（农产品加工及贮藏工程专业论文）甲基对硫磷压电免疫传感器的研制.pdf

摘要甲基对硫磷是一种高毒有机磷农药，近年来已被禁止在蔬菜和水果上使用，但在农产品的进出口贸易、食品和环境安全的监督检测中仍然是常规检测的重要污染物，本试验试图用不同的检测原理研制快速简易检测甲基对硫磷的压电免疫传感器，为蔬菜中农药残留的快速、现场检测和监控提供新的技术支撑。本研究针对压电免疫传感器研制的关键，比较研究了石英晶体金电极上固定抗体的方法，发现巯基自组装膜法固定抗体与蛋白a 法相比，传感器频移值降低更显著，固定抗体量较多，且稳定性较好。研究还提出了巯基自组装膜法圃定抗体时的离子强度( n a a ) ，应小于2 0 m m o l l ，p h值范围7 0 7 5 ；本文研究了基于直接法、竞争法和酶催化沉积放大法原理的压电免疫传感器的测定效果，结果表明，基于直接法原理的压电免疫传感器对甲基对硫磷的检测范围为1 0 2 5 z g m l ，重复性好，但直接法检测一定程度上限制了传感器的灵敏度，不适合小分子的检测，而基于竞争法原理的压电免疫传感器，对甲基对硫磷的检测范围为0 1 - 1 0 9 9 m l ，检出限为0 0 7 4 z g m l ，重复性较好，自来水、土壤、蔬菜样品的添加同收率分别为9 0 7 - 1 0 1 1 、9 3 8 1 0 9 3 、7 1 9 9 6 1 ，符合检测方法要求；基丁二酶催化沉积放大原理的压电免疫传感器，能显著进行信号放大。同时对传感器的再生进行了探讨。本研究探索了甲基对硫磷三种检测方法，在固定化方法和检测方法比较等方面具有一定突破，为进一步研究农药多残留的压电免疫传感器奠定基础。关键词：压电免疫传感器，甲基对硫磷，直接法，竞争法，酶催化沉积a b s t r a c tm e t h y lp a r a t h i o ni sak i n do fv i r u l e n to r g a n o p h o s p h o m sp e s t i c i d e ，w h i c hh a sb e e nf o r b i d d e ni nt h eu s eo fv e g e t a b l e sa n df r u i t s ，b u ti ss t i l la l li m p o r t a n tr o u t i n ed e t e c t i n gp o l l u t i o ni nt h ea g r i c u l t u r a lp r o d u c t se n t r a n c et r a d ea n dt h es u p e r v i s i o na n dd e t e c t i o n f o rt h ef o o da n de n v i r o n m e n ts a f e t y t h i sa r t i c l et r i e dt od e v e l o pap i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o rf o rr a p i da n ds i m p l ed e t e c t i o no fm e t h y lp a r a t h i o nt h r o u g hd i f f e r e n td e t e c t i o nm e t h o d s ，p r o v i d i n gt e c h n i c a ls u p p o r tf o rr a p i da n do nt h es p o td e t e c t i o na n ds u p e r v i s i o no fp e s t i c i d er e s i d u e si nv e g e t a b l e sa n df r u i t s t h ek e yp o i n to fd e v e l o p i n gt h ep i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o ri st oi m m o b i l i z et h ea n t i b o d yo n t ot h eg o l d e ne l e c t r o d eo ft h eq u a r t zc r y s t a l ，t h ea r t i c l ec o m p a r e dt w oi m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s ，i n c l u d i n gp r o t e i na ( s p a ) a n ds e l fi m m o b i l i z e dm e m b r a n e ( s a m s ) m e t h o d s ，t h ec o n c l u s i o ni s ：c o m p a r e dw i t hs p am e t h o d ，m o r ea n t i b o d yc a nb ei m m o b i l i z e du s i n gs a m sm e t h o d ，a sw e l la st h es t a b i l i t y , i