（食品科学与工程专业论文）开菲尔粒发酵条件优化及冷冻干燥工艺的研究.pdf

中国农业大学硕士学位论文 摘要 摘要 本论文首先对开菲尔粒中的微生物进行了分离，并对分离山的微生物的发酵特性进行了初 步研究。共分离山乳酸菌四株，醋酸菌一株，酵母茁一株，乳酸菌在牛奶中单独或复配几乎不 产酸发酵，但与酵母菌同时接种发酵时则开始产酸发酵，可见开菲尔粒中乳酸菌与酵母菌之间 存在着强烈的共生关系，同时也说明采_ l = j 纯菌种复配的方式生产开菲尔可行性并不好。 开菲尔多糖是开菲尔中的重要功能因子，且用开菲尔粒做发酵剂是产生开菲尔多糖的晟稳 定来源。本文研究了发酵乳体系中微生物胞外多糖开菲尔多糖的分离提取方法，实验结果表明 向发酵乳中添加2 的氯化钠电解质溶液，三氯乙酸添加量1 5 ( 以上清液质量为基准) 进一 步除残余蛋白质，醇沉p h 值为7 0 ，按此条件测得的多糖得率比传统方法高2 0 6 倍；以开菲尔 粒为发酵剂，在符合生产实际的情况下优化培养条件：5 的接种量，3 0 静置培养，添加1 蔗糖，可使开菲尔多糖的产量达到最高。 由于开菲尔粒做生产发酵剂难以大规模生产，因此本文采用真空冷冻干燥技术研究了开菲 尔直投式发酵剂的制作。主要对开菲尔粒的冷冻预处理、保护剂用量、保护剂成分进行了研究。 试验结果表明，采用整粒冻干，每克菌种添加3 m l 冷冻保护剂即可对开菲尔粒表面的微生物有 较好的保护效果，保护剂组成：以1 0 浓度的脱脂乳复原液为基础保护剂，添加9 的蔗糖或 5 的海藻糖。 关键词：开菲尔，发酵乳，开菲尔多糖，冷冻干燥，菌种 中国农业大学硕士学位论文 摘要 a b s t r a c t i nt h i st h e s i s ，f o u rs t r a i n so fl a c t i ca c i db a c t e r i a ，o n es t r a i no fa c e t i ca c i db a c t e r i aa n do n es t r a i n o fy e a s tw e f ei s o l a t e da n dc h a r a c t e r i z e df r o mk e f i rg r a i n ，a n dt h e i rf e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r sw e r e d e t e c t e dp r i m a r i l y t h em i l kc a nn o tb ef e r m e n t e db ys i n g l el a c t i ca c i db a c t e r i u mo rm i x e dl a c t i ca c i d b a c t e r i u m ，b u tt h em i l kc a nb ef e r m e n t e dl i g h t l yb ym i x e dl a c t i ca c i db a c t e r i aa n dy e a s t n l i s p h e n o m e n ai n d i c a t et h a tt h el a c t i ca c i db a c t e r i u ma n dy e a s ti nk e f i rg r a i nh a v eas t r o n gs y m b i o s i s r e l a t i o n s h i p i ta l s oi l l u m i n a t et h a ti ti sn o tf e a s i b l et op r o d u c ek e 丘rb yt h em i x e dc u l t u r eo fl a c t i ca c i d b a c t e r i u ma n dy e a s ts e l e c t e df r o mk e f i rg r a i n k e f i r a ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf u n c t i o n a le l e m e n t si nk e f i r a n du s i n gk e f i rg r a i na sa s t a r t e ri st h es t e a d i e s ts o u r c et op r o d u c ek e f t r a n f a c t o r si n f l u e n c i n gt h ee x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o no f k e f i r a ni nt h ef e r m e n t e dm i l ks y s t e mw e r es t u d i e d t h eo p t i m u ms e p a r a t i o nc o n d i t i o n sa r e ：t h e f e r m e n t e dm i l ka d d i n g2 n a c is o l u