（微生物与生化药学专业论文）融合蛋白hpth134abhsa的真核表达及活性初步评价.pdf

摘要 摘要 人甲状旁腺激素( h u m a np a r a t h y r o i dh o r m o n e ，h p t h ) 是由人甲状旁腺主细胞分泌的 一种单链多肽激素，由8 4 个氨基酸组成，是人体内调节骨代谢的重要激素之一，其类 似物已被开发成为治疗骨质疏松症的一系列新型药物。研究表明，h p t h 前3 4 位氨基酸 片段h p t h ( 1 3 4 ) 保留了天然h p t h 几乎所有可测的生物活性；小分子蛋白与人血清白蛋 i 刍( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 融合可以显著延长自身的半衰期。为了提高h p t h 生物 活性，延长其在人体内的半衰期，我们先将h p t h 的前3 4 个氨基酸片段的基因串联， 之后再与h s a 基因融合，合成了二联体融合蛋白h p t h ( 1 3 4 ) a b h s a 的基因，将融合基 因在毕赤酵母中进行表达，并对得到的融合蛋白进行鉴定、纯化和活性初步评价。 设计特异性引物，得到两个带有不同5 末端和3 末端延长序列的h p t h ( 1 3 4 ) 单体基 因片段，重叠p c r 技术将二者拼接成二联体，并插入到克隆载体p t g l 9 t 中，构建重 组质粒p t g l 9 t - h p t h ( 1 3 4 ) 曲，进行测序。结果显示，克隆得到的二联体基因片段与理 论序列完全一致。重叠p c r 技术体外拼接h p t h ( 1 3 4 ) 曲和h s a 基因，得到融合蛋白 h p t h ( 1 3 4 ) a b h s a 的基因，将其在e c o ri 和n o ti 酶切位点插入到表达载体p p i c 9 k 中， 构建重组表达质粒p p i c 9 k h p t h ( 1 3 4 ) a b h s a 。双酶切鉴定结果表明融合基因已经成功 地插入到表达载体p p i c 9 k 中；测序结果表明重叠p c r 拼接得到的融合基因序列与预期 一致。 重组表达质粒p p i c 9 k h p t h ( 1 3 4 ) a b h s a 经s a li 线性化后电击转化毕赤酵母 g s l l 5 ，利用g 4 1 8 抗性和诱导表达分析筛选出高产重组菌，利用w e s t e r nb l o t t i n g 鉴定 表达产物，之后进行表达条件的初步优化。结果表明，经g 4 1 8 筛选得到能耐受2m g m l g 4 1 8 的重组菌五株，进一步的诱导表达筛选得到表达量较高的重组菌两株；w e s t e m b l o t t i n g 显示，表达的融合蛋白h p t h ( 1 3 4 ) a b h s a 具有很好的h s a 和h p t h 抗原性；表 达条件优化后发酵液中融合蛋白的表达量达1 2 2 8m g l 。 制备融合蛋白h p t h ( 1 3 4 ) a b h s a 电泳纯样品，通过检测它对u a m s 3 2 p b 细胞株中 蝌k l 、o p g 和i g f 1 基因m r n a 表达的影响初步评价生物活性。结果表明，经超滤 浓缩、亲和层析等步骤分离后，得到了电泳纯的融合蛋白；融合蛋白h p t h ( 1 3 4 ) 。b h s a 成骨活性良好，且优于融合蛋广1h p t h ( 1 8 4 ) h s a 。 关键词：人甲状旁腺激素( 1 3 4 ) ；二联体；融合蛋白；构建及表达；生物活性 a b s t r a c t a b s t r a c t h u m a np a r a t h y r o i dh o r m o n e ( h p t h ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n th o r m o n e st h a tc o u l d r e g u l a t eb o n em e t a b o l i s m i ti ss e c r e t e db yt h ep r i n c i p a lc e l l so fp a r a t h y r o i dg l a n da n dh a sa s i n g l es t r a n dw h oc o n t a i n s8 4a m i n oa c i dr e s i d u e s i t sa n a l o g sh a v eb e e ne x p l o i t e di n t oan e w s e r i e so fd r u g st ot r e a to s t e o p o r o s i s s t u d ys h o w st h a tt h eb i o a c t i v i t yo ft h en a t i v eh p t h c o u l db er e t a i n e d c o m p l e t e l yb y t h ef i r s t3 4a m i n oa c i d sa n dt h eh a