nc o n d i t i o nt h a ti o nc o n c e n t r a t i o ni sl e s st h a n2 0 m m o l l , p hr a n g ei s7 0 - 7 4 t h r e em e t h o d sh a v eb e e ns t u d i e dw h e nm e t h y lp a r a t h i o nd e t e c t e d ，i n c l u d i n gd i r e c tm e t h o d ，c o m p e t i t i v em e t h o da n de n z y m ec a t a l y s ta g g r e g a t i o na m p l i f y i n gm e t h o d f o rt h ed i r e c tm e t h o d ，t h el i n e a r i t ys c o p eo fd e t e c t i n gm e t h y lp a r a t h i o ni s1 0 2 5l lg m l , w i t h i nw h i c ht w oc o n c e n t r a t i o no fm e t h y lp a r a t h i o nh a sb e e nr e t e s t e df o rf i v et i m e se a c h ，w i t ht h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no ff r e q u e n c y4 7 、5 3 ，a n dd e t e c t i o nl i m i t s4 7 、5 3 r e s p e c t i v e l y t h ec o m p e t i t i v em e t h o d ，w h i c hb a s e do nt h ec o m p e t i t i o nb e t w e e nt h eo v ac o n n e c t i v em e t h y lp a r a t h i o na n dt h ed i s s o c i a t i v em e t h y lp a r a t h i o nf o rt h er e a c t i o no ft h ea n t i b o d yi m m o b i l i z e do nt h eg o l d e ne l e c t r o d eo ft h eq u a r t zc r y s t a l ，h a sad e t e c t i o nr a n g eo f0 1 - 1 0l ag m e , a n dt h e d e t e c t i o nl i m i to f0 0 7 4i tg m lt h r e ec o n c e n t r a t i o no fm e t h y lp a r a t h i o nw i t h i nt h ed e t e c t i o nr a n g eh a sb e e nr e t e s t e d ，t h es t a n d a r dd e v i a t i o no fw h i c ha r e5 9 4 4 、6 9 0 0 、9 51 7 ( n = 7 ) a d d e dr e c l a i m e dt e s tt ot h es a m p l eo ft a pw a t e r , s o i la n dv e g e t a b l e sh a sh e e ns t u d i e dw i t ht h er e c l a i m e dr a t i oo f9 0 7 - 1 0 1 1 、9 3 8 1 0 9 3 、7 1 9 9 6 1 e n z y m ec a t a l y s ta g g r e g a t i o na m p l i f y i n gm e t h o dh a sb e e ns t u d i e df o rd e t e c t i o no fo v ac o n n e c t i v em e t h y lp a r a t h i o n a st h ea n t i b o d y , e n z y m em a r k e da n t i b o d y , r e a c t a n ta n ds u b s t r a t ea d d e d ，t h ef r e q u e n c yr e d u c e d ，w h i c hm a g n i f i e dt h es i g n a l t h ed e t e c t i o nr a n g eo fo v ac o n n e c t i v em e t h y lp a r a t h i o ni s0 1 - 4 5ug m l t h r e em e t h o d sf o rd e t e c t i o nm e t h y lp a r a t h i o nh a v eb e e ns t u d i e d ，t h ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o da n dt h e d e t e c t i o nm e t h o dh a v eb e e nc o m p a r e d ，w h i c he p r o v i d e dt h ef o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d yo fp i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o rf o rd e t e c t i o no fm u l t i - p e s t i c i d er e s i d u e s k e yw o r d ：p i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o r , m e t h y lp a r a t h i o n ，d i r e c tm e t h o d ，c o m p e t i t i v em e t h o d ，e n z y m ec a t a l y s ta g g r e g a t i o nm pp b sn h se d cm d h as p ad 蛸b s aq c mn s bt m bh r ps a m英文缩略表m e t h y lp r a t h i o np h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o nn - h y d r o x y s u c c i n i m i d o b i o t i nn - ( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) - n - e t h y l c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d eh s c h 2 ( c h 2 ) 1 5 c o o hs t a p h y l o c o c c u s - a u r e u sp r o t e i nac h i c k e no v a l b u m i nb o v i n es e d u ma l b u m i nq u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c en o n s p e c i f i ca b s o r p t i o n3 ，3 ，5 ，5 - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s es e l f - a s s e m b l e dm e t h o dv甲基对硫磷磷酸盐缓冲溶液n 羟基琥珀酰亚胺1 乙基3 0 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺十六巯基烷基酸葡萄球菌蛋白a鸡卵白蛋白牛血清白蛋白石英晶体微天平非特异性吸附作用可溶性单组分四甲基联苯胺辣根过氧化物酶巯基自组装法独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生躲芦漫帆腑石月乡日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)论文作者签名：步澄导师签名忸舌髻时间：锄彻8 年月乡日时间：p j 年月，6e t中国农业科学院硕卜学位论文第一章引言1 1 压电传感理论1 1 1 压电免疫传感器原理第一章引言生物传感器是利用一定的生物或化学的固定技术，将生物识别元件( 酶、抗体、抗原、蛋白、核酸、受体、细胞、微生物、动植物组织等) 固定在换能器上，当待测物与生物识别元件发生特异性反应后，通过换能器将所产生的反应结果( 形成复合物或产生声、光、电、热等) 转变为可以检测的电信号和光信号等，以此对待测物质进行定性或定量分析，从而达到检测分析目的【l 。3 1 。基于质量检测的压电免疫传感器是近2 0 年发展起来的新型生物传感器。其基本原理是以石英晶体为敏感材料，在晶体表面包被一种抗体或抗原，与待检测样品中抗原或抗体发生特异结合而导致晶体质量增加，由于晶体振荡频率与其质量成反比关系，从而可通过监测谐振器吸附待测物后频率的变化来定量检测样品中抗原或抗体浓度。压电免疫传感器是基于压电石英谐振器对质量的敏感性进行测定，其最大的优点是不需要任何标记，且仪器简单、操作方便、成本低廉且灵敏度高，特别是能动态地监测抗原抗体的反应，有利于进行免疫反应动力学研究等，因此引起了广泛的关注，在医药学研究、食品卫生检验、环境卫生监测等众多领域中已经开展了大量的应用研究，成为生物传感器领域的热点之一。1 1 2 气相压电传感理论压电晶体在气象中振荡时，其性能与表面涂层的质量、物态( 固态或液态) 、性质( 港性、粘弹性) 及分布、体声波由晶体向涂层的传播及声阻抗等因素有关。此外，对压电晶体自身震荡状态有关的一些因素( 如温度、晶体谐振器参数) 也可影响其传感响应降7 】。