（发酵工程专业论文）植物乳杆菌乳酸脱氢酶发酵与提取方法研究.pdf

摘要 中文摘要 乳酸脱氢酶( l d h ) 广泛存在于动物组织、细菌和植物中，是生物体内糖酵 解过程中重要的氧化还原酶，催化丙酮酸向乳酸的转化，是重要的诊断试剂用酶。 本文以乳酸脱氢酶的开发和应用为目的，对自筛菌株植物乳杆菌r s 2 - 2 进行紫外 诱变选育高产菌株，重新优化产酶条件，提高l d h 发酵单位，进行了植物乳杆 菌发酵生产l d h1 5 m 3 发酵罐的中试研究，并对连续发酵产酶条件进行了初步研 究。经过紫外诱变和发酵条件优化，菌体酶活比出发菌株提高了6 9 3 。在2 5 l 罐发酵成功的基础上进行了1 5 m 3 发酵罐的中试实验并取得了成功，酶活达到了 1 3 0 0 u g 。 对适合工业化生产的菌体破碎条件进行了研究。根据菌体特点重点考察了高 压均质破碎法和溶菌酶破碎法的酶活释放情况，确定高压均质破碎和溶菌酶破碎 的最佳工艺条件。实验发现单独的高压均质处理和溶菌酶处理都不能够满足菌体 破碎要求。采用溶菌酶复合高压均质处理的方法能够使菌体破碎效果更佳，破碎 菌体酶活释放量达到1 4 0 0u g 。 考察了l d h 酶液和冻干粉的储存稳定性，以及加入不同稳定助剂后酶活力 的变化，发现半胱氨酸可提高l d h 酶液的储存稳定性，储存1 2 0 天后酶活力比 对照提高了6 9 。海藻糖可提高l d h 在冷冻干燥过程中的稳定性，冷冻干燥前 后可以使酶活力比对照提高3 4 。 关键词：植物乳杆菌乳酸脱氢酶紫外诱变连续发酵菌体破碎 江南大学硕十学位论文 a b s t r a c t l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ( e c l 1 1 2 7 ；l d h ) i sa ni m p o r t a n tg l y c o l y t i ce n z y m et h a t r e v e r s i b l yc a t a l y s e st h ec o n v e r s i o no fp y m v a t et ol a c t a t e t h ee n z y m e sa r ew i d e l y p r e s e n ti na n i m a l s ，b a c t e r i aa n da l s oi np l a n t s a i mo fe x p l o i t a t i o na n da p p l i c a t i o no f l d h ，t h er e s e a r c hm a i n l yf o c u s e do nt h ec u l t u r ec o n d i t i o n s ，p i l o tf e r m e n t a t i o na n d c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o no fl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ma f t e ru vm u t a g e n e s i s ，i tw a s s h o w nt h a tt h el d h a c t i v i t yi m p r o v e db y6 9 3 a f t e ru vm u t a g e n e s i s t h er e s u l t f r o m2 5 lf e r m e n t a t i o no fl d hu s h e r e d1 5 m 3p i l o tf e r m e n t a t i o n ，l d ha c t i v i t yo f 1 3 0 0 u gw a s o b t a i n e d o p t i m a lc o n d i t i o n so fc e l ld i s r u p t i o nw e r ea l s os t u d i e d h i 【g hp r e s s u r e h o m o g e n i e r , l y s o z y m ed i s r u p t i o na n ds u p e r s o n i ct r e a t m e n tw e r ee m p l o y e dt os t u d y t h ee f f e c t so fc e l ld i s r u p t i o no ft h el a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mi no r d e rt or e l e a s et h e i n t r a c e l l u l a rr e n z y m e b yc o m p a r i s o n ，i tw a sc o n c l u d e dt h a tl y s o z y m et r e a t m e n t c o m b i n e dw i t hh i 【g hp r e s s u r eh o m o g e n e s i