t i o n t r i c h o l o r o a c e t i ca c i da d d i n g1 5 ( b a s e do nt h em a s so ft h e s u p e m a t a n t ) t oe l i m i n a t er e m n a n tp r o t e i n ，a l c o h o lp r e e i l o l i t a t i o np hi s7 0 1 1 l eo p t i m u mm e t h o dt o d e t e c tk e f i r a ni st w i c eo ft h et r a d i f i o n a lm e t h o d u s i n gk e f i rg r a i na s as t a a e r ，t h eo p t i m u mc u l t u r e c o n d i t i o n st og e tk e f i r a na c c o r d i n gt op r a c t i c a lp r o d u c t i o na r e ：5 i n o c u l a t i o n 3 0 “cf o rr e s t i n g c u l t u r e 1 s u g a ra d d i t i o n k e f i rg r a i na s as t a r t e ri su n f i tf o rl a r g e - s c a l ep r o d u c t i o n t h i sp a p e rs t u d i e dt h e t e c h n i q u eo f k e f i rd i r e c t e dv a ts e ts t a r t e r f r e e z i n gp r e t r e a t m e n t ，c r y o p r o t e c t a n ta d d i t i o n ，c r y o p r o t e e t a n ti n g r e d i e n t s o fk e f i rg r a i n sw e r es t u d i e d a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ，t h ek e yf a c t o ri st op r o t e c tt h e e x t e r n a lm i c r o b e so fk e f i rg r a i n s n er a t i oo fk e f i rg r a i n st oc r y o p r o t e c t a n ti s1t o3r g m 1 ) n e c r y o p r o t e c t a n tc o m p o s i t i o nj s1 0 r e c o v e rs k i mm i l k a d d i n g9 s u g a ro r5 t r e h a l o s e k e yw o r d s ：k e f i r , f e r m e n t e dm i l k ，k e f i r a n ，l y o p h l i z a t i o n ，s t a r t e r 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：讳绰 时间：即彩年占月广日 | 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名 移绎 存谤 帆硼年莎月伊 舸伊6 每6 只小 中国农业大学硕上学位论文 第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论 开菲尔( k e f i r ) 是流行于中东地区的一种传统饮料，其特点是有轻微的起泡性和醇味，故 有“发酵乳制品中的香槟”之美称。开菲尔乳的传统发酵剂开菲尔粒( k e f i r 口a i n ) 主要由乳酸 链球茁、杆菌、酵母菌等微生物组成也有报导发现醋酸菌的存在。开菲尔在前苏联已经有上 千年的食用历史，高加索地区人们的普遍健康长寿引起了科学家的关注，并认为与当地入普遍 饮用开菲尔有关。 k e f i r 一词源自土耳其语k e y i f 意为健康、醉意等，阿拉伯语k e f y 也有同样的意思。另外 土耳其语中还有k e y i f l i 一词表示祥和幸福之意，故现在k e 血仍是取安康、安宁等意思。金世 琳老先生曾对k e f i r 的定义概括总结如f “开菲尔是高加索地区原产的传统的酒精性发酵乳饮 料，以牛乳为主要原料，添加含有乳酸菌和酵母的粒状发酵剂( 开菲尔粒) ，经过发酵而生成的 具有爽快的酸味和起泡性的酒精性保健饮料。”【1 1 由_ 丁_ 开菲尔粒中多种有益微生物菌相在乳中的 代谢作用，使得开菲尔含有比普通酸奶更丰富的微生物及其代谢产物，这些物质主要包括开菲 尔多糖、乳酸、脂肪酸、醋酸、氨基酸、维生素、矿物质、风味化合物等【2 j 【3 1 1 ”。 长期以来，开菲尔一直被喜爱它的人们认为是一种可以增进健康和治疗多种疾病的保健饮 料。