当在基频振荡时，晶片厚度等于波长之半，故频率可表示为：厂；兰；盟；兰( 1 )式中，t 为晶片厚度；n 为晶片频率常数；速度，与晶体的弹性模量及密度p 有关：v 一层因伪相对于晶面法线方向弹性( 剪切) 横波的传播t ，竺。里或m ；p tj l 一戤=p ap式中，a 、p 、m 及m 为相应石英晶片的面积、式( 1 ) 及式( 3 ) 得i ；唑( 2 )( 3 )密度、质量及单位面积质量( 面密度) 。由( 4 )当薄层外来物( 质量a m - a m i a ) 均匀沉积于晶片表面时，晶体频率发生改变：厂+ 。笔( 5 )由式( 4 ) 及式( 5 ) 可得外来质量引起的频率变化( 频移值) 为：。4( 6 )p n1 + 坐当m m 时，上式可近似为：，。靴；一旦m( 7 )o nao n结合式( 2 )。犁。一善m ：一笙m( 8 )p na、jp l lp v式中，c 及c m 为压电晶体的面密度( 响应) 灵敏度及质量( 响应) 灵敏度，相应的单位为h z 9 1 c 岔及h z 9 1 。对a t 切石英，在式( 7 ) 中带入相应参数( p - - 2 9 4 7 1 0 儿g 伽。1 s ，p = 2 6 4 8 9 锄。，或n = 1 6 7 0 x1 0 5 c m h z ，v - - - - 3 3 4 0 m $ - 1 ) ，可得= 一2 2 6 x 1 0 6 厂2 a m( 9 )式中，f 、f 、a m 单位分别为h z 、m h z 、g e r a 2 。s a u e r b r e y 建立了厚度剪切晶体频率变化与晶体表面沉积物质量的关系，并以此为依据首先提出将压电晶体用作灵敏的微天平。故此式常成为s a u e r b r e y 方程。可见压电晶体的质量灵敏度是与振荡晶体个性能参数有关的常数【眄】。由测定所得的频移值可计算涂层膜吸附物质的质量m 和单位面积膜表面吸附的分子数玎：彳a m 一一0 4 4 2 5 二( 1 0 )，。i ；一2 6 6 5 1 0 1 7 ：垒：( 1 1 )m y 式中，a m 、f 、f 及a 的意义同前，单位相应为ug 、h z 、m h z 及e r a ；m 为被吸附物质的相对分子量。式( 9 ) 、式( 1 0 ) 、式( 1 1 ) 为气相压电传感检测的主要里理论依据。负号表示随质量负载增加，晶体频率降低。据式( 1 5 ) 估计，压电石英品体作为质量检测器的检测限可达1 0 。1 2 9 或1 0 1 4 t o o l 。从振荡电路频率测量信噪比考虑，很容易达到1 0 9 9 或1 0 1 1 m o l 。可见晶体的质量灵敏度非常高，故常称作石英晶体微天平( q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ，q c m ) 。1 1 3 液相压电测量技术1 1 3 1 液相压电测量的影响因素2中国农业科学院硕仁学位论文第一章引言n o m u r a 和o k u h a r a 1 0 j 最早开始调查压电石英晶体在溶液中的特性，并发现压电白英晶体在液体环境中受多种因素的影响。1 9 8 5 年，k a n a z a w a 等【1 1 】利用切变波和阻尼切变波物理模型得出溶液黏度和密度对晶体振动频率影响的经验式：f = f 洲z ( plr l l pqn q ) u z式中，pl 和n l 分别是溶液的密度和黏度：p o 和r l o 分别为晶体密度和弹性系数。该经验式是用葡萄糖溶液和乙醇溶液接触压电石英晶体表面，并以压电石英晶体在纯净水中的振动为参照而实验得出的。该式理论预测率为1 ：1 0 0 5 。然而随后的实验证明，改变离子强度会使结果大大偏离上式得预测值，而且具有3 0 h z c 的温度系数( 在2 6 4 0 范围) 1 2 - 1 3 】，因此，压电石英晶体在溶液中的影响因素至少包括黏度、密度、电导率和温度等，此外还有非特异性吸附作用( n s b ) 。同年，b r u c k e n s t e i n 和s h a y 1 4 1 报道了类似的结果。他们假设与压电石英晶体接触的液体在压电石英晶体表面形成一个黏性界面层，该层的质量即为增加在压电石英晶体上的质量。以后研究者们又相继发现固液界面的性质如疏水性和亲水性【1 5 】、晶体表面涂层厚度【1 6 】等对实验结果均有不同程度的影响，所以要小心地控制实验条件，排除各种可能的误差源。压电石英晶体生物传感器大多要求在液相中使用，生物反应也是在模拟人体内环境的条件下进行的，特别是用于临床检测的压电石英晶体微生物传感器均要求在液相中检测，并且在检测时所要求的背景溶液都要求有一定的酸碱度、离子强度，如果是蛋白溶液，还有黏度因素要考虑。据最近研究报道i l ，溶液离子浓度越大，晶体的振荡频率越低，但在n a c l 浓度低于0 2 5 m o l l 时，晶体振荡频率的变化不显著，可视为无影响。这与离子浓度增加，在一定范围内导致溶液的导电率变大，从而使晶体的振荡频率降低有关，符合姚守拙等建立的机电偶合模型公式。溶液的黏度和密度越大，液体对石英晶体的应力越大，液体的质量负载效应越明显，即液体的阻尼效应越明显。溶液的p h 值即酸碱度对石英晶体振荡频率的影响关系是：随p h 值的升高，石英晶体的振荡频率逐渐降低【1 黏2 0 l 。这可能与溶液p h 值变化导致溶液中正负电荷的量发生改变有关，但具体原因尚不清楚，生物反应一般都在p h 7 0 的溶液中进行，并且使用缓冲溶液可以在一定范围内维持溶液p h 的稳定，以消除p h 的干扰。