l f - l i f eo f s m a l l m o l e c u l e p r o t e i n sc a nb ee x t e n d e di fi tb e e nf u s e dt oh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a l i n o r d e rt or a i s et h eb i o a c t i v i t yo fh p t ha n dp r o l o n gi t sh a l f - l i f ei nv i v o w ec o n s t r u c t e dt h e c o n c a t e n a t eo fh p t h ( 1 3 4 ) a n dt h e nf u s e di tt oh s a t h ef u s e dg e n ew a se x p r e s s e di n p i c h i a p a s t o r i s a f t e rg a i n i n gt h ef u s e dp r o t e i nh p t h ( 1 3 4 ) a b h s a ，w ec o n f i r m e d ，p u r i f i e di t a n de v a l u a t e di t sb i o a c t i v i t yp r e l i m i n a r i l y t w ok i n d so fh p t h ( 1 3 4 ) g e n e st h a tw i t hd i f f e r e n t5 a n d3 t a i l sw e r ea m p l i f i e db yt w o p a i r so fp r i m e r st h a tw i t hh i g hs p e c i f i c i t ya n dt h e ns p l i c e db yo v e r l a p p i n gp c r ，n l e c o n c a t e n a t eg e n ew a sc l o n e di n t op l a s m i dp t g19 ta n dt h e ns e q u e n c e dt h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp t g 19 一t - h p t h ( 1 - 3 4 ) a b t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tt h en u c l e o t i d e ss e q u e n c eo f c l o n e dc o n c a t e n a t eg e n ew a sc o m p l e t e l yc o n s i s t e n tw i t ht h eo n ew ee x p e c t e d s p l i c e dt h e c o n c a t e n a t eh p t h ( 1 - 3 4 ) a ba n dh s a g e n e si nv i t r ob yo v e r l a p p i n gp c r t h ef u s e dg e n ew e g a i n e dw a si n s e r t e di n t oe x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 ka te c o ri a n d d fir e s t r i c t e d e n d o n u c l e a s es i t e s ，a n dt h e ni d e n t i f i e da n ds e q u e n c e dt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i d p p i c 9 k h p t h ( 1 3 4 ) a b h s a i d e n t i f i c a t i o nb yd o u b l ee n z y m ed i g e s t i o ns h o w e dt h a tt h e r e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dh a db e e nc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y t h er e s u l to fs e q u e n c i n g d e m o n s t r a t e dt h a tt h en u c l e o t i d e ss e q u e n c eo fc l o n e df u s e dg e n ew a si nc o r r e s p o n d e n c ew i t h o u r a n t i c i p a t i o n t