感应器是含有脲酶的膜，而转化器是一平面p h 玻璃电极，当尿素渗入 感应器而遇到脲酶时，立即被分解为氨，这种新生的氨通过透氨膜到达p h 电极 表面，引起玻璃膜电位的变化，从p h 上升的幅度，可以求出尿素的浓度。 1 1 3 影响固定化酶活性的因素 大多数酶固定化后，一般都有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命， 产生这种效应可能的原因有三1 2 2 j ：一是固定化增加了酶的活性构象的牢固程度； 二是阻挡了不利因素对酶的侵袭：三是限制了酶分子间的相互作用。但是如果固 定化触及到酶的活性敏感区，也可能导致酶的稳定性下降。同时，酶是比较脆弱 的物质，在不合适的条件下很容易发生变性和失活。即使在最适宜的条件，酶也 会缓慢失活，采用比较强烈的处理如强酸、高温、剧烈试剂，会使酶立刻失活， 研究酶的工作成功与否决定于能否避免使酶不稳定的条件【2 3 】：一是在处理酶时 最好不宜过分地延长时间，整个的制备过程在2 3 天内结束；二是将酶保存于深 度冰冻的状态。 4 第一章绪论 酶固定化后，其活性及反应体系多半会发生变化，酶固定化后所引起的酶性 质的改变，一般认为其原因可能有二：一是酶本身发生变化，即主要是指由于酶 活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化；二是酶受到固定化 载体的物理和化学性质的影响，即主要指酶由于固定化，使其周围的微环境发生 变化，如形成了能对底物产生影响的扩散效应以及酶与载体间的相互作用等。 1 1 4 酶的固定化材料 酶固定化对载体材料具有很高的要求，理想的载体要有良好的机械强度、热 稳定性及化学稳定性、耐微生物降解性和对酶的高结合能力等。而酶修饰电极不 仅要考虑以上酶的固定化问题，还要保证固定化酶修饰电极具有优异的电化学性 能。到目前为止，科学家们在酶电极的修饰材料方面已做了很多研究，但是即使 一种材料的性能再优异也不能满足所有酶的固定化需要，因而，各国科学家们需 要按图1 2 所示，继续对酶电极进行研究，综合考虑各因素以达到酶与载体的最 优化结合，制备出高性价比的酶电极。为了研制价格低廉、灵敏度高、选择性好 和寿命长的酶电极，酶的固定化已经成世界各国竞相研究和探索的目标。经过几 十年的不断工作，已经研究开发了多种酶的固定化材料。 用途、灵敏度、响应时间、选择性、稳定性、 寿命、成本、可重复使用性等 图1 - 2 酶电极设计过程示意图 f i g 1 - 2 s k e t c hm a po f d e s i g n i n ge n z y m em o d i f i e de l e c t r o d e 1 1 4 1 天然聚合物材料 此类材料的最大优点就是来源广泛、无毒、生物相容性优良如壳聚糖及其衍 生物【2 4 2 5 1 、琼脂糖凝剧2 6 捌、海藻盐等。此类材料通过包覆法、交联法、自组 第一章绪论 装等方法进行酶的固定化，并用于生物传感器的构建。此类材料不仅可以单独进 行酶的固定化，还可以将两种天然聚合物共混或共聚用于酶的固定化材料如琼脂 糖瓜尔胶复合材料【2 6 2 7 1 ，该材料综合了两者的优点具有良好的成膜性、粘附力、 无毒以及生物相容性，不仅能为酶提高天然的微观环境，又能保证酶与电极问的 电子传递。从而为酶电极的研究提供了一种良好的固体化材料。除此之外，该类 材料由于其良好的成膜性和生物相容性，已成为无机有机复合材料常用的有机 成膜材料，如本节1 2 4 3 所述。 1 1 4 2 合成高分子材料 由于合成的灵活性、结构的预设性使得合成高分子材料的化学、物理性能都 有很大的可变性，从而成就了合成高分子材料在生物酶固定化方面的重要作用。 尤其是导电聚合物材料，它以其独特的导电性能和多种制备方法等特点，占据着 酶电极研究的重要位置。目前，已经合成了各种导电高分子材料并用于了酶电极 的制各如聚苯胺 2 9 - 3 1 】、聚吡咯 3 2 , 3 3 】、聚噻吩【3 4 】以及它们的衍生物等。 导电聚合物可以用传统化学方法聚合得到，也可以直接电化学得到。尤其是 电聚合法准备的导电聚合物膜由于其制备方法简便易行、所得材料性能优异而备 受青睐。聚合物膜的厚度、形貌以及性能等可以通过外加电压或电流加以调节控 制。常用于电聚合的方法有恒电位法，循环伏安扫描法、恒电流法、矩形波电解 法和交流电电解法等【3 引。