sw a st h ee f f e c t i v em e t h o dt od i s r u p t et h e c e l l s t h ea c t i v i t yo fl d hr e l e a s e df r o mt h ec e l l sr e a c h e d1 4 0 0 u g r e s e a r c ho ns t o r a g es t a b i l i t yo fl d hs o l u t i o na n dl d hf r e e z e d r i e dp o w d e r r e v e a l e dt h a tt h es t a b i l i t yo fl d hs o l u t i o nc o u l db ei m p r o v e d6 9 b ya d d i n gc y s t e i n e ， a n dt h ea c t i v i t yo fl d hf r e e z e d r i e dp o w d e rc o u l db ei m p r o v e d3 4 b yf u c o s e k e yw o r d s ：l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m , l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ，u vm u t a g e n e s i s ， c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n ，c e l ld i s r u p t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取褥的研究成采。尽我所知，除了文中特嗣加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其谴人纛经发袭或撰写逑戆研究成莱，也不包含 本人为获褥江南大学或其它教育摊构的学位或诞书面使甩过的毒| 料。 岛我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意 笈名： 这雾 目期：2 0 - 年月协尽 关于论文使粥授权的说瞬 本攀盈论文作者完全y 解江赘丈学春关保留、笈翔学位论文豹援 定；江南大学有权保敷势向隧家有关部门城机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学彼论文的全部或部分内容编 入有关数据庠进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并蹙本人毫子交挡戆内容；甩绥凄沧文约内容糕一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 墼曼 导师签名： 基期：酗年s 嗣；o 嚣 第一章绪论 第一章绪论 i 1 概述 近年来，酶学在临床诊断与治疗中的应用发展非常迅速，利用测定酶活性的方法进行疾 病的诊断是现代医学中一个引人注目的领域，目前已有近百种酶用于临床诊断，医学诊断用 酶的需求量越来越大。 乳酸脱氢酶( l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ，e c i 1 1 2 7 ，l d h ) 是目前诊断试剂用酶中用量最 大的酶种。在肝炎检测中乳酸脱氢酶是最主要的诊断试剂。乳酸脱氢酶同工酶在恶性肿瘤、 心肌梗死、肝损伤、骨骼肌损伤和贫血等疾病的诊断和鉴别诊断中具有重要意义。因此，研 究乳酸脱氢酶的大规模制备工艺有重要的实际意义和理论价值。 1 2 乳酸脱氢酶研究背景 1 2 1 乳酸脱氢酶的来源 乳酸脱氢酶又称为n a d + 氧化酶，广泛存在于动物组织和各种微生物细胞内，催化糖酵 解的最后一步反应，即丙酮酸向乳酸的转化 2 1 。无论是在高等动物还是低等动物中，l d h 均 是借助辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d + n a d h ) 的作用可逆地催化丙酮酸与乳酸的转化 反应【3 】，其反应方程式如下： o n a d h h + 五d 辩 髓二啪+ 。； ” 丙酮酸( p y r u v a t e )乳酸( l a c t a t e ) 1 2 2 动物组织中的乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶广泛存在于心肌、肝、肾、骨骼肌、胰腺和肺中等动物组织中【9 l 。动物l d h ( l - l d h ，e c 1 1 1 2 7 ) 是一种四聚体分子，分予量为1 3 0 0 0 0 - , 1 4 5 0 0 0 t s , 6 1 ，是一个具有五种 分子形态的同工酶族，其中有两种形态分别由同一种亚基组成，这两种l d h 是主要分布于心 肌中的h 4 和主分布于骨骼肌中的m 4 ；另三种l d h 分别由混合亚基组成，它们分别为h a i 、 h 2 m 2 和l - i i 3 。