h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dp p i c 9 k h p t h ( 1 3 4 ) a b - h s al i n e a r i z e da ts a li r e s t r i c t e de n d o n u c l e a s es i t ew a st r a n s f o r m e di n t op i c h i a p a s t o r i sg s1 l5b ve l e c t r o p o r a t i o n w es c r e e n e do u tr e c o m b i n a n ts t r a i n sw i t hr e l a t i v e l yh i g he x p r e s s i o nl e v e lb yg 418r e s i s t a n c e a n de x p r e s s i o nl e v e lb ys t e pt os t e p t h e ni d e n t i f i e dt h e i rp r o d u c t i o nb yw e s t e r nb l o t t i n ga n d o p t i m i z e dt h e i re x p r e s s i n gc o n d i t i o n s a tl a s t 5s t r a i n sw e r es c r e e n e do u tf r o mt h em dp l a t e w h i c hc o n t a i n e s2m g m lg 4l8 t w os t r a i n sa m o n gt h e mc o u l de x p r e s sf u s e dp r o t e i n h p t h ( 1 3 4 ) a b h s a i n r e l a t i v e l yh i 曲l e v e l w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i sw i t hp o l y c l o n a l a n t i b o d yo fh s aa n dp t hi n d i c a t e dt h a tt h ea n t i g e n i c i t yo ft h ef u s e dp r o t e i nw a ss p e c i f i c t h em a x i m a ly i e l do ff u s e dp r o t e i nc o u l dr e a c h12 2 8m e t e p u r i f i e dt h ef u s e dp r o t e i na n da n a l y z e di t sb i o a c t i v i t yp r e l i m i n a r i l yb ym e a s u r i n gt h e r a n k l ，0 p ga n di g f lm r n a e x p r e s s i o ni nu a m s 3 2 p be e l ll i n e t h ec o n c l u s i o ni st h a t w ec a ng a i nt h ef u s e dp r o t e i nw i t he l e c t r o p h o r e s i sp u r i t yb yu l t r a f i l t r a t i o na n da f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y p r e l i m i n a r ya n a l y s i so fb i o a c t i v i t yi n d i c a t e dt h a th p t h ( 1 3 4 ) a b h s ah a s b e t t e ro s t e o g e n i ca c t i v i t yt h a nh p t h ( 1 8 4 ) h s a k e y w o r d s ：h u m a np a r a t h y r o i dh o r m o n e ( 1 3 4 ) ；c o n c a t e n a t e ； f u s e d p r o t e i n ； c o n s t r u c t i o na n de x p r e s s i o n ；b i o a c t i v i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是芬人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：旅榴日 期：聊罗8 、咿 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：狼稳 些笋旦仁 导师签名： 日 期： 盆哆 专烨 第一章绪论 第一章绪论 1 1 人甲状旁腺激素 1 1 1 概述 人甲状旁腺激素0 a u m a np a r a t h y r o i dh o r m o n e ，h p t h ) 是由人甲状旁腺主细胞合成和 分泌的一种单链多肽激素，成熟h p t h 含8 4 个氨基酸残基，分子量约为9 s k d ，是人体 内调节钙磷代谢及骨转换的最为重要的激素之一【1 】。