采用电聚合制备酶电极，不仅可以保证酶电极良好性 能，而且制备简单方便，既可以在导电物质电聚合完成之后加酶，即两步法完成； 也可以在电聚合过程中直接加酶，即一步法完成【3 6 】。 1 1 4 3 无机有机复合材料 无机材料有机复合材料可以兼具两者的优点，在电极构建过程中可以取长 补短，制备出满足一定需要的酶电极。无机材料介孔硅分子筛以其独特的性能， 既可以为酶保持催化活性提供良好的微观环境，又能促进电子在酶与电极间的传 递，缺点是其成膜性较差，但是借助具有良好成膜性的材料，已经构建出了几种 性能优异的酶生物传感器 3 7 - 4 3 。利用碳纳米管优异的导电催化性能和壳聚糖良好 的成膜性以及生物相容性等优点制备了各种性能优异的酶生物传感器【1 7 , 4 4 - 矧。纳 米粒子由于其具有比表面积大、表面反应活性高、表面活性中心多、催化效率高、 吸附能力强等特性，而常被引入到生物传感器研究中【4 7 - 4 9 1 。 本文所研究构建的酶电极也属于此类种材料构建的酶电极即无机有机复合 材料固定化酶修饰电极。 6 第一章绪论 1 2 介孔分子筛 1 2 1 介孔分子筛的概念 按照国际纯粹应用化学联合会( i u p a c ) 的规剧5 0 j ：多孔材料可根据其孔直 径的大小分为三类，即微孔( m i c r o p o r e ) ，其孔尺寸小于2 n m ：中孔( m e s o p o r e ) ， 孔尺寸大于2 n m 小于5 0 n m ；大孔( m a c r o p o r e ) ，孔尺寸大于5 0 n m 。 分子筛是另一种描述多孔材料的术语，其最主要是叙述具有选择性吸附性质 的材料。但是，现在常常把微孔材料和介孔材料统称为分子筛而不再顾及它们到 底有没有筛分某种分子的能力，如很多介孔材料也常被称作介孔分子筛。 介孔分子筛( 又称为中孔分子筛，m e s o p o r o u ss i e v e s ) 是指以表面活性剂为模 板剂，利用溶胶一凝胶、乳化或微乳等化学过程，通过有机物和无机物之间的界 面作用组装生成的一类孔径在2 - 3 0 n m 之间、孔分布窄且具有规则孔道结构的无 机多孔材料。它的出现以1 9 9 2 年m o b i l 公司的研究人员首次使用烷基季铵盐型 阳离子表面活性剂为模板剂成功的合成出m c m 4 1 ( m o b i lc o m p o s i t i o no f m a t t e r - 4 1 ) 型中孔分子筛为标志 1 9 , 2 0 1 。有序介孔分子筛优越性在于它们具有均一 的且在纳米尺度上连续可调的孔径、从一维到三维的高度有序的孔道结构、较大 的比表面积和孔体积、易于修饰的表面、稳定的骨架结构、可控的形貌，如膜， 片、球等，可用作吸附剂、催化剂及载体，并在分离提纯、生物材料、新型组装 材料、微电子和光学材料等方面有着巨大的应用潜力 5 1 - 5 7 ；同时介孔分子筛3 3 】 独特的结构和催化性能能为电子传递提供合适的环境，并防止生物分子的流失， 为制备一系列高性能的传感器提供了广阔的前景。 1 2 2 介孑l 分子筛的种类及表征手段 按照化学组成的不同，有序介孑l 材料一般划分为硅基和非硅基两类。硅基介 孔材料的骨架主要包括硅酸盐和硅铝酸盐等；非硅基有序介孔材料主要包括过渡 金属氧化物、介孔碳分子筛、磷酸盐以及硫化物等为代表的非氧化物【5 8 1 。通过 使用不同的模板剂和采用不同的合成方法可得到不同结构特征的介孑l 材料。在介 孔材料制备过程中，有许多因素，如无机物源、反应物浓度、反应溶液的p h 值、 反应时间、反应温度、添加剂种类和量，以及反应后的热处理等都影响到介孔材 料的合成，导致生成不同的介孔材料【5 9 】。由于材料合成过程中的各种因素都对 最终生成的介孔材料有很大的影响，因此要想得到一定结构的介孔材料就需要对 各种影响因素加以摸索、优化，最终合成出所希望的材料。其中将几种较为常见 的是介孔分子筛的特点归纳如下，如表1 1 所示。 