在任何形态的l d h 中，每一个h 或m 亚基均含一个具有催化功能的活性中 心。对于混合亚基的四聚体，如h 3 m ，它的催化动力学性质与3 ：1 的h 4 、m 4 的混合物是相 同的，这表明不同种类l d h 分子中相同亚基的活性中心非常相似，并且每个亚基上的催化反 应之间没有显著的相互作用。 自从1 9 3 2 年b a n g a 4 等发现肌肉细胞抽提物可催化l 乳酸生成丙酮酸，来自不同生物种 1 墨k 垩查查兰堡主兰垡堡壅 类的l d h 的性质和催化功能已经得到广泛的研究，人们对该酶的兴趣在于它在糖酶代谢过程 中所起到的重要作用。当生物有机体体内暂时性缺氧时，糖酵解产物丙酮酸不能进入三羧酸 循环，l d h 催化过量的丙酮酸生成乳酸，使乳酸得以积累，以便在氧气充足时重新氧化生成 丙酮酸，此过程能有效的调节生物体内n a d + 与n a d h 的平衡。 源自动物组织l d h 的部分性质见表1 1 。 表1 1 动物组织中提取得到的l d h 的性质 t i b l e1 - ll d he h a r a c t e r se x t r a c tf i o ma n i m a lt i s s u e s 1 1 1 2 7l a c t a t e p i gh e a r t 1 3 5 d e h y d r o g o xh e a r t 1 3 6 e r a s em o u s e1 4 0 t e s t i s d o g f i s h 1 4 0 m u s c l e c t a b1 4 0 m u s c l e 2 7 h 4 ，h 3 m ，h 2 m ：，h 3 6m 3a n d m 4 3 7 7 i s o e n z y m e s 3 5 3 5 目前工商业和医用的l d h 主要来源于猪、兔和牛的心肌或骨骼肌，而从其它动物包括海 洋生物中提纯到的l d h 都只是作为酶的性质或酶的作用机理的研究【1 0 l 。 1 2 3 细菌中的乳酸脱氢酶 细菌乳酸脱氢酶可分两种，一种是以n a d + 为辅酶的乳酸脱氢酶( n a d d e p e n d e n tl d h ， n l d h ) ，另2 种是含有细胞色素c 、f a d 或f m n 的乳酸脱氢酶( n a d i n d e p e n d e n tl d h ，i l d h ) ， 属非依赖n a d + 型1 7 8 】。i l d h ( e c 1 1 9 9 ) 催化乳酸生成丙酮酸，i l d h 在厌氧和好氧培养的 细菌中均可存在 1 7 , 1 8 1 。乳酸菌i l d h 存在于细胞质中，其它细菌的i l d h 多结合在细胞膜上。 n l d h 位于细胞质中，是e m b d e l lm e y e r h o f p a t h w a y 产能过程中的关键酣“l ，主要用于催化丙 酮酸生成乳酸。所有的乳酸菌都存有大量的n l d h ，这些酶都是细胞质酶【1 2 】。细菌l ( + ) n l d h 的分子量普遍认为是1 4 0 0 0 0 t 1 3 q 5 1 ，这些n l d h 均是以四聚体存在，它们也可以在不同的条件 下分解成亚单位，如$ e p i d e r m i d i s 1 6 1 的n l d h 在p h 5 6 时的分子量为1 2 0 0 0 0 ，在p h 6 5 0 0 时分子量为6 8 0 0 0 ，在p h 8 5 和p h 2 0 时分子量为3 6 0 0 0 。细菌中与哺乳动物l d h 一致的是 n l d h ，它们均具有高度的专一性，而且在一定条件下受乳酸和丙酮酸的抑制作用。本论文所 研究的是n l d h ，所以后面所说的细菌l d h 均是指n l d h 。 微生物细胞内的l d h 没有发现同功酶现象，其保守性远不如动物组织，不同菌种的l d h 2 里二里竺堡 的性质有较大差异，甚至同种细菌不同菌株的l d h 性质也会存在一定差异。如g a s s e r 1 6 1 等从 l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 中分离出的n l d h 催化丙酮酸的最适p h 为5 3 ，而从l a c t o b a c i l l u s f e r m e n t u m 中分离得到的n l d h 催化丙酮酸的最适p h 高达8 6 。 1 2 4 细菌乳酸脱氢酶的研究概况 由于细菌l d h 性质的多样性，关于细菌l d h 的研究，多集中在酶学性质上。自1 9 6 4 年w o l i n l 2 0 等研究发现乳链球菌l d h 的催化活性需要f d p 的激活后，二十世纪六十年代末 到八十年代初，各种细菌l d h 的性质均得到一定的研究，如b i f i d o b a c t e r i u m 、l a c t o b a c i l l u s ， s t r e p t o c o c c u s 等细胞内都发现有类似的l d h 存在。1 9 7 7 年，v l c r o w t 2 l l 等人利用s t r e p t o c o c c u s l a c t i s 在5 0 l 罐中以厌氧搅拌式发酵生产l d h ，经离子交换和亲和层析纯化后，酶蛋白纯度 高达1 4 0 0 u r a g 。 