毕业论文--彩叶草次生代谢产物的研究.docx

目录中文摘要IAbstractII第1章 前言1第1节彩叶草的次级代谢产物研究概况1第2节 分离和纯化应用技术12.1 硅胶柱层析法22.2 凝胶柱层析法22.3 薄层色谱（TLC）法3第3节 物质结构鉴定的主要应用技术33.1 质谱33.2 核磁共振波普43.3 紫外-可见吸收光谱43.4 红外光谱4第4节 研究背景、目的和意义44.1研究背景44.2研究目的和意义5第二章 对用正丁醇萃取彩叶草粗提取物后的第三部分进行分离纯化6第1节 基本实验步骤6第2节实验用到的部分仪器、试剂72.1部分实验仪器72.2用到的部分实验试剂7第3节 采集彩叶草且所做相关处理73.1 采集材料彩叶草73.2 材料彩叶草的预处理8第4节 彩叶草正丁醇萃取溶液的第三部分的分离纯化94.1 A部分的分离纯化104.2 B部分的分离纯化104.3 C部分的分离纯化13第3章 实验结果与讨论15第1节 实验结果15第2节 实验讨论15致谢17参考文献18附图20中文摘要近些年来,天然产物化学研究飞速的发展,影响着其它的学科。目前，非常多的植物慢慢的走向灭绝，和人类不合理的应用自然资源、破坏生态系统，这就意味我们对天然产物的化学研究的情势很是急迫。本着就近的原则，本次实验所取的材料彩叶草是在长白山区域采集的，经过干燥和粉碎后，用甲醇浸泡提取其次级代谢产物。之后，需要用到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种试剂分别来萃取甲醇提取液，用正丁醇试剂萃取所得溶液的第三部分就是本次实验研究的主要部分。通过采用硅胶柱层析法、凝胶柱层析法、薄层色谱法的方法，对正丁醇萃取液的第三部分进行分离，得到相对较纯的化合物。使用质谱、核磁共振波普、紫外-可见吸收光普、红外光谱的方法对纯的化合物进行结构鉴定。经过鉴定、查询资料，确定SY-4是名为1-hydroxy-6-methyl-8-hydroxymethylxanthone 的化合物。关键词：彩叶草；次级代谢产物；提取；分离；鉴定IIAbstractIn recent years, the rapid development of natural product chemistry has affected other disciplines. At present, very many plants slowly to extinction, and human unreasonable application of natural resources, destruction of the ecosystem, which means that our natural product of the chemical research situation is very urgent. In accordance with the principle of the nearest, the material taken in this experiment Coleus blumei is collected in the Changbai Mountain area, after drying and crushing, with methanol soaking to extract its secondary metabolites. After the need to use petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol three reagents were extracted methanol extract, with n-butanol reagent extraction of the third part of the solution is the main part of this experimental study. By using silica gel column chromatography, gel column chromatography, thin layer chromatography (TLC) method, the third part of n-butyl alcohol extract separation, get relatively pure compounds. The structures of the pure compounds were identified by mass spectrometry, nuclear magnetic resonance spectroscopy, UV - visible absorption spectroscopy and infrared spectroscopy. After identification, the data were identified and SY-4 was identified as a compound named 8-hydroxy-1-hydroxymethylxathone.Key words: Coleus Blumei Benth; Secondary Metabolites; Extraction; Isolatiao; Identification第1章 前言第1节 彩叶草的次级代谢产物研究概况彩叶草(Coleus blumei Benth)别名有很多，如锦紫苏、洋紫苏、五色草、老来变，它是一种能活两年以上的草本植物，在植物种类中属于唇形科，在热带的地域可以生长成亚灌木状。