第一章绪沦 m c m - 4 1 m c m - 4 8 m c m 5 0 六方二维有序结构( h e x a g o n a l ，t w o d i m e n s i o n a l ) ，孔径在 2 1 0 n m ，一般采用阳离子表面活性剂如十六烷基溴化铵 ( c t a b ) 为模板，硅酸酯如正硅酸乙酯( t e o s ) 为硅源，多 在碱性条件下合成 立方三维有序结构( c u b i c ，t h r e e d i m e n s i o n a l ) ，孔径在2 - 4 n m ， 一般采用阳离子表面活性剂如十六烷基溴化铵( c n 也) 为模 板，硅酸酯如正硅酸乙酯( t e o s ) 为硅源，但合成温度、合 成时的p h 值等不同于m c m - - 4 1 层状结构( u n s t a b l el a m e l l a r ) 【5 9 - 6 2 】 【5 9 ，6 0 ，6 2 ，6 3 】 【5 9 ，6 0 ，6 2 】 s b a 一1 5 六方二维有序结构( h e x a g o n a l ，t w o - d i m e n s i o n a l ) ，孔径在【5 9 - 6 l ，“】 3 - 5 0 r i m , 一般以中性表面活性剂如聚环氧乙烯醚聚环丙烯醚 聚环氧乙烯醚三嵌段聚如e 0 2 0 p o7 0 e 0 2 0 ( p 1 2 3 ) 为模板，硅酸酯 酸如正硅酸乙酯( t e o s ) 为硅源，酸性条件下合成 s b a 一1 6 立方三维有序结构( c u b i c ，t h r e e - d i m e n s i o n a l ) ，孔径在3 5 0 n m ， 5 9 ，6 5 ，6 6 】 一般以中性表面活性剂如聚环氧乙烯醚聚环丙烯醚聚环氧 乙烯醚三嵌段聚如以e o l o f f 0 7 0 e o l 0 6 ( f 1 2 7 2 ) 为模板剂，硅酸酯 酸如正硅酸乙酯( t e o s ) 为硅源，酸性条件下 h s m 六方短程有序( h e x a g o n a l ，s h o r t - r a n g eo r d e r e d ) ，2 1 0 n m ，一般中【5 9 ，6 7 】 性胺如h 2 n c h ( c h 3 ) c h 2 【o c h 2 c h ( c h 3 ) x n h 2 ( x 在3 3 6 8 ) 为 模板，硅酸酯酸如正硅酸乙酯( t e o s ) 为硅源，酸碱条件都可 m s u n 多维立体结构蠕虫型( w o r ml i k e ) ，孔径可到达十几的纳米，【5 9 ，6 0 ，6 8 】 可以用长链烷烃或中性有机胺为模板硅酸酯为硅源，酸碱性或 中性条件都可 m c f 三维连续大介孔结构( t h r e e d i m e n s i o n a l ，c o n t i n u o u s ，u l t r a - l a r g e 5 9 ，6 0 ，6 8 】 p o r em e s o p o r o u s ) ，孔径在3 3 0 h m ，以三嵌段聚合物为模板， 硅酸酯为硅源，酸性下 8 第一章绪论 现阶段有多种方法可对得到的介孔材料进行表征啪5 8 。低温氮吸附法，可 以对介孔材料的比表面积和孔容、孔径、孔径分布等孔结构参数进行表征；x 射 线衍射分析( x r d ) 法是利用衍射的位置决定晶胞的形状和大小，以及晶格常数来 判断所合成介孔的尺寸、形态等；扫描电镜( s e m ) 和透射电镜( t e m ) 是在极高、 极大倍数下直接观察样品的形貌、结构、粒径大小，并能进行纳米级的晶体表面 及化学组成分析。差热热重( d t a t g ) 分析可用于表征物质表面吸附、脱附机理 及晶型转变温度，并可鉴别中间体；红外及拉曼光谱可以用来检测金属阳离子与 阴离子成键、金属离子配位、对称性等化学环境变化；固体核磁共振州m r ) 则可 对介孔材料骨架原子的位置、骨架与外来原子的相互作用进行研究。 1 2 3 介孔分子筛固定化酶的研究 1 2 3 1 介孔分子筛固定酶的研究现状 介孔分子筛由于其具有均一可调的孔径、高的比表面积、规整的孔道以及易 于功能化的表面等特点，极有希望成为优良的生物酶的固定化材料。目前已有大 量有关各种介孔分子筛进行酶的固定化研究的文献报道，现将阅读过的有关报道 整理如下，见表1 2 。 