近年来，通过分子生物学方法，高效表达l d h 的基因，提高细菌l d h 的产量吸引了不 少研究者的兴趣。如d a v i d 嘲利用p k k 2 2 3 3 质粒克隆并表达了b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s l - l d h 的结构基因，它在e c o l l 中表达量占细胞蛋白的3 6 。1 9 9 2 年，r o x a n a 2 3 l 将 l a c t o c o c c u s l a c t i s 中编码受f d p 激活的l - l d h 的l d h 基因克隆到e c o l l 中进行表达，并对基 因功能以及该基因在染色体上的位置进行了研究。 目前，制备l d h 的方法一般是从动物脏器尤其是心肌和骨骼肌中提取。由于动物脏器组 织中酶系复杂，组分随原料来源的不同而变化，得到的是乳酸脱氢酶同工酶的混合体，又同 工酶催化同一生化反应，结构和性质又有很多相似之处，因此，制得高纯度的l d h 不是易事。 而细菌中酶系稳定，易于大规模培养。因此，发酵法生产l d h 有较大的理论研究意义和实际 应用价值。 由微生物发酵法制各l d h 已得到了一定的研究。国内外对细菌l d h 研究的菌种主要有 乳酸杆菌、明串珠菌、乳酸链球茵、嗜热菌属等，其中乳酸菌中的l d h 的活力相对较高。菌 种的培养多采用无氧搅拌方式，并在发酵过程中流加碱液以维持p h ；细胞壁的破碎方法大多 利用机械方法，这种方法几乎不对n l d h 构成损伤，酶的分离纯化比动物l d h 的提取相对简 易。 1 3 乳酸脱氢酶的应用 l d h 的应用较为广泛，在用于分析其他酶和生物制品时有着重要的价值。l d h 是检测其 他酶的一个通用辅助酶，如检测丙氨酸氨基转移酶( a l t ) 、a t p 酶【2 5 1 、肌激酶 2 0 - i 以及丙酮酸 激酶【2 刀p s ) 等。例如丙氨酸氨基转移酶是一种常用的临床诊断酶。1 9 9 9 年，郑国爱洲从乳酸 杆菌发酵液中经两次层析，得到纯度较高的l d h ，酶的比活了达6 7 8 9 u m g ，酶的热稳定性 强于来自猪心的l d h ，用该酶配制成临床诊断试剂盒测定丙氨酸氨基转移酶的活力，质量达 到国外质量较好的同类试剂盒水平，可代替进口的临床诊断试剂盒。当组织发生病变时，细 胞中a l t 大量释放入血液中，使血清中该酶活性增高。例如，心肌型( h 型) l d h 同功酶在 血清里活性增高，而丙氨酸氨基转移酶活性正常，肌酸激酶酶谱异常，这样就可排除肝脏疾 垩堕奎主堡主堂堡堡奎 病，而肯定心肌病变。并且随病情好转酶活性也恢复正常。因此在术后、放化疗的疗效判断、 复发、转移及预后判断上均有一定价值。 l d h 是糖酵解过程中的一个酶，近年来发现l d h 及其五种同功酶在胚胎和肿瘤组织的 同功酶谱很相似，因此在肝癌、白血病等的临床诊断上也具有重要价值 3 0 l 。l d h 的最大用量 还在于医学临床诊断试剂上，可用于生产应用乳酸脱氢酶作为临床诊断试剂的测定试剂盒等， 用于心肌梗塞、急性实质性肝损伤、肝癌、肺癌、白血病的早期诊断和鉴别诊断。l d h 同功 酶也可做为项常规体检项目，通过同功酶检测即可了解全身健康状况，从而对疾病早期发 现、早期治疗。l d h 的同工酶是最早应用于临床诊断的同工酶，在一般情况下，血清中的 l d h 含量很低，当某一特定的器官或组织发生损伤时，细胞内的l d h 被释放出来，并进入 到血浆中。此时测定血清中的l d h 的电泳图谱以及酶的活性的增高情况，在一定程度上，可 反映出组织器官的病变j 。 近年来世界上有许多专利涉及用酶法转化乳酸生产丙酮酸，l d h 作为一种经典的催化 酶，在酶法转化乳酸生产丙酮酸的研究中一直扮演着重要的角色。但是在此反应中，由于辅 酶n a d + 为小分子化合物，很难固定，不易再生，而且价格昂贵，这些因素限制了l d h 在酶 法转化乳酸生产丙酮酸方面的应用。 1 4 本课题意义 l d h 在商业及临床诊断上的广泛应用，且随着医学科技水平的飞速发展对l d h 的用量 越来越大，人们极力从不同组织、细胞中提取或发酵生产l d h 。目前，市场上日本东洋坊公 司l d h 价格为o 虬1 2 $ k u 。国内试剂生产厂家所用l d h 需要进口，手续烦琐，供货不及 时，很大程度上影响了相关诊断试剂的生产。 本实验室研究发现：动物组织酶系复杂，组分随原料来源的不同而变化，提取l d h 工艺 复杂，产品成本高，而细菌中酶系稳定，易于大规模培养，纯化工艺稳定。因此发酵法制备 l d h 有较大的理论研究意义和实际应用价值。而且利用细菌发酵法生产l d h ，其生产不受原 料限制，厌氧发酵动力能量消耗小，适用于大批量生产。但是厌氧菌的分批发酵具有菌体量 低【”】、发酵强度不高的缺点。而连续发酵则可减低非生产时间，实现整个过程的连续化，节 省劳动力，提高发酵设备的利用率，从而提高发酵效率。 l d h 是胞内物质，分离提取这类产物时，必须将细胞破壁，使产物得以释放。