国内外关于它的饮用效果的个人经验报告非常多。它所涉及的能够预防和治疗的疾病有十 多种，甚至更多。比如：胃肠道疾病、代谢疾病、高血压、贫血、心脏病、过敏症、糖尿病、 降胆固醇等，还可使食欲正常并减肥；缓解神经失调、紧张和失眠，对慢性疲劳综合症疗效显 著；具有防癌抗癌、抗菌消炎、抗疲劳功能；提高免疫力。开菲尔被认为是高加索地区人们长 寿的重要原因之一，因此它作为一种新型的发酵保健饮料逐渐在美国、日本、奥地利、巴西、 以色列以及东欧各国引起高度重视。随着各国对保健食品的关心，人们也期待着以开菲尔为首 的新型发酵乳的开发口j 【6 i 。 开菲尔各种作用的证明多是以个人经验为主，若要进一步科学的证实开菲尔的疗效，还需 要更多的进行科学严谨的临床医学实验。近些年来，欧美、日本、韩国等国家在这方面已经做 了一些工作，取得了一些初步的成果。美国的s t e v e nr h e f t i e r 等人在加0 3 年报道了开菲尔对 丁_ 乳糖不耐症病人的改善【7 j 。 开菲尔是有着悠久历史的一种民间酒精性发酵乳饮料。虽然到目前为i p ，它的作用机理还 没有完全搞清楚，但几千年的民间流传历史和不胜枚举的饮效实例，确实不能否认它是一种对 人体健康有菔的保健饮料。然而开菲尔除在前苏联有较人规模的t 业化生产外，在其它国家和 地区多以家庭自己生产为主。同时，在其他国家和地区也流传着类似丁开菲尔粒形态的共生菌 体，它们被认为是开菲尔粒的分支品系。近二十年来，我国鲜奶产量火幅增加，酸奶消费呈剧 增趋势，但花色品种较为单，营养价值也人致相同，所以以开菲尔粒及开菲尔制品为基础来 研究开发保健饮料，挖掘和发展传统饮食文化的精髓，使之更好的为人类健康事业服务是本研 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 究课题的任务和目的。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 开菲尔粒的结构和微生物相 开菲尔粒( k e f i rg r a i n s ) 是开菲尔发酵乳的发酵剂，可h j 于家庭或工业化发酵乳制品的生 产。它具有不规则的外型，表面卷曲，不平整或高度丰h 曲，多为粒状。还有薄片状，一般为乳 白色或浅黄色，有一定的弹性和韧性，并有特殊酸味，直径多在5 1 5m m 不等，经多次分裂 增殖，有些颗粒直径可达2 0 r i m 以上。具有活性的开菲尔粒可浮在乳的表面，在乳中生长分裂， 并将其特性传给r 一代以产生新粒。当它在乳中生长、扩大时，观察不到物性上的变化，仅看 到粒由小变大，其数量的增加依赖于原粒分裂 8 1 。 开菲尔粒的主要成分是水、黏性多糖、少量蛋白、脂质、灰分和其他成分。其中黏性多糖 是乳杆菌代谢产生的胞外多糖，由葡萄糖、半乳糖以1 ：1 的比例组成，分子最在1 0 0 万以上， 具有很好的抗肿瘤效果，被命名为k e f i r a n ( 开菲尔多糖) 。 开菲尔粒的组成菌相非常复杂，有关k e f i r 粒微生物组成的报道很多，各报道之间差别很大。 开菲尔粒中哪几种菌是开菲尔粒构成上不可缺少的菌种还未明确，此外还有许多分类学上尚难 以确定的菌种。不过，这些报道也有共同点，即开菲尔粒是以乳酸菌与酵母共生关系为基础的 小生态系，其构成菌相未必很固定，其菌群可能有多样的组合。这些菌经过长期的相互适应和 协同作用形成了复杂的i 嵩相，这些复杂的菌相使开菲尔粒形成了整体“战斗力”，能够抑制杂菌 和致病菌的溢生。特有的粘多糖能够保护开非尔粒不受外界微生物侵染，像霉菌侵染不到开菲 尔粒内层，它释放的酶也不能把开菲尔粒分解破坏。开菲尔粒最大的特点就是具有很强的环境 适应能力和抗污染能力，正因为这些特点，使得开菲尔粒得以流传上千年。 关于微生物在开菲尔粒上的分布普遍存在两种观点，一种观点认为乳糖：椎发酵型酵母在开 菲尔粒的内部深层，嗜温及嗜热乳杆菌、醋酸菌聚集在开菲尔粒的表面，表面部分乳杆菌占优 势，随着向内部的深入，酵母或杆菌比例逐渐加大直至酵母占绝对优势，这一观点主要是基于 扫描电镜观察结果而形成的；另一观点是基于扫描电镜和透射电镜联合使用而得出的结论。开 菲尔粒除具有花椰菜结构外，还具有细小薄片状、纸卷样及绕卷纸样，微生物不是无差别的随 机排列在开菲尔粒上，其排列有特殊的规律和高度的序列性，其基质确由大量的纤维质碳水化 合物组成。微生物栖息其上，薄片状的开菲尔粒一边较为光滑和平整，另一边高度卷曲、粗糙， 显示了不对称性，酵母和短杆菌占据着高度卷曲的一面，另一面几乎全是短杆菌，在此之间的 区域里有大量的弯曲欧杆菌。这两种观点的差异可能是由于选用的材料和方法不同所导致的， 但他们的共同点在于都认为开菲尔粒上的微生物分布是有规律的9 l 。 目前，对开菲尔粒中的微生物进行过分离鉴定工作的国家有很多，如：德国、爱尔兰、葡萄牙、 奥地利、阳班牙、阿根廷、巴基斯坦、南非、土耳其、韩国、日本等【1 0 】一 1 8 】。他们从开菲尔粒 中分离山来的微生物见表1 1 所示。 