9 第一章绪论 表1 2 介孔分子筛固定化酶的情况 t a b l e1 2 s t a t u so f m e s o p o r o u ss i e v e si m m o b i l i z e de n z y m e 类5 ；| l 固定化的酶 参考文献 m c m - 4 1葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o x ) 、胰岛素( t r y p s i n ) 、木瓜【2 l ，7 l - 8 3 】 蛋白酶( p a p a i n ) 、细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ) 、溶解酵素 ( 1 y s o z y m e ) 、r l 铋博( 1 i p a s e ) a 一淀粉酶( a - a m y l a s e ) 、肌钙蛋白 ( c a r d i a ct r o p o n i ni ) 、细胞色素p 5 4 0 ( c y t o c h r o m ep - 4 5 0 ) 、肌红 蛋i 刍( m y o g l o b i n ) 、乙酰胆碱脂酶( a c e t y l c h o l i n e s t e 。r a s e ) 、络氨 酸酶( t y r o s i n a s e ) 、辣根过氧化酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h r p ) m c m 4 8 s b a 1 5 s b a 一1 6 h s m m c f n f s m 1 6 c m k - 3 介孔氧化钨 胰岛素( t r y p s i n ) 、细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ) 胰岛素( t r y p s i n ) 、细胞色素c ( c y t o c h r o m e 力、 脂肪酶( p o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s e ，p p l ) 、- 淀粉酶( a - a m y l a s e ) 、 氯过氧化酶( c h l o r o p e r o x i d a s e ) 、溶解酵素( 1 y s o z y m e ) 、辣根过 氧化酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e h r p ) 、聚糖酶( x y l a n a s e ) 、青 霉素酰基级转移酶( p e n i c i l l i na c y l a s e ，p a ) 氯过氧化酶( c h l o r o p e r o x i d a s e ) 肌红蛋白( m y o g l o b i n ) 、血红蛋l l ( h e m o g l o b i n ) 、辣根过氧化酶 ( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h r p ) 、脂肪酶( p o r c i n ep a n c r e a t i c l i p a s e ，p p l ) 小淀粉酶( a - a m y l a s e ) 、葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o x ) 、 氯过氧化酶( c h l o r o p e r o x i d a s e ) 乙酰胆碱脂酶( a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ) 、辣根过氧化酶 ( h o r s - e r a d i s h , p e r o x i d a s e ，h r p ) 细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ) 、血红蛋i 刍( h e m o g l o b i n ) 血红蛋i 刍( h e m o g l o b i n ) 7 2 ，8 4 】 【7 2 ，7 5 ，8 2 9 0 】 【9 l 】 【3 7 ，3 8 ，4 1 ，9 2 】 【7 5 ，9 3 ，9 4 】 【8 0 ，8 2 ，8 3 】 4 3 ，9 5 】 【4 2 】 介q l n b 2 0 5亚铁血红素( h e m ep r o t e i n ) 【9 6 】 1 2 3 2 酶的固定化方法 介孔分子筛由于其结构的特殊性，使得固定化酶的方法与传统固定化酶的方 法有一定的区别。 