细胞破碎 方法通过影响细胞和酶变性而影响提取效果因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤， 破碎技术的研究更引起了广泛的关注【3 6 】。本文对菌体破碎的最佳条件及方法进行了研究。以 超声破碎法考察了菌体酶活的总含量。考察了高压均质破碎和溶菌酶破碎的酶活释放情况， 并考察了高压均质破碎和溶菌酶破碎的最佳工艺条件。作者发现，单独的高压均质处理和溶 菌酶处理都不能够满足菌体破碎要求。最终通过溶菌酶处理后再进行高压均质处理的联合作 用方法使菌体完全破碎，破碎后的菌体酶活释放量达到甚至超过超声破碎的效果，可以很好 的满足工业化生产的要求。 4 苎二皇堑堡 1 5 研究的主要内容 本论文研究的目的在于通过诱变选育的方法获得l d h 活力较高的菌株，对培养基和产酶 条件进行进一步的优化提高l d h 发酵单位；在此基础上进行了中试实验；为实践微生物发酵 生产l d h 做前期工作。具体研究内容如下： l 、 以实验室保藏菌株r s 2 2 作为出发菌株，经紫外诱变，选出遗传稳定、产酶量高的 突变株。 2 、对诱变高产菌株培养条件进行了优化，研究以工业原料代替实验室药品作为培养基 发酵产l d h 。 3 、l d h 批次发酵中试研究。 4 、连续发酵产l d h 研究。 5 、不同破壁方法对菌体破碎的效果。 6 、l d h 稳定性及添加稳定助剂的研究。 江南大学硕士学位论文 第二章l d h 高产菌株的诱变选育及培养条件优化 2 1 概述 诱变育种可以提高菌株生产能力、改进产品质量、扩大品种和简化工艺。因而广泛应用 于微生物育种。本文在前人工作的基础上，对乳酸短杆菌株r s 2 - 2 进行了紫外诱变育种以获 得高产菌株，并对诱变后所得到高产菌株的培养条件包括培养基成份及发酵工艺进行了优化 以提高发酵水平。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌种 实验室保藏菌株r s 2 - 2 2 2 2 培养基 1 b c p 平皿( g ，l ) ：酵母膏2 5 蛋白胨5 葡萄糖5 溴甲酚紫o 0 4 琼脂1 5 。 2 种子培养基( g l ) 蛋白胨1 0 酵母膏2 5 葡萄糖5 。 3 发酵培养基( g l ) 麦芽糖1 5 酵母膏1 0 乙酸铵2k z h p 0 4 2n a c l2 4 斜面保藏培养基( g l ) 葡萄糖5 酵母膏2 5 蛋白胨5c a c 0 3 1 0 琼脂1 5 5 基础培养基a ( g l ) 酵母膏5 蛋白胨5k 2 h p 0 4 2 6 基础培养基b ( g l ) 葡萄糖1 0 酵母膏5k 2 h p 0 4 2 以上培养基用n a o h 溶液调p h 6 5 左右，1 2 1 高压灭菌1 5 m i n 2 2 3 主要仪器 t g l 1 6 g 台式高速离心机 u v - 7 5 4 紫外可见分光光度计 3 0 3 b 2 型电热隔水式恒温培养箱 c f 7 0 2 高速冷冻离心机 2 5 0 w 超声破碎仪 立式高压蒸汽灭菌锅 精密数显酸度计 电热式恒温水浴锅 电子天平 w f h 2 0 3 型紫外灯 6 上海医用分析仪器厂 上海分析仪器总厂 通州市沪通制花机械设备厂 日本日立公司 无锡超声设备有限公司 上海医用核子仪器厂 上海天达仪器有限公司 上海医疗器械五厂 北京赛多利斯天平有限公司 上海精科实业有限公司 第二章l d h 高高产菌株的诱变选育及培养条件优化 2 2 4 主要试剂 n a d h ( a r ) 考马斯亮兰g 2 5 0 ( a r ) 葡萄糖( a r ) 酵母膏( a r ) k 2 h p 0 4 ( a r ) 琼脂( m u 8 8 磷酸( a r ) 乳酸( a r ) 甘露醇( a r ) 蔗糖( a r ) 乳糖( a r ) 氯化铵( a r ) 硝酸钾( a r ) 硝酸钠( a r ) 丙酮酸钠( a r ) 牛血清蛋白( a r ) 蛋白胨( a r ) 溴甲酚紫( a r ) n a o h ( a r ) c a c 0 3 ( a r ) 9 5 , 醇u 柠檬酸三钠( a r ) 麦芽糖( a r ) 山梨醇( a r ) 果糖( a r ) 乙酸铵( a r ) 硫酸铵( a j u k o ( a r ) 2 2 5 实验方法 2 2 5l 酶活测定方法 在酶催化反应过程中，将n a d h 转化为n a d 。n a d h 在3 4 0 n m 处有特征吸收峰值，酶 在催化反应过程中n a d h 在3 4 0 n m 的吸光度不段降低，因此连续测定3 4 0 r i m 的吸光度的变 化即可计算出酶活。 一个酶活力单位定义为：2 5 c ，每分钟氧化lum o l 的n a d h 所需要的酶量。酶活力的 计算公式为： l 一( u n i l ) ( 2 1 ) 6 2 2 v s v 广反应总体积( n i l ) ； v s - 群品体积( m 1 ) ； a a m i n 每分钟吸光度的降低值； 6 2 2 一l i tt o o ln a d h m l 的吸光度( 3 4 0 n m ) 。 酶活测定方法按照资料口2 1 。所用试剂为，2 2 7 m m 丙酮酸钠，1 0 0 r a mp n 7 4 磷酸钾缓冲 液，6 m m 还原辅酶溶液。