它主要通过作用于靶细胞膜上腺苷 酸环化酶系统，增加胞浆内c a m p 及焦磷酸盐( p p i ) 的水平来发挥作用【2 】。h p t h 的生理 作用广泛，肾脏、骨骼、小肠等都是它的靶器官【3 】。小剂量、间歇性应用h p t h 对骨质 疏松症有一定的治疗效果【4 】。随着对h p t h 分子结构和构效关系研究的深入，其在体内 发挥作用的机制及成骨作用的特异位点逐渐明确，h p t h 类似物在骨质疏松症治疗中的 重要性得以体现。 1 1 2 构效关系 h p t h 是一种含氮类激素，它在生物体内作为一种配体要先与靶细胞膜上的受体结 合，诱发细胞内产生第二信使，才能使细胞发生生理功能变化【6 】。所以h p t h 的分子结构 对于受体配体结合及发挥生理活性起着关键性作用。 从h p t h 的一级结构来看，它是由8 4 个氨基酸残基组成的一条多肽链分子，分子中 不含半胱氨酸，不含二硫键【7 】。二级结构为富含a 螺旋的单链多肽，在s e r 3 至l j g l y l 2 及s e r l 7 到l y s 2 6 两处有a 螺旋，这两个结构紧密的区域由一段无规卷曲或螺旋结构连接，当它 处于发挥生理作用所需的环境中时，前3 4 位有2 5 个氨基酸残基可形成螺旋结构，羧基端 的亲水氨基酸和疏水氨基酸有规则地排列形成两性0 【螺旋，疏水面与中间连接部分相互 作用形成一个疏水核【8 j 。由二级结构人们设想，h p t h ( 1 3 4 ) 的氨基端、羧基端均具有螺 旋结构，它们之间应存在相互作用，形成一个具有疏水区的“u ”型三级结构【9 】，如图1 1 所示。 构效关系研究表明，h p t h 的生物活性主要来自其氨基末端，氨基末端片段如 h p t h ( 1 3 4 ) 、h p t h ( 1 3 7 ) 及h p t h ( 1 3 8 ) 保留了h p t h 几乎全部的生物活性，而其羧基末 端则可能是前甲状旁腺素原的加工和不同于氨基末端的另一些生物活性所必需的。以 h p t h ( 1 3 4 ) 为例，受体结合和生物活性所需结构正是上述的两个0 【螺旋结构以及连接两 个螺旋的铰链区，同时通过截去其羧基端、氨基端的氨基酸，并检测其与受体结合的活 性及生理活性发现，羧基端主要功能是与受体结合，是结合位点，其中第2 5 3 4 氨基酸 残基为主要结合位点，第1 0 。2 7 氨基酸残基为次要结合位点；氨基端主要是活化腺苷酸 环化酶，与生物活性有关。因而去除氨基端的氨基会失去激活腺苷酸环化酶的功能，但 与受体结合的功能基本保持不变，氨基端的螺旋主要是将氨基末端的s e r 引入到受体的 正确位置，从而激活信号传输系统【1 0 j 。 江南大学硕士学位论文 ( b )( c ) 图1 - ih p t h 的分子结构 f i 9 1 - i m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f h p t h a ：h p t h 一级结构，b ：h p t h ( i 一3 4 ) 三维结构：c ：u 型三级结构与受体的结合 1 1 3 生理作用 h p t h 的生理作用极其广泛，目骼，肾脏 l l d , 肠等都是它的靶器官。 它作用于目骼具有促进成目和溶骨的烈重作用。一方面h p t h 叫刺激成骨细胞分泌 胰岛素杆生长因于j ，从而促进目胶原和基质的合成，有利于成骨；另方面h p t h 能 使骨组织中破骨细胞的数量和活性增加，分化成熟的诎目细胞分泌各利咏解酶，并日产 ，l 人量乳酸和柠檬酸等酸| 生物质，使骨基质成骨盐溶解，释放钙和磷到细胞外液，但 h p t h 只引起血钙升高j 。 它作用于肾脏主要足增加肾远【f i 小管对一价钙离子的重吸收，降低肾磷排泄闽并抑 制肾小管对磷的重吸收，最终使血钙升高，j f l 磷降低，激活i ，2 5 一羟基维生素d 3 的合 成，间接提高肠对钙的吸收i ”i 。 h p t h 对肾脏的作用和其刘骨旧作用相互配合。血钙浓度降低就会刺激h p l h 分秘 增加，通过骨吸收的增加使血钙、血磷同时提高，此时血磷需要被j ； | = m 体外，否则它将 抑制血钙浓度的提高。反之，血钙浓度过高，又会使h p t l l 分泌减少，肾脏发挥保磷作 用，从向有助于血钙浓度的降低。总之，h p t h 对骨转换具有职向调节作用：大剂量、 持续给药有促进骨吸收的作用，小剂量、问歇给药则促进骨形成作用m i 。 第一章绪论 1 2 骨质疏松症 1 2 1 病理特征及危害 骨质疏松是以骨量减少和骨组织显微结构退行性变化为特征，以骨脆性增加、易发 生骨折为主要临床表现的一种全身性代谢性骨病【】”。它由骨代谢异常所致，表现为骨量 丢失、骨质结构改变、力学性能下降、骨折的危险性增加等。