2 表1 - 1 开菲尔粒中的微生物及特征 t a b l e1 - 1s i t a i n sj 血k e f i lg r a i na n di t s d 嗡伯l c t e t 一邀圭塑塑耋一s 垂型昼一一一一一一 挂堑 异型发酵：lb r e v i s , l 妇觑 l c a s e is “h 口r h a m n o s “sl b r e v i s 和l k e f i r 产胞外多糖物 乳酸杆菌 i 司型发酵：lh e l v e t i c u s , 质 厶a c i d o p h i l u s , k e f w m o f a c i e n s , l d e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u s , 一一互篁掣璺丝啦毋竺璺些二， 一 一 一一。一一一 。 l c l a c t i s 硎6 叩l a c t i s , 数量和活力都较高，发酵过程中 乳酸球菌lcl a c t i s s u b s pl a c t i s v a r d i a c e t y l a c t i s , 产酸很快，酸度过高时生长受抑 我国对开菲尔的关注相对较晚，只在近几年开始* 起。目前已经对民间流传的类开菲尔粒 菌种如“西藏灵菇”、“雪莲菌”等进行了分离鉴定工作。北京农学院食品科学系谭锋等人从开 菲尔粒中分离出2 株酵母菌，弗对其在牛乳中发酵的情况进行了研究 1 9 1 1 2 0 l ；东北农业大学王亚 峰等人从4 个不同来源的开菲尔粒中分离得到4 0 株乳酸菌，并对这4 0 株菌进行了鉴定。结果 为：德氏乳杆菌8 株，德氏乳杆菌保加利亚种6 株，高加索奶乳杆菌2 株，嗜酸乳杆菌1 株， 粪肠球菌7 株，屎肠球菌2 株，嗜热链球菌1 株，乳脂链球菌3 株口1 i 。州北农林科技大学食品 科学与工程学院的刘变芳从两藏灵菇中分离出乳酸杆菌2 株，双歧杆菌1 株，乳酸球菌3 株， 酵母菌3 株口“。内蒙古乳制品研究与培训中心王和平等人从采自内蒙古锡林郭勒河流域牧区的 类开非尔粒中分离出8 株乳酸球菌和6 株酵母菌，并鉴定乳酸球菌中2 株属于明串珠菌属，3 株属于片球凿属，3 株属丁肠球菌属；酵母菌中4 株属于可鲁维酵母属，2 株属下酒香酵母属 2 3 o 黑龙江省科学院应用微生物研究所刘宇峰等同志通过对西藏灵菇的菌体及灵菇发酵乳的宏观形 态和显微形态的观察，对菌体的主要组成苗进行分离、纯化及生理生化鉴定。确定了西藏灵菇 菌为耐热町鲁维酵母、亚罗可鲁维酵母为主体真菌；以乳酸杆菌、短乳杆菌和乳酸链球菌等乳 酸菌为主体细菌构成的块状共生菌系。并认为两藏灵菇以酵母假丝和营养体构成茵块中心，有 乳酸菌分布在菌块外周部分，共同完成复杂的牛乳发酵分解过程m j 。湖南农业大学食品科技学 院夏菠等人从开菲尔乳中分离出三株菌，分别为：肠球菌属坚强肠球菌、肠球菌属假鸟肠球菌 种、乳杆菌属干酪乳杆菌。未分离出酵母菌，崩分离出的菌株复配发酵不能得到开菲尔奶所固 3 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 有的风味口5 1 。由国内的研究现状来看，国内的学者开始对开菲尔这一古老而新型的发酵乳有了 越来越浓的兴趣，并开始进行了科学研究。但目前为i r 所进行的工作还只集中在菌种的分离鉴 定工作上，他们所使用的菌种多来源于目前流传于我国民间的菌种，被称为“西藏灵菇”，也有 叫“雪莲菌”。这些来源的菌种无论从菌种形态还是微生物组成上都和开菲尔粒及其相近，可见 这些菌种是开非尔粒的一个品系。 1 , 2 2 发酵条件的研究 开菲尔的家庭制作方法很简单，首先将开菲尔粒放入干净的玻璃或陶瓷等耐酸器具内( 约 为牛奶的5 1 0 ) ，再放入已消毒的鲜牛奶，盖上盖子，放在阴暗处，大约2 4 小时左右， 将开菲尔粒滤出，分离出来的开菲尔放在冰箱中随时可以饮用。 开菲尔的工业化生产目前主要有两种方式。一是用开菲尔粒做发酵剂；二是用复合发酵剂发酵。 两种生产方式均各有利弊f 拍】跚1 。 用开菲尔粒做发酵剂的工艺流程如图1 - 1 所示。用驯养良好的开菲尔粒做发酵荆生产开菲 尔，可以得到传统典型的开菲尔制品，即发酵制品中保留了开菲尔粒中原始的微生物种类，发 酵液中微生物的代谢产物也更为丰富。缺点是，用开菲尔粒进行生产，开菲尔粒的清洗、接种 计量= _ l 作不易控制，并且引入污染的风险比较大：同时由于开菲尔粒颗粒状的不规则形态以及 在牛乳中的上浮特性使得这种生产方式只能小规模的生产，否则会带来发酵不均匀等问题。 原料乳( 3 脂肪) l 均质( 1 2 5 1 7 5 m p a ，5 5 ) l 杀菌( 9 2 。c ，1 5 m i n ) 4 冷却( 2 2 ) j 接种 4 一开菲尔粒( 3 5 ) 发酵( 2 2 。c ，2 2 h ，p h = 4 7 ) i 冷却、厉熟( 8 1 06 c ，2 0 h ，p i - i = 4 5 ) 4 分离 4 一开菲尔粒 传统开菲尔制品 4 分装 j d 原料乳( 3 脂肪) i 均质( 1 2 5 1 7 5 m p a ，5 5 。c ) j 杀菌( 9 2 。c ，1 5 m i n ) l 冷却( 2 2 。c ) 4 接种 4 一乳酸菌、酵母菌纯菌种发酵剂 分装 l 发酵( 2 2 。