2 8 m l1 0 0 r a m p h 6 5 磷酸钾缓冲液、0 1 m l3 5 m m 丙酮酸钠、0 1 m l 6 m m n a d h 溶液和0 0 5 m l 酶液，用紫外可见分光光度计测出。 2 2 5 2 菌体干重测定方法 取3 0 m l 发酵液于5 0 m l 离心管中，8 0 0 0 r m i n 离心1 0 r a i n 收集菌体，用缓冲液洗涤两次 后烘干至恒重称重。 7 江南大学硕士学位论文 2 2 5 3 残糖测定方法 3 , 5 二硝基水杨酸比色法【3 3 1 。 2 25 4 蛋白测定方法 b r a d f o r d 法【3 4 1 。 2 2 5 5 菌体生长曲线的测定 将斜面上的菌种活化后接到灭菌的种子培养基中，3 5 ( 2 静置培养，每隔两小时取样，用 生理盐水稀释，于6 0 0 n m 测定o d 值，以未接种的培养基作为空白，制作生长曲线。 2 2 5 6 出发菌株筛选 实验室保藏的l d h 菌种r s 2 - 2 活化后接种，于3 5 静置培养1 5 h 。梯度稀释到1 0 4 涂布 于b c p 平皿，于3 5 静置培养。选择生长较快，选择生长速度快的菌落接入保藏培养基。再 经过产酶实验，选择酶活高的菌株作为诱变出发菌株。用培养1 5 h 左右的斜面接种种子培养 液中，于3 5 c 静置培养1 5 h ，制成种子培养液。 2 2 5 7 菌悬液的制备 取对数生长期的种予培养液，8 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，弃去上清液，加无菌生理盐水，重 新悬浮菌体，再离心，弃去上清液，重复上述步骤用生理盐水恢复菌悬液。将上述菌悬液倒 入装有小玻璃珠的无菌三角瓶中，震荡2 0 - - 3 0 m i n ，以打散细胞。将菌液通过装有定性滤纸的 漏斗内过滤，单细胞滤液作为待处理的菌悬液，细胞浓度控制在1 0 8 + h a 左右。 2 2 5 8 紫外诱变 吸取4 m l 菌悬液放在直径9 c m 的培养皿中，置磁力搅拌器上，使培养皿底部离灯管3 0 c m 左右，处理前应先开灯2 0 3 0 m i n 预热。照射时启动磁力搅拌器，以求照射均匀。 分别照射2 0 s 、4 0 s 、6 0 s 、8 0 s 、1 0 0 s 、1 2 0 s ，立即梯度稀释到l o 。，选择稀释度l o 一、1 0 4 、 l o 。7 涂b c p 平皿，每个稀释度各涂3 块平皿，取未照射过的菌悬液稀释涂布，3 5 c 培养。待 菌落长好后计数，分别计算致死率。 2 2 5 9 租酶液的制备 发酵液8 0 0 0 r r a i n 离心1 0 m i n ，收集菌体，用0 0 5 m o l lp h 7 0 磷酸钾缓冲液洗涤两次， 并用同样的缓冲液制得菌悬液。将菌悬液置冰浴中，于2 0 0 w 超声波下破碎1 5 m i n ，每次间 隔l 2 m i n 。1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n 除去细胞残片，得到粗酶液。 2 3 结果与讨论 2 3 1 出发菌种筛选 苎三兰! 里坚壹查兰堕堡塑重壅垄蔓墨苎鳌查堡垡些 用实验室保藏菌株r s 2 2 来作为诱变出发菌株，按方法2 2 5 6 挑选出1 0 株生长较快， 黄色菌落大的单菌落接入发酵培养基培养进行发酵，经3 5 培养2 4 h 左右后，测定各菌株l d h 产酶量。结果见表2 - 1 。从表中结果可以看出， 6 号菌株胞内的l d h 酶活力相对较高，其细 胞抽提液酶活为9 1 6u g 。因此选6 号菌株斜面保藏，作为诱变的出发菌株。 表2 - 1出发菌株胞内酶活力比较 t a b 2 1a c t i v i t i e so f l d hf r o ms c r e e n e ds t r a i n s 2 3 2 菌株r s 2 - 2 生长曲线 将菌株r s 2 - 2 从斜面上接种到种子培养基中，于不同时间取样，按方法2 2 5 5 测定生长 曲线如图2 - 1 所示。 0 8 o 7 0 6 0 5 o o o 4 0 3 o2 时间( h ) 图2 1 菌株r s 2 - 2 生长曲线 f i g 2 - 1 g r o w t hc u r v eo fs t r a i nr s 2 - 2 由图可以看出，培养时间达2 4 h 时，该菌株的生长开始进入稳定期。诱变时宜采用对数生长 期中后期即培养1 5 1 8 h 的种子液进行诱变。 2 3 3 菌株r s 2 - 2 蘩外诱变 2 3 3 i 致死率测定 使用筛出的6 号菌株接种于种子液中，3 5 1 2 培养1 5 h ，再根据方法2 2 5 7 制备菌悬液， 然后按方法2 2 5 8 将制得的菌悬液照射不同的时间，并梯度稀释于b c p 平板上。通过计算活 9 江南大学硕士学位论文 菌落数测定不同时间诱变作用下的致死率。 邑 静 鼷 睿眷 图2 2 菌株r s 2 - 2 紫外诱变致死率 f i g 2 2f a t a l i t yr a t eo f u vm u t a n t s 致死率高则突变率也高，但是诱变株的回复突变率及负突变相应也高。