溶液的体积对石英晶体的频率没有影响。1 1 3 2 液相压电测量的实现方法如果简单地将石英电极放到溶液中，振荡就会被严重衰减。显然，s a u e r b r e y 方程并不适合晶体在溶液中的行为。一种方法是将液体样品转化为气体，再进行测定。但是有些样品不适合于气化，且这样做会使成本大大提高，克服晶体在溶液中振动衰减的一个简单可行的方法是，先在干燥条件下测得基础频率f l ，然后在溶液中进行样品吸附，经干燥后再测频率f 2 ，由此可测出样品的吸附量。m u r a m a s t s u 2 1 】等用这种方法测定了白假丝酵母菌，所用的特异性吸附剂为抗c a n d i d a抗体，细胞浓度现行范围为1 0 6 - 5 x1 0 8 个m l ，响应时间为3 m i n ，传感器对啤酒酵母菌几乎不产生响应。另一种抗衰减的方法是选用高频( 2 0 m h z ) 石英晶片，涂膜压电石英晶体探测器在溶液中可以测定链霉抗生素蛋白和其他一些抗原物质。如果在背景缓冲溶液中检测，则要控制溶液的温度，使其保持一定、离子浓度( n a c i 浓度)低于0 2 5 m o l l ，p h 7 0 且保持恒定，使用微量进样器小心加样，不可搅动背景溶液。3中国农业科学院硕十学位论文第一章引言1 1 4 单面触液压电晶体传感器压电晶体仅有一面接触样液，另一面则面向气相。它对晶体表面质量负载及溶液的粘、密度有选择性影响。频率稳定性也好。当液相介质的组成无显著变化时，它只对质量变化响应，故常用于电化学测试中，作为电化学石英微天平( e q c m ) 2 2 - 2 5 1 。1 2 压电免疫传感器检测方法的实现1 2 1 抗体的固定将抗体或抗原固定在晶体表面的方法有很多，固化层的形成与石英晶体电极的材料、电极表面状态( 受温度、溶液性质等因素的影响) 的关系密切【2 6 】。不同的电极材料决定了不同的固化方法，如金电极最适合于硫醇分子形成s a m ( 自组装单层膜) ，金电极还易于吸附蛋白质，故可用于直接固定蛋白大分子，铅、铝等的表面易于氧化并形成富含o h 的活性表面，可通过硅烷化法等间接方法进行固定。1 2 i 1 非特异性吸附蛋白间接固定法( 蛋白a )蛋白a ，又称葡萄球菌蛋白，蛋白a 是金黄色葡萄球菌细胞壁正常组分中的一种多肽，可牢固的吸附在金电极上。蛋白a 上有4 个高亲和力结合免疫球蛋白分子f c 片断的位点。每次可以有2 个位点与f c 片断结合而不影响抗体蛋白的活性【2 7 之9 1 。应用时直接将蛋白a 溶液( p h 7 4 ) 涂覆在金电极表面，温育一段时间后，弃去多余液体，用p b s 洗净后即可用来固定抗体。但蛋白a容易失活例，它的活性直接影响到抗体固定的效果。1 2 1 2 自组装单层膜( s a m ) 法s a m 法的原理是在未被氧化金电极表面通过烷基化过程形成强的金属硫醇键，并在膜表面引入可与抗体抗原反应的基团，如：c o o h 、n h 2 、- o h 等，而不影响连接抗体或抗原的活性。如短链烷基硫醇：3 巯基丙酸( m p a ) ，可用来生成羧酸化的单分子膜 2 s - 3 0 1 。1 2 1 3 戊二醛交联法戊二二醛是一个常用的双功能试剂，很容易使蛋白交联，这种交联是通过蛋白中赖氨酸残基进行的，先在晶体电极表面建立一层惰性疏水物质如聚乙烯亚胺( p e i ) ，然后再用戊二醛作交联剂与抗原或抗体结合【3 1 - 州。抗体的固定方法有很多，主要是以上三种，还有根据这三种方法衍生、改进得到的许多固定方法，可大大提高抗体的固定量p 5 3 8 】1 2 2 抗原的检测1 2 2 1 直接法4中国农q k 科学院硕七学位论文第一章引言直接法是目前使用的最简单、最普遍的检测方法，即用抗原( 抗体) 与固定于晶体表面的抗体( 抗原) 之间的免疫反应，根据晶体频移值直接计算抗原( 抗体) 的含量。其特点是操作简单、快速，但要求被测物分子质量较大，所以通常只能用于大分子抗体或抗原的测定，并且无伴存物质干扰，如若同时存在非特异性吸附物质，所得的频移值即不能反映被测物的真实含量 3 9 1 。1 2 2 2 夹心法一种夹心法是在测定抗体时，先在晶体上固定相应的抗原( 或包被抗原) ，将其浸入含有待测抗体的样液中，再浸入含有过量的可以和所测抗体进行选择性反应的物质( 例如抗i g g ) 的溶液中，记录频移值，根据频移值计算待测抗体的含量。另外用已知量抗体按同法制取校正曲线，由待测抗体的频移值参照校正曲线可获样液中抗体的含量 4 0 - 4 2 1 。另外一种夹心法是测定具有两个以上抗原决定簇且获得了两种单抗的抗原时，先在晶体上固定相应的一种单抗，将其浸入含有待测抗原的样液中，再浸入含有过量的另外一种单抗溶液中，记录频移值，根据频移值可得出待测抗原的含量。1 2 2 3 竞争法竞争法尤其适合小分子半抗原的检测。先把抗体固定在晶体表面，再浸入含有一定量的包被抗原( 半抗原与卵清白蛋白( o v a ) 或牛血清白蛋白( b s a ) 联接) 和待测半抗原的溶液中，溶液中一定数目的包被抗原与待测小分子半抗原竞争与同定的抗体相结合，竞争结果使频率发生变化，由频移值值参照校正曲线即可得出样液中待测抗原浓度。用竞争法检测小分子半抗原可明显提高检测灵敏度，提高信噪比，减少非特异性结合 4 3 ，4 4 1 。