c ，1 6 h ，p h = 4 7 ) 4 冷却、后熟( 8 1 0 ，1 2 h ，p h = 4 5 ) l 贮藏( 4 ) 贮藏( 4 ) 图卜1 用开菲尔粒生产开菲尔工艺流程 图卜2 用纯菌种发酵剂生产开菲尔 f i g 1 - 1 m e t h o d o f k e f i r p r o d u c t i o n w i t h k e f i r g r a i n f i g 1 - 2 m e t h o do f k e f i r p r o d u c t i o n w i t h p u r ec u l t u r e s b ys i m u l t a n e o u sl a c t i ca c i da n dy e a s tf e r m e n t a t i o n 原料乳( 3 脂肪) i 均质( 1 2 5 - - 1 7 5 m p a ，5 5 ) 4 杀菌( 9 2 。c ，1 5 r a i n ) i 冷却( 2 8 ) l 接种 一乳酸菌纯菌种发酵剂 乳酸发酵( 2 8 c 4 5 h ，p h = 4 7 ) i 冷却( 2 0 ) 4 接种 i 一酵母菌纯菌种发酵剂 分装 酒精发酵( 2 0 c ，1 6 h ，p h = 4 3 5 ) l 贮藏( 4 c ) 图1 3 两步法纯菌种发酵剂生产开菲尔 f i g 1 - 3s c h e m eo f k e f i r p r o d u c t i o n w i t hp u r e c u l t u r e s b y c o n s c c u t i v e l a c t i ca c i da n dy e a s t f e r m e n t a t i o n 用纯菌种复合发酵剂发酵的丁乞流程如图1 - 2 、图1 3 所示。其中，复合发酵剂是从开菲尔 粒中分离出来的乳酸菌、酵母菌经纯种培养后再复配成混合发酵剂接种发酵( 图1 2 ) 。也有人 将开菲尔的乳酸发酵和酒精发酵分两步进行，即将乳酸菌、酵母菌分两步接入牛乳中( 图1 - 3 ) ， 从而达到对发酵过程的更准确的控制。用复合发酵剂发酵，简化了生产程序及设备，同时也可 以方便进行大规模的工业化生产。但是复合发酵剂的微生物组成与原始的开菲尔粒微生物组成 是有很大区别的，因为到目前为止，人们还无法彻底弄清开非尔粒中的微生物种类以及它们的 比例和相互关系。而用纯菌种复合发酵剂发酵是以牺牲开菲尔粒中的大量有益菌为代价的，这 样发酵得到的制品在风味以及营养价值上都要逊色于用开菲尔粒发酵得到的制品，只能称为类 开菲尔产品。 5 中国农业人学硕士学位论文 第一章绪论 1 2 3 开菲尔成分分析及其功能作用 开菲尔中参与发酵的微生物种类要比普通酸奶多，网此发酵液中的代谢产物更为丰富。 ( 1 ) 乳酸开菲尔中的乳酸1 0 0 是l ( + ) 乳酸( 右旋) ，普通酸奶中只有5 8 是右旋，其余 为dt 一) 乳酸( 左旋) 。乳酸的两种旋光异构体具有不同生理功能，人体中缺乏d ( 一) 乳酸代 谢酶，故食剧d ( - ) 乳酸易患酸性血液病；l ( + ) 乳酸可作为能源降低胃的p h 值，促进蛋 白质的吸收，抑制肠内病原性微生物的生长。 ( 2 ) 乙醇开菲尔中由于酵母的存在，使得发酵制品中有少量的乙醇。微量的乙醇可促进新陈 代谢，使循环系统和神经系统的活动i e 常化，对有害微生物发挥杀菌作用。 ( 3 ) 糖类含有乳杆菌代谢产生的胞外多糖k e f l r a n ( 开菲尔多糖) ，具有很好的抗肿瘤效果， 且是目前为止难一经过小鼠口服实验证明功能性作用的微生物胞外多糖【2 【硎；近几年研究义发 现开菲尔多糖还有许多其他良好的功能性作用。如2 0 0 5 年k a m i l al e i t er o d r i g u e s 等人通过实 验发现开菲尔多糖有良好的抑菌和促进皮肤愈合的作用，特别是对s t r e p t o c o c c u s p y o g e n e s 的抑 菌能力很强【”】；2 0 0 4 年h i r o a k im a e d a 等人研究发现开菲尔多糖可以有效降低s h r s p a i o s 小 鼠的血压和血脂水平。当实验k k a y 小鼠胆固醇摄入过多时，开菲尔多糖有降低血糖水平的能 力。让便秘s d 小鼠服用开菲尔多糖发现小鼠粪便的水分及湿重水平均明显增加口2 i 。可见开 菲尔多糖是开菲尔中十分重要的功能性成分。 ( 4 ) 脂肪酸及其它有机酸由于开菲尔中有更多种类的微生物参与发酵，使褥脂肪被降解，游 离脂肪酸含最比普通酸奶含量高，使得脂肪的消化率也有所提高；同时，开菲尔中的有机酸种 类也比普通酸奶多，如：醋酸、丙酸、月桂酸等，这些使得开菲尔的酸味不同于酸奶。在开菲 尔中发现有四碳双羧酸，可在机体内溶解癌细胞。 ( 5 ) 食氮化合物开菲尔中蛋白质降解主要是由于乳酸营存径时醋酸蔼和酵母的作燃，在发酵 过程中，脯氪酸、亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸有显著增加。开菲尔的蛋白质降解率比普 通酸奶高，因此更容易消化。 ( 6 ) 维生素开菲尔中的醋酸菌在代谢时合成v b 2 和尼克酸，酵母在发酵过程中台成v b 。，v b 2 和v b ，z 。