因此，对菌株诱 变时宜采取中等致死率强度处理，获得的诱变株较稳定。所以本实验中对菌株诱变时选择诱 变时间6 0 s ，致死率8 3 左右的诱变强度作为实际诱变参数。 2 3 3 2 菌种r s 2 - 2 诱变 取斜面保藏的6 号菌株，先制成种子液，再制成菌悬液，置于紫外灯下照射6 0 s ，梯度， 选择1 0 4 、1 0 巧、l 驴稀释度，涂布于b c p 平皿，在3 5 。c j 辚2 4 h 左右。在b c p 平皿上初筛 出4 0 株生长较快，黄色圈大的单菌落接入斜面进行传代。初筛菌株经复筛( 产酶实验) 后， 细胞抽提液l d h 酶活见表2 - 2 。 表2 - 2 第一次紫外诱变筛选结果 t a b 2 - 2s c r e e n i n gr e s u l t sa f t e rf i r s tu v m u t a g e n e s i s 1 0 苎= 皇兰里望壹壹主堕堡塑堡奎垄塞墨堡鲞查! 垡丝 从表中可以看出，出发菌株经诱变之后，胞内l d h 酶活力有一定变化。1 7 、2 0 、2 3 、 3 2 、3 4 号突变株产酶能力都有所提高，细胞抽提液酶活分别为：1 3 2 8 ，1 3 4 6 ，1 3 3 4 ，1 3 4 2 ， 1 3 3 8 u 儋。 将上述1 7 、2 0 、2 3 、3 2 、3 4 号菌种进行二次紫外诱变，于b c p 平皿上筛出2 0 株生长较 快，黄色圈大的单菌落接入斜面进行传代。初筛菌株经产酶实验后，细胞抽提液l d h 酶活见 表2 3 。 表2 - 3 第二次紫外诱变筛选结果 t a b 2 - 3s e r e e n i n gr e s u l t sa f t e rs e c o n du v m u t a g e n e s i s 从上表可以看出，经过第二次紫外线照射，菌株产酶能力几乎没有提高，说明经过第一 次紫外诱变后，紫外线照射对菌体产酶能力的提高已经很微弱。选择6 、1 1 、2 0 号产酶能力 较高的菌株分别命名为r s 2 6 、r s 2 1 1 、r s 2 2 0 ，其细胞抽提液酶活分别为1 3 6 3 、1 3 0 8 、 1 3 2 1 u g 。 2 3 - 3 - 3 突变株r s 2 - 6 遗传稳定性的检测 对高产突变株进行传代实验，检测第l 、2 、4 、6 、8 代后菌株的产酶能力。结果如表2 _ 4 所示。 表2 - 4 高产突变株遗传稳定性的检测 t a b 2 - 4 s t a b i l i t yt e s to f l d hh i g h e rp r o d u c e r s 表中结果表明，在3 株突变株中，菌株r s 2 6 有较好的遗传稳定性，在8 次传代后酶活 仍在1 3 5 0u g 以上，因此我们确定选择菌株r s 2 6 作为高产突变株并进行斜面保存。 2 3 4 突变菌株r s 2 - 6 培养条件优化 2 3 4 1 发酵时问对菌株产酶的影响 l l 坚堕查兰堡主兰竺丝苎 本实验对诱变后的菌株进行发酵产酶实验，测定酶活和菌体量，考察发酵稳定期起始时 间，确定发酵时间，发酵结果如图2 3 所示。 菌体培养至2 0h 时进入稳定期，菌株r s 2 6 的酶活和菌体量增加的幅度比较缓慢，在2 4 h 处酶活和菌体量分别达到最高的1 3 7 6 u g 和o 9 9 3 9 l ，随后酶活有所下降，可能原因是由于 乳酸的积累对l d h 的生成有抑制作用。因此选择菌株r s 2 - 6 的培养时间为2 4h 。 v ! i g 溢 培养时问( h ) 酶活一菌体量 、 v 嘲 蛙 掘 图2 3 发酵时间对菌体量和产酶的影响 f i g 2 - 3 e f f e c to f f e r m e n t a t i o nt i m eo nb i o m a s sa n dl d h p r o d u c t i o n 2 3 4 2 培养温度对菌株产酶的影响 温度是影响微生物生长的重要环境因子。一方面，随着微生物所处的环境的温度升高， 细胞中生化反应速率加快，生长速度加快；另一方面，随着温度的升高，细胞中对温度较敏 感的组成物质可能会受到不可逆的破坏。本实验将菌种培养液置于不同的温度下培养，发酵 结束后测定其菌体量和酶活，测定结果见图2 - 4 。 瓷 v 咖 垃 植 温度( ) 一菌体量一酶活 1 4 1 2 口 - 8 j v 妲 盘 柏口 图2 - 4 温度对菌株产酶的影响 f i g 2 - 4 e f f e c to f t e m p e r a t u r eo nl d h p r o d u c t i o n 由图2 - 4 可知，当培养温度为3 0 c 1 对，菌体量和酶活均较高，分别达到1 0 1 9 l 并f 1 1 3 6 9 u g 。 第二章l d h 高高产菌株的诱变选育及培养条件优化 所以选定菌株r s 2 6 适宜的发酵产酶温度为3 0 。 2 3 4 3 发酵初始p i t 对菌株产酶的影响 环境的p h 值与微生物的生命活动有着密切相关的联系，它的影响是多方面的，例如改 变细胞壁膜的通透性或改变基质的离子化状态。菌体本身具有一定的调整周围酸碱度建立最 适p h 环境的能力，但如果初始p h 不当，不仅会导致菌体生长延迟期延长，还可能严重影响 菌体的生长和产物的合成。 