1 2 2 4 基于酶催化沉积质量放大法由于夹心法灵敏度仍取决于分析物的量，而基于酶催化沉积质量放大的免疫传感器可以克服这一缺陷。在夹心法分析基础上制备酶标二抗，催化底物溶液，产物沉积在传感器晶体表面，引起晶体频率的下降，传感器的灵敏度不仅取决于固定的分析物的量，而更重要取决于酶催化生成的产物的量【4 5 1 。1 3 压电免疫传感器的应用研究现状及发展趋势1 3 1 在食品安全检测中的应用研究传统的食品中有害物质的检测一般为高效液相色谱、气谱或质谱等仪器分析，是经典的分析方法，可精确定量，但对设备、操作人员均具有较高要求，且前处理复杂、耗时较长、不能实现即时、在线检测；传统的食品微生物检测中，检测病原性的细菌和真菌的方法一般采用平皿计数法，它需要对微生物进行培养，耗时较长，需要几天甚至十几天时间，应用免疫传感器进行检测可大幅度缩短时间，简化操作程序，适应食品工业生产的需要4 9 j 。n 6 r a 等【5 0 】研制的检测大肠埃希杆菌压电免疫传感器，检测范围为3 1 0 4 - 3 1 0 7c f u m 1 。5中围农业科学院硕十学位论文第一章引言s u 等【5 1 】研制的检测埃希氏菌属大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的石英压电免疫传感器，检测致病菌的浓度范围为1 0 3 。1 0 8c f u m l ，检测限为1 0 2 c f u m l ，检测时间为3 0 5 0 m i n 。g o s s e t t 等【5 2 】研制了检测葡萄球菌肠毒素b ( s e b ) 的压电免疫传感器，该传感器尺寸为毫米级，能在流动体系中检测s e b ，样品溶液流速为l m l m i n ，s e b 的检测限在1 2 5 巧op g m l 之间，用p h 2 0 的h c l p b s 溶液可实现传感器再生。陶涛等【”】研制了一种检测蝮蛇毒的压电免传感器，用巯基丙酸在镀银电极石英晶体表面自组装巯基丙酸单分子膜，偶联抗蝮蛇毒球蛋白构建传感器探头，研制的传感器最低检测浓度为0 1p g m l ，检测限范围为o 1 巧0 u g m l 。1 3 2 在医学诊断中的应用研究压电免疫传感器作为一种新型生物免疫检测系统，可以对多种抗原或抗体进行快速的定量测定及反应动力学研究，具有高特异性、高灵敏度、响应快、小型简便等特点，克服了e l i s a ( 酶联免疫吸附分析) 、r i a ( 放射免疫分析) 、f i a ( 荧光免疫分析) 等免疫检测方法需要标记及操作复杂等缺点，对传染病、恶性肿瘤、自身免疫病、血液疾病的早期诊断具有广阔的临床应用前景 5 4 - 5 6 1 。s h e n 等【5 7 】研制了直接法检测癌胚抗原( c e a ) 的压电免疫传感器，为了提高传感器的灵敏度，将蛋白a 定向固定化与免疫反应催化剂聚乙烯二醇( p e g ) 结合来放大传感器频率信号。c e a的检测线性范围为6 6 7 。4 6 6 7 n g m l ，临床检测结果与化学发光免疫分析方法相当。1 3 3 在环境中监测的应用研究有相当一部分农药如莠去津等作为谷物等农作物中杂草控制的同时，由于其不易分解，保留时间长，长期残留在土壤、水中，给环境带来了长期的负面影响，压电免疫传感器由于其灵敏度高，能分别在气相、液相中实现对特异性物质的监测，因此可用于环境中水、土壤、大气中的污染物的检测f 5 s - 6 0 l 。s t e e g b o m 等【6 1 】自主研制的一种压电免疫传感器利用竞争法原理检测除草剂阿特拉津，即把固定在晶体上的抗原和待测的游离抗原与其单克隆抗体竞争结合，通过晶体频移值的大小测定它的浓度含量，游离抗原的检测浓度范围为0 1 1 n g m l 。1 3 4 压电免疫传感器的发展趋势压电免疫传感器目前仍存在一些问题，如在液相检测中稳定性、重复性较差；采用气相测定使晶片起振容易，避免非特异性吸附的影响，取得了较好的线性关系，但同时也增加操作时间，且干燥过程对蛋白质的活性有损害，会缩短传感器寿命；而压电免疫传感器与流动注射分析技术结合可以缩短时间，简化操作程序，稳定性较好，但灵敏度较气相检测低。此外压电免疫传感器的再生也是一大难题，但其结构简单、成本低廉、响应灵敏、不需要任何标记、易于实现自动化等特点，已经并将继续在生物传感器领域中发挥重要作用。目前压电免疫传感器已朝着向小型便携式、能同时检测多种样品的传感器阵列方向发展，并且其稳定性、重复性和再生性正逐步得到改善和提高。6中囝农业科学院硕l j 学位论文第一章引言1 4 本研究的立题依据及意义甲基对硫磷( m p ) 作为一种有机磷杀虫剂、杀螨剂曾被广泛应用于控制农业中谷物、水果、蔬菜中的虫害，近年来甲基对硫磷不仅被单独使用，还常常与氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类农药混配使用【6 2 1 ，造成环境污染和危害，甚至引起急性中毒。甲基对硫磷属高毒杀虫剂，具触杀和胃毒作用，能抑制害虫神经系统中胆碱酯酶的活力而致死，杀虫谱广，常加工成乳油或粉剂( 见农药剂型) 使用，主要用途是防治多种农业害虫，其作用机制及杀虫谱与对硫磷相似。由于其毒性较高，p m 被美国环境保护机构( e p a ) 列入一级毒性化学品 6 3 j 。甲基对硫磷可通过食道、呼吸道和皮肤引起中毒，一旦被人体摄入，对人们健康会造成严重的威胁。