酸奶在发酵过程中由丁乳酸菌代谢需要消耗尼克酸，故其含量有所下降，但开菲尔在 成熟过程中酵母可以合成尼克酸，使其含量有显著增加。泛酸含量与酸奶相同也有所r 降，开 菲尔中生扬索与鲜奶稆比基本保持不变，僵酸奶钓生物素食量 降幅度较大。开菲尔中b 曼碱含 量较普通酸奶高约2 倍；由于明串珠菌的作用使开菲尔中v b l 2 含量增加幅度较大。d r e w t h ( 1 9 8 6 ) 对开菲尔中叶酸变化进行了系统研究，发现新鲜开菲尔中叶酸含量为4 3u g 1 0 0 9 ，贮 存时叶酸含量可增至6 3 9 3u g 1 0 0 9 口i 。 ( 7 ) 风味物质开菲尔中最重要的风味化合物是乙醛、丙酮、丙醛、丁：酮、戊醇、丙醇。开 菲尔中的风味物质比酸奶中更复杂，2 0 0 3 年，d m b e s h k o v a 等人研究了开菲尔复合发酵剂中 风味物质的变化规律，并发现用复合发酵剂发酵得到的风昧物质要多余用开菲尔粒发酵，通过 和单菌株发酵产风味物质对比，确定了复合发酵剂中各个微生物产风味物质的类型。 ( 8 ) 开菲尔中具体的化学成分见下表所示1 3 4 1 6 孛国农业大学硕士学位沦文第一室鳍论 采卜2 开菲尔中的化学成分 t a b l e1 - 2t h ec h e m i c a lc o m p o s i t i o no l k e f i r 成分loog成分 1 0 0 9 能量 脂肪 蛋自质 乳糖 水分 乳酸g 酒精g 胆固醇m g 磷酸盐m g 必须氨基酸e 色氨酸 苯丙氨酸+ 酪氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 苏氯酸 蛋氨酸+ 臆氮酸 赖氨酸 缬氨酸 矿物质g 钙 磷 镁 钾 钠 氯 微量元素g 铁m g 铜t ig 钼u g 锰”g 锌m g 风眯物质 乙醛 j 二酮 乙偶姻 0 1 2 o 1 0 1 2 01 5 0 ，0 5 0 1 0 0 0 5 1 2 5 5 5 0 3 6 维生素m g a0 0 6 b ，2d 5 胡萝f 泰0 0 2定免酸809 b 1 0 0 4c l b 2 0 1 7 d0 0 8 b 30 0 5e o 1 1 1 2 4 功能及作用机理 ( 1 ) 提高免疫功能，强化免疫系统，增强免疫细胞活力，具有谲j r 机体的特异性和非特异性免 疫功能m 1 。 ( 2 ) 调节循环和呼吸系统功能，开菲尔增强一t ； l l f f 【| ：k - n 3 ，呼吸加深及调整血压，净化血液，调 节血脂； ( 3 ) 开菲尔增强有益菌群的优势，刺激肠道，加强胃肠流动，加速唾液，胰酶的分泌，增强胃 肠和胰藏的功能，增强消化系统功能i 3 ”； ( 4 ) 具有荫癌坑癌作用。开菲尔对免疫系统有强化作用对体液免疫，细胞免疫有调节作用， 并能增强巨噬细胞能力和自然杀伤细胞的话力，能清除异常突变细胞，起到防癌和抗癌的功效 3 8 1 一 4 啪。 ( 5 ) 具有抗菌消炎的功能。开菲尔中的乳酸、乙酸、胞外多糖等物质可以抑制肠内病原性微生 7 姚”弘枷l曼瞄n蚰 l呈哺蚴啪啷咙 中国农业大学硕上学位论文 第一章绪论 物的生长，对结核杆菌，大肠杆菌，志贺氏菌等病原菌具有强烈的抑制作用 4 1 1 。 ( 6 ) 具有抗疲劳功能，开菲尔提高a t p 活性促进机体代谢，有效的清除体内代谢废物，恢复 体力，使精力旺盛。 ( 7 ) 具有恢复肝脏功能。开菲尔具有对人体免疫系统的强化和刺激作用，可阻止病毒吸附和穿 入易感的止常细胞，并增强吞噬细胞杀毒能力而回复肝脏的功能h “。 开菲尔是用牛奶发酵的食品，所咀不但具有牛奶所含有的营养元素，而且由于多种有益微 生物菌相作用使产品的营养比原乳有了很大提高，易于消化，具有丰富的营养。总之，开菲尔 是可以全面调理人们机体功能，有病治病，无病防病的全功能的保健佳品。 1 2 5 乳酸菌胞外多糖的研究 乳酸苗胞外多糖( e x o p o l ys a c c h a r i d e s ，e p s ) 是乳酸菌在生长代l 酎过程中分泌到细胞壁外 常渗丁培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的进入 培养基形成粘液，称为粘液多糖，它们都是微生物适应环境的产物。近儿十年来，由于微生物胞 外多糖在产品结构、性能及生产方面所具有的特别优势而得到大力研究和开发，新的微生物胞外 多糖的开发已成为工业微生物研究的热点之一。由于乳酸菌是食品级工业生产菌，与其他菌相比 安全性高，所以近年来对乳酸菌胞外多糖的研究逐渐增多。但产量低，菌株稳定性差，仍是制约 其大规模生产的主导因素。现在各国科学家试图用基因t 程的手段构建高产菌株，但至今仍没成 功。乳酸菌胞外多糖可赋予发酵乳制鼎特殊的质构和风味，起到安全的食品添加荆的作片j ”，它 还有可能成为食品级多糖的一个良好来源而广泛用于各种食品的增稠、稳定、乳化、腔凝及持水 “。胞外多糖还具有生物活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡，可应用于医药领域。 目前，一些常见乳酸菌产胞外多糖的能力：t h e r m o p h i l u s5 0 。