本研究调节培养基至不同的起始p h ，于3 0 条件下培养2 4 h ，测定结果如图2 5 所示。 在p h 6 0 7 0 范围内，菌株r s 2 6 能较好地生长，产酶能力也较高，因此由实验结果确定适合 菌株r s 2 6 产酶的培养基起始p h 在6 5 左右。此时酶活为1 3 7 2 u g ，菌体量为1 0 9 l 。 1 o o8 eo 6 1 i g 避 o4 p h 一菌体量 一一酶活 图2 5 初始p h 对菌株产酶的影响 f i g 2 - 5 e f f e c to f i n i t i a lp ho l ll d h p r o d u c t i o n 2 3 4 4 接种量对菌株产酶的影响 接种量对发酵的影响主要是影响发酵的周期。接入的最初细胞浓度高，必然会提高发酵 过程的最终细胞浓度。但接种量过大，移入的代谢废物必然较多，菌体生长会受代谢废物的 干扰而减慢，菌体提前衰老，最终菌体浓度下降，从而影响发酵水平。 本实验以不同的接种量培养菌株r s 2 - 6 ，发酵结束后测定酶活和菌体量，结果如图2 - 6 所示。从图2 - 6 可见，接种量过小收集的菌体量偏小，产酶量也偏低。接种量过大则移入的 代谢废物多，同样不利于菌体生长和产酶，所以根据实验结果选定培养菌株r s 2 6 的接种量 为8 。此时酶活为1 3 8 4 u g ，菌体量为1 0 1 e l 。 一1宕)删堆担 伽 伽 跏 啪 枷 瑚 江南大学硕士学位论文 锄 、 o v ! i g 溢 0 2 48 8 l o 21 4 61 8 接种量( ) 一。一酶活一一菌体量 0 0 一 、 0 8 咖 趁 0 7 捆 图2 - 6 接种量对菌体量和产酶的影响 f i g 2 - 6 e f f e c to f i n o c u l a t i o no nb i o m a s sa n dl d h p r o d u c t i o n 2 3 5 发酵培养基的优化 2 3 5 1 发酵培养基碳源的选择 碳是构成微生物细胞的主要成份，是细胞内贮藏物质和生成各种代谢产物( 包括酶类骨 架) 和微生物生长能量的主要来源，在培养过程中应该选择有利于产酶的碳素化合物。 在基础培养基a 的基础上，不同碳源按1 0 9 l 的量配制培养基对菌株r s 2 6 进行发酵试 验。菌株以3 5 静置培养2 4 h ，测定酶活和菌体量，结果见表2 - 5 。 表2 - 5 碳源对菌株r s 2 6 产酶的影响 t a b 2 5e f f e c to f c a r b o ns o u r c eo nl d h p r o d u c t i o n 由表中结果可知，以麦芽糖或蔗糖为碳源时，菌株r s 2 6 的产酶能力相对较高，其中以 1 4 跏 枷 啪 抛 御 咖 哪 哪 瑚 哪 啪 墨三兰1 2 坚塑壹兰堕堡堕堕壅垄蔓垄堕鲞墨竺垡些 麦芽糖为碳源时，酶活和菌体量分别达到1 4 0 8u g 和0 9 9 9 l 。确定用麦芽糖作为碳源。 2 3 5 2 麦芽糖浓度对菌体生长和产酶的影响 在确定最佳碳源为麦芽糖之后，采用不同的麦芽糖浓度进行产酶实验。结果如图2 7 所 示，随着麦芽糖浓度的增加，培养液中菌体浓度和酶活也相应增加，当麦芽糖浓度为1 2 9 l 时菌体量和酶活分别达到1 0 2 9 l 和1 4 1 7 u g 。然而当糖浓度增加到2 0 9 l 时，菌株r s 2 - 6 的 产酶能力有所下降，说明较高的糖浓度对细菌的产酶不利。从菌体量来看，麦芽糖浓度在 1 1 2 9 l 之间时菌体浓度增幅较大，至1 2 9 l 以后则渐趋平衡；从产酶能力来看，糖浓度过低 或过高均不利于菌体产酶，适宜产酶浓度在1 2 9 l 左右。因此，选用1 2 9 l 的麦芽糖浓度进 行发酵。 81 21 62 0科2 8 麦芽糖浓度( g l ) 一酶活 一一菌体量 、 。，塑 墟 图2 7 麦芽糖浓度对菌株r s 2 6 产酶的影响 f i g 2 7i n f l u e n c eo f m a l t o s e c o n c e n t r a t i o no nl d h p r o d u c t i o n 2 3 5 3 发酵培养基氮源的选择 氮源也是微生物生长不可缺少的原料，微生物细胞的原生质由蛋白质、核酸和脂类等组 成的，酶本身又是蛋白质，而氮则是蛋白质和核酸的主要元素，因此选用适合的氮源也有利 于提高产酶能力。 在基础培养基b 的基础上采用不同的氮源进行发酵试验，其中有机氮源按5 9 l 、无机氮 源按2 9 l 添加，菌株在培养基内以3 0 c 生长2 4 h 后分别测定酶活力和菌体量，结果如表2 - 6 所示。 伽 伽 眦 啪 枷 枷 n v 蝮溢 江南大学硕士学位论文 表2 - 6 氮源对菌株r s 2 6 产酶的影响 t a b 2 - 6e f f e c to f n i t r o g e n8 0 u r c o nl d h p r o d u c t i o n 由表中结果可知，乙酸铵对菌体生长和产酶比较有利。酵母膏含有丰雷的生长因子，是 发酵常用的。确定以乙酸铵和酵母膏作为菌株r s 2 6 发酵生产l d h 的氮源。 2 3 5 4 发酵培养基碳氮比的选