骨质疏挫症骨组织的主要 病理表现为松质骨骨小粱变细、断裂和数量减少，皮质骨多孔，骨质结构紊乱，最终导 致骨量减少，骨质量下降，骨的机械功能和生物力学性能降低等后果，如图1 - 2 所示。 图1 2 骨质疏松症的病理表现 f i g1 - 2p a t h o l o g i c a lf e a t u r e so f o s t e o p o r o s i s a 健康的骨小粱：b ：骨质减少c ：骨小粱断裂，d 严重的骨质疏松 小论是在中国还是存全球范围内，骨质疏松症都越来越严重地威胁着人类的健康。 据统计，全球骨质疏松癌有5 0 发生在业洲幽家，7 0 发生在发展中家，我幽既是业 洲国家，又是发展中困家，人口基数最太，老龄化速度最快，这些同情均决定了骨质疏 松症己成为我国一个严重的公众健康问题。日前哉国约有舀厦疏松症患者6 0 0 0 8 0 0 0 万， 并日有一亿多人需要采取必要的预防措施，即1 6 0 0 0 万人有骨质疏松症隐患。医学界己 将高血脂、高血雎、骨质疏松症这三种疾病放在同样重要位置。其p 胃质疏松症在世界 常见病、多发病中已跃居第七位，患者人数超过两亿人i l t l 。 江南大学硕士学位论文 1 2 2 治疗药物 根据骨质疏松症的发病原因，骨质疏松症治疗药物大体上可以分为两类，即骨吸收 抑制剂和骨形成促进剂m j 。 骨吸收抑制剂常用的有雌激素、降钙素、二磷酸盐、活性维生素d 、雌激素受体拮 抗剂等，这些药物都可以通过抑制骨吸收增加骨量，但是当骨量增加到一定程度时，就 不能再有效地维护骨骼的细微结构，起不到降低骨折危险的作用。而且此类药物不能修 复和重建已断裂的骨小梁，即只能对骨质疏松症起到预防和缓解的作用，不能从根本上 治疗。 骨形成促进剂最常用的有氟化物、甲状旁腺激素多肽片段、胰岛素样生长因子、雄 性激素及蛋白同化激素等，此类药物往往通过刺激成骨细胞的生殖和分化、提高骨小梁 的密度、抑制骨小梁厚度的减少来起作用，它们虽能显著提高骨量，但也不能有效地降 低骨折。 而对于h p t h 来说，它对骨代谢具有骨吸收和骨形成的双重作用，这种特性使得它 在用药方式不同时呈现不同的效果。h p t h 在成熟骨组织中能够促进骨生长或填充破骨 细胞产生的陷窝，它注射入人体后可以使骨髓基质中的骨髓成骨细胞前体成熟，并集聚 在骨表面发挥成骨作用，同时，抵御骨细胞的初始凋亡，使每一次骨重建周期的净骨量 增加。虽然h p t h 有一定的骨分解作用，但通过改变用药方法，仍可以充分的利用它的 骨合成作用。当以小剂量间歇性方式用药时，它可减少骨折发生率、增加骨盐量，其效 果是在使用骨吸收抑制剂时所看不到的。这说明它在提高骨代谢周期的同时，起到了促 进骨形成、增加骨量、提高骨强度的作用，是治疗骨质疏松症的有效药物l l8 1 。 1 3h p t h 在骨质疏松症治疗中的应用 近年来h p t h 对骨质疏松症的治疗作用已经引起了许多学者的关注，大量的动物实 验和临床研究提示单独或联合应用h p t h 是提高骨量、改善骨质量、治疗骨质疏松的新 途径。它的类似物已经逐步发展成为一系列治疗骨质疏松症的有效药物，包括h p t h 重 组体、h p t h 融合蛋白和h p t h 突变体等。 1 3 1h p t h 重组体 为了满足科研及临床对h p t h 的需要，最初人们曾尝试用化学合成法生产，但是可 行性不大，随之人们又把注意力转向生物合成。伴随着生物技术的发展，h p t h 重组体 的研究取得了一系列的成果。 第一种用于临床治疗骨质疏松症的h p t h 的类似物是r h p t h ( 1 。3 4 ) ，它于2 0 0 2 年11 月获美国f d a 批准，商品名特立帕肽f 5 】，为注射剂，由美国礼来公司生产，主治绝经后 妇女骨质疏松症和原发性骨质疏松症，已于2 0 0 3 年初在美国上市。这种药物具有与天 然h p t h 氨基末端3 4 个氨皋酸序列完全相同的结构，其生物学作用亦是通过与特异性、 高亲和性受体h p t h 1 结合介导的。与天然的h p t h 相比，它对骨和肾具有相同的生理 作用，但克服了羧基末端对骨代谢的不利影响。同年，u n i g e n e 公司和葛兰素史克公司 4 第一章绪论 签署了一个1 5 0 0 0 万美元的全世界授权协议，开发一种口服剂型的甲状旁腺激素，用于 治疗骨质疏松。 另一种h p t h 类似物为r h p t h ( 1 8 4 ) 1 9 】。2 0 0 3 年1 1 月，n p sp h a r m a c e u t i c a l s 公司结 束r h p t h ( 1 8 4 ) 的i i i 期临床研究，于2 0 0 4 年底向美国f d a 提出新药申请，2 0 0 5 年在欧 洲提出新药申请；2 0 0 6 年3 月美国f d a 向开发者n p sp h a r m a c e u t i c a l 发出该药物可以 被批准的意见书；2 0 0 6 年4 月2 4 日，欧盟批准该药物上市，用于治疗妇女绝经后骨质 疏松症。这种重组体与天然甲状旁腺素的氨基酸组成和生物活性均一致，具有显著的骨 形成作用，不仅能够增加骨量，且可以增加骨的机械应力，有效防止骨折发生。