3 5 0 m g l ；l b d e l b r u e c k i i s u b s p b u l g a r i c u s6 0 1 5 0 m g l ；l 1 a c t i ss u b s p c r e m o r i s2 5 - 6 0 0 m g l ；肋c a s e i5 0 6 0 m g l t 4 ”。这 样的产最与其它产多糖的细菌相比是十分有限的，比如x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s 产黄原胶，其 产量为1 0 2 5 叽是目前主要的商业多糖i 4 q 。一些乳酸菌的产多糖能力不稳定，这与嗜温乳酸 菌的质粒丢失有关1 4 7 ，而嗜热菌株的合成机制还不清楚。由此可见，乳酸菌胞外多糖距离商业 化还有很长的一段距离。影响乳酸菌产胞外多糖的因素除菌株( 种) 外，还包括培养条件、培 养基组成、金属离子和化学试剂等冈素。培养条件主要有：培养温度、p h 值、发酵时间等；培 养基组成主要是碳源、氮源等因素；金属离子和化学试剂可以影响合成胞外多糖的酶类物质， 从而影响胞外多糖的产量【”j 【4 ”。 目前，关于k e f i r a n 产量的研究并不多，最早是日本学者h a m h i k oy o k o i 等人研究了菌株 l a c t o b a c i l l u ss p k p b 一1 6 7 b 产k e f i r a n 的优化培养基，发现在m r s 改良培养基上，菌株产多糖量 最高达2 0 4 9 ，培养条件为p h 值为5 0 ，温度3 0 ，发酵时间4 天”0 1 。2 0 0 1 年，b c h e i r s i l p 等人以l a c t o b a c i l l u s k e j i r a n o f a c i e n s 为研究菌株，建立了培养条件、培养基、产多糖量等因素的 数学模型”“。2 0 0 3 年，b e n j a m a sc h e i r s i l p 等人通过混合培养的方式增加了l a c t o b a c i l u s k e f i r a n o f a c i e n s 产多糖的量，即将乳杆菌和酵母菌混合培养，酵母可以利削乳酸，降低乳酸 浓度，从而刺激细胞的生长和乳杆菌产多糖的嚣”。国内到目前为止还未检索到研究开菲尔多 糖的文献。开菲尔粒中产多糖的菌为嗜温菌株，其产多糖的性质由质粒控制，质粒容易丢失， 8 中国农业大学硕上学位论文 第一章绪论 从而丧失产多糖的特性，同时产多糖的能力也是有限的。因此，单独研究开菲尔粒中产多糖的 乳酸菌，即不能保证特征的稳定性，也不能保证产量。 1 2 6 菌种的冷冻干燥 随着发酵技术的发展，发酵剂的制备方法也得到了发展与提高，目前根据发酵乳制品方面 的应用情况，可将发酵剂分为三种类型，即天然发酵剂、普通发酵剂和浓缩发酵剂 天然发酵剂一种利用原料乳自然发酵而制成的液体发酵产物。其特点是菌种成分复杂， 除乳酸菌外，还有酵母菌等微生物，发酵产物成分较多。 普通发酵剂首先由l i s t e r 从酸奶中分离出乳酸链球闰，并对其进行研究，将分离提纯的 乳酸菌作为发酵剂来生产发酵乳制品，引起了人们的兴趣。美国、丹麦和德国也曾对此普通发 酵剂进行研究，并发表了这方面的文章。普通乳酸菌发酵剂的特点是菌种纯正、发酵性能稳定， 发酵产物除了乳酸外，还有一定的风味物质、维生素、抗菌物质等。 冷冻浓缩发酵剂在二十世纪初开始研究，目的在丁i 提高发酵剂的活菌数，制备出一次性 接种制各生产发酵剂或发酵乳制品的发酵剂，减少制备普通乳酸菌发酵剂的繁重j ：序和传代复 壮次数，防止菌株变异及噬菌体的污染。该发酵剂的活菌数可达1 0 9 1 0 “个g 但由于冷冻浓 缩发酵剂在贮藏和运输中比较麻烦，影响其推广应用。 目前，我国发酵奶得生产过程中，所用的乳酸菌大多为国外购进的直投式酸奶发酵剂 ( d i r e c t t o v a tc u l t u r e s ，简称d v s ) ，继代式酸奶菌种的应用量很小。继代式菌种需要经过活化、 扩增才能用于乳品生产。这种发酵剂用量大，制作过程繁杂，质量不容易控制，容易污染杂菌 和噬菌体，菌种比例随着传代数的增加而改变，导致产品质量不稳定和口感著。直投式发酵剂 不需要经过活化、扩增，直接应用于生产，并且活菌含量高( 1 0 “1 0 “g ) ，保质期长，接种 量少，使得每批发酵产品质最稳定，也防止了菌种的退化和污染，大大提高了发酵奶制品工业 的劳动生产率和产品质量。 开菲尔粒中微生物种类多，且彼此之间有强烈的共生关系。乳酸菌、酵母菌、醋酸菌按照 一定的规律有序的排列在开菲尔粒上，开菲尔粒主要由多糖、蛋白质等成分组成，有一定的韧 性和弹性，不溶于水，很难确定开菲尔粒中微生物的种类和数量，同时，受目前微生物分离技 术的限制，开菲尔粒中很有可能有一些数目很少但作用关键的微生物不能被分离出来。因此， 把从开菲尔粒中分离出来的微生物制成纯菌种发酵剂在复配组合发酵的方法得到的开菲尔是以 牺牲开菲尔粒中部分有益微生物为代价的，其微生物组成及营养价值方面均不如传统发酵得到 的开菲尔只能称为类开菲尔产晶。活力良好的开菲尔粒具有繁殖能力，形状不规则，且浮在 牛乳上层生长，这就限制了用开菲尔粒做生产发酵剂的大规模工业化生产。