轻度中毒者有头痛恶心、呕吐多汗、胸闷无力等症状；重者可有肺水肿、昏迷、脑水肿等并发症【6 4 1 。国家明确规定从2 0 0 7 年1 月1 日起，禁止甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、久效磷和磷胺这5 种高毒有机磷农药在农业上使用，只保留部分生产能力用于出口。虽然甲基对硫磷已被禁止在蔬菜、水果上使用，但在农产品的进出口贸易、食品和环境安全的监督检测中，为防违规使用，甲基对硫磷等一类高毒化合物仍然是常规检测的重要污染物瞰j 。稻谷和棉籽油中甲基对硫磷的最大残留限量标准均小于0 1 m g k g 。传统的甲基对硫磷残留分析方法一般为气相色谱法和液相色谱法，但传统的仪器分析方法对仪器要求较高、耗时长、操作繁琐、前处理工作复杂，难以满足快速检测的需要 6 6 】。免疫分析为环境和农业中痕量农药残留物提供了一种简单的分析方法，在过去的二十年里，免疫分析方法，尤其酶联免疫分析方法( e l i s a ) 得到迅速发展，日益显现其重要性。对于对硫磷，甲基对硫磷的二乙基酯键替代物，已经建立了对其免疫分析方法，抗对硫磷的多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体的免疫分析应用，以及他们与甲基对硫磷的交叉反应情况已有许多文献报道【67 吲，e l i s a基于多克隆抗体检测p m 的方法建立以及在食品中的应用也已经有过报道，这些方法检测p m 的检测限为0 0 5 n g m l 删。e l i s a 是当前检测甲基对硫磷残留的较普遍和理想有效的方法之一，但难以进行现场检测和在线检测。基于质量响应的压电免疫传感器是近年来发展的一种快速免疫检测技术，其结构简单、成本低廉、快速灵敏，更适合现场、在线检测。目前已有关于检测甲基对硫磷的压电免疫传感器报道唧，加】，这些传感器的检测原理是直接法检测甲基对硫磷，检测限为0 0 5 n g m l 。本文试图从优化抗体固定方法和改进甲基对硫磷检测原理的角度对甲基对硫磷的压电免疫传感分析技术进行研究，以提高灵敏度等指标，研制适合现场检测的甲基对硫磷压电免疫传感器，同时也为实现农药多残留免疫传感检测提供技术支撑。7中国农q k 科学院硕+ 学位论文第二章基于直接法柃测的甲幕对硫磷乐电免疫传感器研制第二章基于直接法检测的甲基对硫磷压电免疫传感器研制基于直接法检测的甲基对硫磷压电免疫传感器检测甲基对硫磷的原理是，用固定在传感器石英晶体金电极上的抗体直接检测待测样品中游离的甲基对硫磷。它是最常见、最简单的检测抗原方法。目前已报到的压电免疫传感器绝大多数是基于直接法原理，具有快速、直观、简便等特点。将抗体固定在传感器的敏感元件石英晶体金电极上是制作传感器的关键点，常用的固定方法有蛋白a 法、巯基自组装膜法、戊二醛交联法、l b 膜技术等，本章针对蛋白a 和巯基自组装膜法进行研究，比较了两种方法的固定效果。采用的巯基自组装膜法是利用十六巯基烷基酸( h s c h 2 ( c 0 2 ) 1 5 c o o h ，m d h a ) 在金电极表面子组装成膜，再通过1 乙基一3 ( 3 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺( e d c ) 和n 一羟基琥珀酰亚胺( n h s )修饰，便可与蛋白氨基偶联的原理，将甲基对硫磷抗体固定在金电极表面，如图1 所示。m d h a是一类烷基硫醇物质，烷基硫醇类自组装膜( s a m s ) 的形成过程主要经历两步【7 1 j ：第一步，从低密度气相态到低密度结晶岛的凝聚，这一过程中硫醇分子平辅在基底表面；第二步，当结晶岛同相把基底表面完全覆盖而达到饱和时，平铺的分子通过侧压诱导重新排列成沿表面方向，向高密度相转移，最终形成单分子膜。烷基硫醇稀溶液在金电极表面的吸附动力学表明，成膜过程中存在两步动力学过程【7 2 l ：第一步，已开始组装速度非常快，只需几分钟，接触角便接近最大值，膜厚度达到8 0 9 0 ，这一步可认为是扩散控制的l a n g m u i r 吸附；第二步，几小时后接触角达到饱和值，这一步成为结晶过程。对于巯基自组装方法固定抗体的效果本文主要是从由该方法固定抗体所引起的频率下降值和抗体同定前后的循环伏安图来比较的，并且探索了该方法固定抗体的最佳实验条件。同时探索了基于直接法的甲基对硫磷压电免疫传感器测定甲基对硫磷的效果。a uh s c h 2 ( c h 2 ) i s c o o h+c ! 1 3 1 1 1 1 2 、i 【。1 1 2 ) 1 n i i ( 【1 1 o zi e i r 啦k 石n t i i 。d，气u 盼 厂、厂、c 4 1 n? 