它与人 体内发挥生理作用的h p t h 氨基酸序列完全一致，因此副作用小于r h p t h ( 1 3 4 ) ，拓展 应用范围的空间较大，在临床前研究中发现r h p t h ( 1 3 4 ) 有致大鼠骨肉瘤样毒性，而 r h p t h ( 1 8 4 ) 的此种副作用则显著减轻。 1 3 2h p t h 融合蛋白 作为一种蛋白类药物，分子量若小于2 0 k d 在代谢过程中就易被肾小球滤过，导致体 内半衰期较短，皮下给药或肌肉注射的半衰期一般只有约1 2 h ，为了达到治疗效果，一 般需要频繁或大剂量用药，给患者带来极大的不便。因此长效蛋白药物的开发己成为对 第一代基因工程产品进行二次开发的一个重要方向，而增加其分子量则是一个通用的策 略【2 0 j 。人们已经采用多种方法来对h p t h 的性质进行改进，以在保留它的活性的同时提 高体内半衰期。这其中包括制备缓释制剂、构建突变体、化学修饰以及基因融合等，而 基因融合技术效果较为突出。 依据使用目的不同，常用的融合蛋白载体有h s a 、抗体i g g 重链f c 段、6 x h i st a g 、 p 半乳糖苷酶、缸p e 、谷胱甘肽s 转移酶( g s t ) 以及硫氧还蛋i 兰t ( t r x ) 等。而h s a 贝j j 由于本 身特殊的优点，更适合于充当长效融合蛋白类药物的融合载体1 2 。h s a 是包含5 8 5 个氨 基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质分子，分子量6 5 k d ，是人血浆中含量最高的单一 蛋白质( 达4 0 e l l ) ，也是人体内血浆的主要组成部分，在人体内有维持血液渗透压，运输 营养和其它重要生物物质的作用。h s a 本身就是许多内源因子和外源药物的载体，药物 和它结合以后，可以减缓自身的生物利用速度，延长在体内的半衰期达1 9 c t 2 _ 久。 h s a 融合技术具有明显的优点：它在胞内经蛋白翻译系统通过肽键与目标蛋白连 接，无需额外的体外处理；它表达水平较高，与其融合后可以提高目的蛋白的表达水平； 它是一个稳定的“惰性”蛋白，与其融合后可以提高目的蛋白的稳定性；h s a 融合蛋白 具有比p e g 修饰的蚩l ：c 了药物更长的半衰期。 有研究者利用基因工程手段将p t h ( 1 8 4 ) 与h s a 直接融合，中间无任何连接肽，具 体构建方法是通过重叠p c r 技术将人甲状旁腺激素的碳末端与人血清白蛋白分子的氮 末端相连，之后将融合基因与表达载体p p i c 9 k 连接，线性化后电转化到宿主菌毕赤酵母 k m 7 1 中，诱导表达后对表达产物进行药物代谢动力学研究【2 2 1 。结果表明，用h s a 直接 修饰人甲状旁腺激素，可以改变人甲状旁腺激素的药代动力学特性，大幅度提高它的相 对分子质量，显著延长体内半衰期，同时还可抑制相应的免疫清除，使药物的血浆浓度 更加稳定，约物在体内作用的时问更长，从而达到提高药物疗效和减少注射次数的目的。 江南大学硕士学位论文 酶标法测定发酵上清中融合蛋白的甲状旁腺激素活性为3 1 8i u m l ，表明融合蛋白在毕赤 酵母中得到了表达并具有一定的生物活性。 又有研究者为了在毕赤酵母中高效分泌表达人血清白蛋白与h p t h ( 1 3 4 ) 融合蛋白 并鉴定其活性，构建t h s a h p t h ( 1 3 4 ) 融合基因，并对其进行了克隆、表达及鉴定【2 3 1 。 它首先用p c r 方法克隆人血清白蛋白基因，将其碳末端与h p t h ( 1 3 4 ) 基因的氮端连接， 构建重组表达质粒p p i c 9 k h s a h p t h ( 1 3 4 ) ；然后线性化重组质粒，转化到毕赤酵母宿 主菌g s l l 5 中，对阳性转化子进行p c r 鉴定和m u t 表型鉴定并用甲醇诱导表达；最后采 用经典的腺苷酸环化酶刺激活性检测法确定h s a h p t h ( 1 3 4 ) 的生物学活性。结果表明： 重组毕赤酵母分泌h s a h p t h ( 1 3 4 ) 的表达量可达4 0 0m g l ，分子量约为7 0 国，与理论值 相似；免疫印迹显示目标蛋白与抗h s a 多抗、抗h p t h ( 1 3 4 ) 多抗有良好的特异性杂交反 应；体外活性实验证明h s a h p t h ( 1 3 4 ) 能够激活兔肾皮质细胞中的腺苷酸环化酶，但活 性低于h p t h ( 1 3 4 ) 标准品。此项研究成功的表达出了具有生物学活性的融合蛋白 h s a h p t h ( 1 3 4 ) ，为进一步研究和应用打下基础。 1 3 3h p t h 突变体 明确构效关系可以使我们更清楚的认识h p t h 对骨作用的两面性，扬长避短，充分 利用它的成骨作用，避免溶骨作用，使它更适合治疗骨质疏松症。美国研究者 r e i d h a a r - o l s o n 等人曾构建了5 0 个h p t h ( 1 3 4 ) 的点突变体，对它们的生物学活性进行研 究，找出可进行功能性替换的氨基酸【l 们。选择合适的氨基酸进行点突变，可以改善甲状 旁腺激素的生物活性或其他生物学特性。到目前为止，进入临床研究的p t h 突变体有 l e u 2 7 】c y c l o ( g l u 2 2 - l y s 2 6 ) h p t h - ( 1 3 1 ) n h 2 o s t a b o l i n c 。