l o 第一章绪论 根据酶与载体介孔分子筛的相互作用不同一般将固定化酶的方法分为以下 四类：吸附法、包埋法、共价结合法和交联法，示意图如图1 3 。 吸附法 羲焉丽忑丽 尘垒塑呈墅些 共价键法 包埋法 交联法 图1 3 介孔分子筛固定化酶的方法 f i g 1 - 3 t h em e t h o d so fm e s o p o r o u ss i e v e si m m o b i l i z e de n z y m e 1 ) 吸附法 吸附法指载体通过范德华力、离子键和氢键等亲和力固定化酶。介孔分子筛 3 j 具有大的比表面积( 可达1 5 0 0 m 瑰左右) 、孔容( 可达1 5 c m 3 g 、孔径( 2 5 0 r i m ) 、 并且未经功能化的介孔硅分子筛富含羟基，可与酶分子形成静电吸引或氢键，从 而将酶分子有效地吸附在介孔分子筛的内外表面d i a z 等【_ 7 2 】通过对m c m 4 1 固定 胰岛素的研究，发现吸附固定在m c m 4 1 上的胰岛素的稳定性得到明显改善。此 法操作简单，不需要对载体进行更多的处理，是一种较为温和的固定方法，它不 仅可以得到较高的酶担载量，而且可以通过控制介孔的形状和尺度造成的限域效 应来改善固定化酶的稳定性及活性。然而这种方法由于酶分子与介孔载体表面羟 基之间的作用力较弱，酶与载体结合的不够牢固，使得酶在反应过程中容易流失， 同时吸附一般是可逆过程，吸附的酶易于脱落。 2 ) 包埋法 包埋法对于介孔分子筛而言，与其他材料的包埋法是不同的，用介孔分子筛 对酶分子进行包埋是在酶分子的大小小于孔的开口的条件下，利用酶浓度梯度的 动力使酶分子进入到孔道内将其包埋 9 7 】。这种方法用包埋法较为简便温和，酶 分子仅仅是被包埋在孔道中，而未参加化学反应，生物活性破坏少，因而使得酶 的活性得到保证。尽管载体的孔是开放的，容易导致固定化的酶的流失，但是通 过孔口的基团功能化反应来适当地调整孔开口处的直径大小或在其外围包覆一 层易于底物扩散的薄膜，如图1 3 和1 5 ，这样不仅可以有效地解决固定化酶的流 第一章绪论 失问题而且可以保证反应底物的自由进出，使酶促反应顺利进行。但是对于大 分子酶来讲，其分子较大，目前所研究的大多数介孔分子筛较难达到大分子生物 酶的尺寸要求，因而，目前国内外研究也多限于小分子生物酶方面的应用研究。 随着对介孔材料研究的发展，在解决其材料的孔径等方面的问题后，介孔材料在 固定化大分子酶方面的应用研究会得以迅猛发展。 3 ) 共价结合法 用共价结合法固定化酶之前，介孔分子筛首先必须进行功能化，使其带有易 与酶发生共价结合的活性官能团，如s h 、c o o h 、c h 2 c i 、n h 2 等1 9 8 j 除此之 外，在分子筛上引入其它功能基团如c h = c h 2 9 3j 可以增加载体表面的疏水性进 而改变酶所处的环境。采用此法一般是在介孔材料合成出之后，在通过化学法引 进功能基团。此法的主要优点是可以保证酶的最大固定化量以及稳定性。然而， 此法反应条件激烈，影响固定的因素较为复杂，有可能导致酶的严重失活【吲。 4 ) 交联法 交联h o o 】是将酶分子通过共价耦合的方法构造成三维酶聚集体。这个方法的 主要缺点是聚集粒子的大小难于控制，催化底物难接近酶聚集体的内部及三维酶 聚集体的机械强度不足。这些问题可以通过跟其它酶固定化技术的结合得以解 决。如酶可以通过物理吸附的方式交联在三维的相互连通的网状笼中，网状笼的 直径大小是酶的几倍。酶聚集体的粒径大小由笼的大小所控制。另外酶聚集物的 机械强度因载体而增强。此外，酶聚集物的浸出可以通过调节笼的连接度来降到 最少。l e e 掣1 0 1 】将旺凝乳蛋白酶分子吸附到分级有序的介孔硅材料的笼中，然 后将酶交联在笼上。 1 2 3 3 影响介孑l 分子筛固定化酶的因素 影响介孔分子筛固定化酶的因素有很多，如介孔分子筛的孔径大小、基团的 功能化、溶液的p h 值、合成材料的元素配比以及比表面积等【8 2 ，8 3 】。 介孔分子筛的孔径是影响其固定化效果的主要因素，根据酶在载体中的存在 形式可以分为三种，如图1 - 4 所示【8 2 】，一是介孔分子筛的孔径尺寸小