因此借鉴直投式菌 种的方法，如果将开菲尔粒整体冷冻干燥，使得开菲尔粒中的微生物按照原始的组成配比存活 下来，再将冻干后的样品制成菌粉，那么用冻干菌粉发酵就可以得到和传统开菲尔制品一致的 产品。 制备传统的冷冻干燥发酵剂时，需先将纯化好的菌种接种到适台的培养基中富集培养，然 后收集菌种，使其悬浮于含有保护剂的溶液( 分散剂) 中，预冻，最后进行冷冻干燥。开菲尔 粒的冷冻干燥有别于普通的微生物冷冻干燥。只要开菲尔粒活力良好，开菲尔粒上微生物的组 9 中国农业人学硕上学位论文 第一章绪论 成数目就已经固定，无法进一步富集培养，同时，开菲尔粒中的微生物分布在颗粒表面和内部， 冷冻保护剂只能保护表面的微生物，内部的微生物无法接触到。开菲尔粒又是一个有形不规0 的颗粒状形态，如何添加保护剂，添加多少也不同丁普通微生物冷冻干燥的做法。 在冷冻干燥发酵剂的制作过程中，冷冻干燥环节对微生物的危害很大：细胞内冰晶的形 成，冰晶有机械刺伤作用和溶质效果；细胞膜成分的丧失及膜的渗漏和穿孔；关键蛋白的 变性；生物细胞膜叠状六棱形的形成；新陈代谢过程中各类关键作用酶的活性改变。“通 过添加冷冻保护剂可以保护菌体不受上述作用的破坏。目前关于保护剂的保护机理的几种假说 主要建立在保护剂与细胞膜宏观结构的作用基础上：增强磷脂膜的稳定性：多羟基的糖类保 护剂以氢键或其它方式与细胞壁上磷脂膜结合，增大头部空间，降低了磷脂的转变温度，也使 磷脂膜之间不致产生折叠粘连而至细胞死亡“”1 ；玻璃体学说：渗透性保护剂的加入可限 制冰晶的形成而形成玻璃体，减少了冰晶的机械破坏作用“；包埋作_ ； j ：某些具包埋特性的 材料，可将菌体包埋掩蔽而减少细胞内冰晶的形成，但可能影响菌体活性的发挥。保护剂的保 护机理是一个涉及范围十分广阔的领域，保护剂与细胞宏观结构的的作用并不能解释不同种类、 不同用量及复配保护剂等一系列因素的不同保护作用。同种保护剂对不同微生物的保护效果也 不同。 目前，国内外报道过的乳酸菌冷冻保护剂主要有以f 几大类： 多元醇：甘油、侧金盏花醇、甘露醇 糖类：蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、海藻糖、糊精 蚩白类及肽类：脱脂乳、血清蛋白、蛋白胨 氨基酸类及其它：谷氨酸钠、胱氨酸、天冬氨酸、b 一磷酸甘油、l 一赖氨酸。 1 3 立题依据 近十多年来，在世界范围内掀起了一股研究和生产功能性食品的热潮，功能性食晶和饮料 极受欢迎。很多专家和学者认为它将成为2 1 世纪的主导食晶。功能性食品( 包括功能性饮料) 在我国也有了e 速的发展，越来越受到人们的重视和喜爱。随着经济的进一步发展和人民生活 水平的日益提高，功能性饮料在今后还会有更广阔的发展空间和更美好的发展前景【5 ”。 开菲尔是有着悠久历史的一种民间传统发酵乳饮料，具有多种保健功能，是发酵乳制品的 个发展方向。但由于开菲尔是多菌种发酵，其中的乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等微生物均有良 好的功能性作用，比如乳酸菌中的产粘菌株，其产生的胞外多糖开菲尔多糖有良好的抗肿瘤、 抑菌、降血压、降血脂等功能性作h j ，其中的酵母菌也有一定的抑菌能力。 开菲尔多糖是开菲尔中研究虽多的功能性成分之一。是目前为止唯一经过小鼠口服实验验 证抗肿瘤作用的微生物胞外多糖，进来又被证明有良好的抑菌、降血压、降血脂等功能，同时， 乳酸菌多糖被认为是天然安全的增稠剂、稳定剂，可以改善产品的质构。因此h a m h i k oy o k o i ( 1 9 9 2 ) ，b c h e i r s i l p ( 2 0 0 1 ) ，b e n j a m a sc h e i r s i l p ( 2 0 0 3 ) 等人先后研究了开菲尔粒中产粘菌 株产胞外多糖的优化条件。由于开菲尔粒中的产粘菌株属r 嗜温型乳杆菌，其产多糖的机制受 细胞内质粒的控制，而质粒很容易丢失，使菌株丧失产多糖的能力，且单株乳酸菌产多糖的能 1 0 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 力仍然是有限的。而产粘菌株和开菲尔粒中的微生物共生在一起时，其产粘性质会很稳定，并 且由于共生菌系的协同作用，胞外多糖产量相对要高。冈此，优化开菲尔粒产胞外多糖的条件 更具有实际意义。 开菲尔流传至今已有上千年的食用历史，其独特的风味和良好的保健功能作用正不断引起 越来越多的专家和学者的关注。然而开菲尔的传播并不顺利，主要是它的上业化生产不易实现。 目前已经应用的工业化生产方式主要有两种。一是用原始的开菲尔粒做发酵剂，州这种方法可 以得到传统、典型风味的开菲尔，且保留了开菲尔粒中的原有菌相，无论在风味还姓在营养价 值上均为最佳。然而这种生产方式有很大的弊端，即只能小规模的生产，否则容易出现发酵不 均匀的现象；另一种方法是将从开菲尔粒中分离出来的乳酸菌、酵母菌制成纯菌种发酵剂，再 重新组合接种发酵。这种方式可以进行大规模的工业化生产，但因为开菲尔粒中的微生物组成 十分复杂，人工难以模拟其原始的微生物组成及配比，因此用这种方法生产出来的开菲尔无论 在风味上还是在营养价值上都逊色于传统发酵的开菲尔，只能称之为类开菲尔产品。所以，传 统的开菲尔制品依然是我们最期望能够大规模商业化生产的。借鉴纯种发酵剂冷冻干燥