m 幽，它是把2 7 位的赖氨酸变为 亮氨酸，l i 期临床试验的初期试验结果表明，其刺激骨合成代谢的作用与特立帕肽相当 或者优于特立帕肽，而其升高血钙、刺激骨吸收的不良反应明显弱于特立帕肽。 1 g 立题背景及课题内容 融合蛋白类长效药物是生物技术药物中很重要的一类，迄今为止大量有关此类药物 的研究都在进行当中，人们正不断努力，克服融合蛋白长效药物活性低、表达量低、分 离纯化复杂的困难，以加快此类药物投入使用，造福人类的步伐。本研究即是在此背景 下，通过对h p t h ( 1 3 4 ) 三维结构的模拟和分析，确定以提高生物活性、延长它在人体内 的半衰期、简化纯化步骤为目标，利用基因工程手段先将h p t h 的前3 4 个氨基酸片段 h p t h ( 1 3 4 ) 的基因串联，得到二联体，之后再与h s a 基因融合，中间不加任何连接序列， 将融合基因在毕赤酵母表达系统中进行表达，并对得到的二联体融合蛋白进行鉴定、纯 化和活性的初步评价。具体研究内容可以分为以下几个部分： ( 1 ) 二联体基因的克隆、融合基因的合成及表达载体的构建； ( 2 ) 毕赤酵母工程菌的构建及表达条件的初步优化； ( 3 ) 融合蛋白纯品的制备及活性的初步评价。 6 第二章二联体融合蛋白基因的合成及表达载体的构建 第二章二联体融合蛋白基因的合成及表达载体的构建 h p t h ( 1 3 4 ) 分子量非常小，在体内代谢的速度相当快，构建串联体可以获取足够的 小分子蛋白【2 5 】，同时串联体的构建也会使各单体在空间结构上相互影响，引起空间结构 的变化，从而改变与受体的结合力。对h p t h ( 1 3 4 ) 构效关系的研究和对其三维空间结构 的模拟表明，构建二联体是增强活性和提高稳定性的潜在方法之一。而与h s a 的融合， 可使小分子药物不易被肾小球滤过，延长血浆半衰期到1 9 舻6 1 ，也是一种提高药物稳定 性、延长药效的有效手段；且h s a 的存在使得融合蛋白的分离纯化步骤更简洁高效。 巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 基因表达系统被认为是目前最有效的表达系统。本 研究选用毕赤酵母g s l l 5 为宿主菌，具体原因将在后续章节中详细介绍。巴斯德毕赤酵 母菌体内无天然质粒，要选择合适的可以与宿主染色体发生同源重组的表达载体将外源 基因表达框架整合于染色体中，来实现外源基因的表达【2 7 1 。这种表达载体要包括启动子、 外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等；要是穿梭质粒，可以先在大肠杆菌复制扩 增，然后被导入宿主酵母；为使产物分泌胞外，表达载体还要带有信号肽序列。毕赤酵 母分泌型表达质粒p p i c 9 k 就能很好得满足以上要求【2 8 , 2 9 , 3 0 。它的主要特点有：( 1 ) 具有 强效可调控启动子a o x l ；( 2 ) 具有a m p 和k a n 抗性，使筛选过程经济而又简便；( 3 ) 在 表达载体a o x l5 端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下 游有a o x l3 端终止序列；( 4 ) 具有分泌效率强的信号肽伐f a c t o r 。 本章中，我们先克隆得到二联体h p t h ( 1 3 4 ) 。b 的基因，再将其与h s a 基因融合， 得到二联体融合蛋白h p t h ( 1 3 4 ) a b h s a 的基因，将融合基因插入到毕赤酵母分泌型表 达载体p p i c 9 k 中，构建重组表达质粒p p i c 9 k h p t h ( 1 3 4 ) a b - h s a 。 2 1 材料 2 1 1 菌株与质粒 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) j m l 0 9 ，由江南大学医药学院分子生物学研究室保藏( 以 下简称本研究室) ；重组大肠杆菌j m l 0 9 p p i c 9 k p t h ( 1 8 4 ) h s a ，由江南大学沈微老师 提供；克隆载体p t g l 9 t ，购自捷瑞生物；毕赤酵母分泌型表达质粒p p i c 9 k ，由本研 究室保藏，其物理图谱见图2 1 。 7 江南大学硕士学位论文 图2 - i 表达载体p p i c 9 k 物理图谱 f i g2 1t h ep h y s i c a l m a p o f e m s s l o n v e c t o rp p | c 9 k 2 1 2 工具酶和试卉4 限制性内切酶e r i 、n o t i ，t 4 d n a 连接酶，t a qd n a 聚合酶，高保真d n a 聚合酶毋m 6 州，i p t g x - g 甜和部分d n am a r k e r 鹏j t a k a r a 公；饱和酚和a m p 购自上海生_ t 生物工程技术服务有限公司( 以f 简称上海生工公司) ：d n a 片段快速胶回 收试剂盒、酵母抽提物、蛋白胨、溴化乙锭、琼脂糖和部分d n am a r k e r 购自b i ob a s i c i n c ( 以t 简称b b i 公司) ：其余试剂均为国产分析纯试剂。 