丁oo门c - o n沪_ jaa u - s 厂、，图1 巯基自组装膜法原理图f i g 1t h ep r i n c i p l ec h a r tf o rs a m8巨f 1 - 1，制矿吣中国农业科学院硕 ：学位论文第二章幕于直接法榆测的甲基对硫磷乐电免疫传感器研制2 1 材料与方法2 1 1 仪器与试剂2 1 1 1 试剂甲基对硫磷纯品卵清白蛋白( o v a )甲基对硫磷多克隆抗体，效价1 ：1 6 0 0 0金黄色葡萄球菌蛋白a ( 蛋白a )十六巯基烷基酸( m h d a )1 乙基3 一( 3 - 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺( e d c )n 羟基琥珀酰亚胺t r o t s )磷酸缓冲液p b s ( p h 7 2 ，0 0 1 m )p i r a n h a 试剂( 3 ：1 的浓h 2 s 0 4 和h 2 0 2 混合液)氯化钠，分析纯所用水均为双蒸水2 112 仪器d e l k a 公司f l u k a 公司本实验室自制北京本元正阳基因技术有限公司r u k a 公司s i g m a 公司s i g m a 公司天津试剂公司石英晶体，基频7 9 9 5 m h z ，a t 切型，双面抛光，直径1 3 7 m m ，中间镀有直径5 1 m m 的金盘电极上海辰华仪器厂c h l 4 0 0 系列电化学石英晶体微天平上海辰华仪器厂p h 计北京赛多利斯仪器系统有限公司3 7 恒温培养箱日本三洋公司电动磁力搅拌器德国i k a 公司温育箱o r b i t a ls h a k e r - i n c u b a t o r ( i n s e l ，u 目排枪1 2 通道德国e p p e n d o r f 公司单通道移液枪德国e p p e n d o r f 公司2 1 2 传感器检测池的安装将石英晶体固定于电解池中，电解池由三块圆形的聚四氟乙烯组成，直径3 5 r a m ，总高度为3 7 m m 。上部是盖子，用于安装参比电极和对电极。中间是盛放溶液的池体。石英晶体被固定于中间和底部之间，通过橡胶圈密封，并用螺丝固定。在石英晶体微天平测量中，晶体频率的变化可以随着时间推移而动态监测出来，在5 m i n 内晶体的频率变化值在1 h z 内，可认为晶体频率达到稳定状态。2 1 3 抗体的固定2 1 3 1 蛋白a 法9中囝农业科学院硕卜学位论文第二章基于直接法榆测的甲基对硫磷乐电免疫传感器研制将洗净吹干的石英晶体固定在检测池中，于其金电极表面滴加5 0 9 l 不同浓度的蛋白a 溶液( 0m g m l 、0 0 5 m g m l 、0 1 0 m g m l 、0 1 5 m g m l 、0 2 0 m g m l 、0 2 5 m g m l 、0 3 0 m g m l 、0 3 5 m g m l和0 4 0 m g m l ) ，3 7 温育6 0 m i n ，用p b s 和双蒸水冲净，氮气吹干后滴加5 0pl 甲基对硫磷抗体( 1 ：1 0 ) ，3 7 温育6 0 r a i n ，用p b s 和双蒸水冲洗干净，用氮气吹干，测定抗体固定前后传感器频移值。2 1 3 2 巯基自组装膜法将洗净吹干的石英晶体浸在0 2 5 的m h d a 溶液中浸泡过夜，用p b s 和双蒸水洗净，氮气吹干后将石英晶体固定在检测池中，于其金电极表面滴加5 0 9 l2 1 的e d c 溶液与5 毗l0 2 的n h s 溶液，3 7 下温育6 0 m i n ，用p b s 和双蒸水冲净，氮气吹干，再于金电极表面滴加5 0ul甲基对硫磷抗体( 1 ：1 0 ) ，3 7 温育6 0 r a i n ，用p b s 和双蒸水冲净，氮气吹干，测定抗体固定前后传感器频移值。2 1 3 3 电化学检测以3 0 m l 5 m m 的f e ( c n ) 6 3 4 ( 1 ：1 ) p b s 为电解液，以金电极为工作电极，铂电极为对电极，a g a g c l 为参比电极测定金电极固定抗体( 巯基自组装法) 前后的循环伏安曲线【7 3 】，以判断抗体固定状况。2 1 4 传感器测定条件的优化2 1 4 1 抗体包被过程的离子强度优化在抗体溶液( 1 ：1 0 ) 中加入n a c l ，使其最终n a c l 的浓度分别为5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 舢o l ，按2 1 2 3 方法进行巯基自组装膜法抗体固定，测定频移值，进行离子强度的优化。2 1 4 2 抗体包被过程中p h 的影响用1 mn a o h 溶液和1 mh c l 溶液调节抗体溶液的p h 值，使其p h 值分别为5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 0 、8 5 ，按2 1 2 3 方法进行巯基自组装膜法抗体固定，测定频移值，进行p h 值的优化。2 1 5 传感器分析标准曲线的建立固定抗体后，于检测池中注入2 0 0 t l p b s ( p h = 7 2 ，o 1 m ) ，待石英晶体振荡频率稳定后( 5分钟i 为a f l i - l z ) ，分别于检测池中加入系列浓度( 1 、5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、3 5l ag m l ) 的甲基对硫磷溶液1 0i il ，5 分钟后测定其频移值a f ，以频移值a f 对甲基对硫磷浓度作曲线，作为传感器分析标准曲线。以标准曲线中线性范围的两个甲基对硫磷浓度溶液进行5 次重复测定，计算频移值的变异系数。1 0中国农业科学院硕十学位论文第二章基于直接法榆测的甲幕对硫磷压电免疫传感器研制2 1 6 传感器的再生研究研究和比较不同再生方法对传感器的再生效果。( 1 ) 按2 1 2 3 方法进行巯基自组装膜法抗体固定，测定频移值；按2 1 5 方法加入3 0 g m l的