2 1 3 培养基 l b 液体培养基：1 o 蛋白胨，05 酵母提取物，1o 氯化钠，p h75 ：1 2 l 灭菌2 0 m i n 备用；必要时使用前添加抗生索( 如a m p ) 至终浓度1 0 0 i x g m l 。固体培养 基添加20 琼脂；1 2 i , 灭菌2 0m i n 名- 用；必要时冷却至约55 添加抗生素生终浓 度1 0 0p g m l 。 2 1 4 溶液配制 2 1 4 1 常用贮存液的配制 i p t g ；鳓( 2 0 0m g m l ) ：称取2gi p t g 溶于蒸馏水并定彝至1 0m l ，用微孔滤 膜过滤除菌，分装成im e j , 份，一2 0 贮存； x g a l 溶液( 2 0 m g m l ) ：称取o2g x g a l 溶于二甲基甲酞胺并定容至1 0 m l ，分 装成lm i ，4 、份，2 0 c e ：存。装有x - g a l n 液n 容器需用铝箔封裹以防光照诎坏： a m p 溶液( 1 0 0 m g m l ) ：称取1g a m p 溶于蒸馏水并定容至1o m l ，川微孔滤膜 过滤除菌，分装成1t o l d , 份，一2 0 贮存； c a c l 2 溶液( 01n m l l ) ：将i l g 无水c 4 c 1 2 溶于蒸馏水并定容至1 0 0m r ，1 2 1 灭菌2 0m i n ， 2 0 贮存： t e 缓冲液：1 0m r a o l lt r i s - h c i ( p h80 ) ，1m m o l le d f a ( p h80 ) ，一2 0 c 贮 存。 2 1 4 2 质粒d n a 提取试剂 溶液i ：5 0 m m o l l 葡萄糖，2 5 mx n o l l t f i s h c i 【p h80 ) ，1 0 m m o l ! l e d t a ( p l i80 ) 第二章二联体融合蛋白基因的合成及表达载体的构建 1 1 5 灭菌1 5m i n ，4 1 2 贮存； 溶液i i ：o 2m o l ln a o h ，1 s d s ，室温贮存； 溶液i i i - 2 9 5m l 冰乙酸，用固体k o h 调p h 到4 8 ，定容到1 0 0m l ，4 c 贮存； 饱和酚氯仿异戊醇溶液：2 5 ：2 4 ：1 ( v ：v ：v ) 。 2 1 5 主要仪器 d y y - 2 型稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂 d k 8 d 电热恒温水槽上海精宏实验设备有限公司 高速台式离心机t g l 16 b上海安亭科学仪器厂 低速度离心机t g l 5上海安亭科学仪器厂 h e m a 2 4 0 3 6 0 型基因扩增仪珠海黑马医学仪器有限公司 隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械一厂 恒温摇床江苏太仓试验设备厂产品 凝胶成像系统天呈科技与尼康数码相机组合 自动蒸汽消毒锅无锡市启蒙生物技术研究所 电子天平 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 超净台 苏州净化设备厂 微型漩涡混合仪上海沪西分析仪器厂 电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司 2 2 方法 2 2 1h p t h ( 1 3 4 ) 。b 基因的合成 2 2 1 1 质粒p p i c 9 k p t h ( 1 8 4 ) 。h s a 的提取 ( 1 ) 从一8 0 冰箱中取出甘油管冻存的j m l 0 9 p p i c 9 k p t h ( 1 8 4 ) h s a 重组大肠 杆菌，于3 7 培养箱中解冻； ( 2 ) 用接种环沾取菌液，划线于含有1 0 01 t g m la m p 的l b 平板上，置于3 7 ( 2 培 养箱中培养1 6h ； ( 3 ) 挑取平板上长出的单菌落，接种于2m l 含1 0 0 “g m la m p 的l b 培养液中， 于3 7 、2 2 0r m i n 振摇培养16h ； ( 4 ) 取1 5m l 培养液移入e p 管中，1 2 0 0 0r m i n 离心3 0s ，弃尽上清； ( 5 ) 加入1 0 0 此溶液i 重悬菌体，剧烈振荡，冰浴5m i n ； ( 6 ) 加入2 0 01 a l 溶液i i ，缓慢颠倒e p 管4 6 次，冰浴5m i n ； ( 7 ) 加入1 5 0 此预冷的溶液i i i ，缓慢颠倒e p 管4 - 6 次，冰浴5m i n ； ( 8 ) 1 2 0 0 0r m i n 离心5m i n ，将上清转移到新的e p 管中； ( 9 ) 加入4 5 0l x l 饱和酚氯仿异戊醇溶液，震荡混匀，1 2 0 0 0r m i n 离心5m i n ，将 上层水相转移到另一新的e p 管中； ( 1 0 ) 加入9 0 0i x l 的冷的无水乙醇，混匀，室温放置2m