迷迭香酸（Rosemarinic acid）是彩叶草中的主要次生代谢产物之一，也是一种多酚羟基酸，能做抗氧化剂的原料，而且还有许多的生物活性，如消炎，免疫调节，和抵抗菌、病毒、抑郁等 1。在1958年,迷迭香酸第一次被从迷迭香植物中分离提取，因此而命名。迷迭香酸，它的分布比较广泛,从低等的苔藓到高等的双子叶植物都能存在，当然最主要的还是分布在唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科这些类属植物。迷迭香酸因为有很多的生物活性,所以能在食品、化妆品、医药等方面有着广阔的应用，从而闻名国内外。已经有不少实验研究是从植物中提取迷迭香酸，本次实验就是取当地分布比较广泛的彩叶草并提取其次级代谢的产物，对用正丁醇试剂萃取所得溶液的第三部分进行研究，并确定其成分。图1.1（彩叶草）第2节 分离和纯化应用技术彩叶草的次级代谢产物的成分很多，需要对其进行分离和纯化。实验室在条件允许的情况下，可以运用很多种不同方法进行分离。但是对于产物中不同化学成分的分离，需要采用不同的方法来进行，通过不同方法交叉运用、合理搭配，使得产物分离出各种不同极性、不同大小的成分。为此我们必须了解针对不同类成分的相应的分离方法。2.1 硅胶柱层析法硅胶层析法就是利用硅胶对不同物质具有不同的吸附力，从而使得物质得到分离。硅胶能吸附极性较大的物质，极性较弱的物质不易被吸附，具有相似易吸附的特点。首先往硅胶柱中加入需要分离的溶质和相对应的洗脱剂，通过不同的溶质与洗脱液的吸附性差别，从而使得其中不同的溶质得到分离。硅胶柱层析法主要分为干法上柱和湿法上柱两种，本次实验常用的方法是干法上柱。干法上柱洗脱与湿法上柱洗脱比较具有分离效果更加显著的特点。干法上柱的缺点是因吸附作用较强，而会造成样品的损失比较大。因此在分离样品的量较少时，不合适采取干法上柱的方法。2.2 凝胶柱层析法凝胶载体分子是筛状的能允许物质分子相对较小的物质通过，分子凝胶过滤法就是利用这一特性，把不能通过载体分子的物质大分子和能通过载体分子的物质小分子分离开来，也可以叫做分子筛层析。凝胶柱层析中把葡聚糖凝胶载体作为它的载体，是因为葡聚糖凝胶载体不但水中无法溶解，还可以膨胀成颗粒状，同时在其颗粒的内部形成三维网状结构。当使用到葡聚糖凝胶载体作为载体时，必须要先用溶剂对它进行浸泡充分，让它膨胀，然后将它均匀地装入层析柱中并静置一段时间，当载体完全的沉淀时候才可以使用。当样品加到凝胶柱上后，因为样品中各种物质的分子颗粒大小有差异，颗粒小的样品其体积相对较小，就能进入到膨胀的载体内部，就要连续不断地穿入载体的内部，所以小分子从柱的上方到柱底的运动路程相对较长，还要克服载体内部的阻力，因此，花费的时间相对较久。载体只有很少的孔径可接受大的颗粒。因此，大的颗粒不通过载体内，只通过载体的缝隙，所以它们的行进路线就比较短，因而要被先洗脱下来。像这样颗粒较大的物质先于颗粒较小的物质流出，从而使得大小不同的物质得到分开，最终就能完成分离的效果。羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）就是本次实验凝胶过滤法所用到的凝胶载体。因为葡聚糖凝胶分子中的葡萄糖部分能够与羟丙基结合形成醚键形式，所以让它具有分子筛的特性。这载体还不止这一特性，还能在混合溶剂（极性、非极性溶剂组成）中有反相分配色谱的作用，更加的有利于有机物的分离。它在天然产物的分离中应用是越来越普遍了。2.3 薄层色谱（TLC）法薄层色谱（TLC）法是通过消耗微量样品就能快速、简单的判断出样品的纯度，对样品中物质的极性做出比较。因为各种化合物的极性，所以硅胶对它们的吸附能力各不相同，使用展开剂使它们更快的移动，对此就能进行分析和判断。本次实验需要多次的使用这个方法。本次实验的薄层色谱系将250目硅胶（GF-254）均匀的平铺在铝板，在铝板的一端点上少量的需要分离的样品，再用展开剂从这一段开始展开，因为溶质与硅胶的吸附程度不同，所以不同的溶质在铝板上展开的距离都不相同，最终达到分离的目的。TLC之所以主要应用在物质分离效果的检测，检测物质的纯度，以及制备少量的纯品等，是因为这种方法的样品消耗量最少。TLC显色的方法经常用到的有三种，以它的检测顺序的不同分类可以分为：可见光下颜色的鉴别，紫外光下的检测（365nm，254nm），和施加显色剂显色的方法。第3节 物质结构鉴定的主要应用技术我们一般对物质的结构鉴定顺序为：1. 判断物质的类型；2. 测定分子量和分子式；3. 确定物质化学结构式的不饱和度；4. 确定物质化学结构式的官能团；5. 确定物质化学结构式的基本骨架；6. 推断物质化学结构式的平面结构；7. 推断物质化学结构式的立体结构。3.1 质谱质谱法就是把运动的离子通过电场和磁场，使得它们的荷质比（电荷-质量比）不同而得到分离后进行检测。其基本原理就是是在离子源中把试样的各个组分发生电离，使得生成具有不同荷质比的离子，然后在加速电场的作用下形成离子束，之后就是进入质量分析器。在质量分析器中，有电场和磁场的作用，就会使它们发生相反的速度色散，然后把它们分别聚焦就能得到质谱图，就能确定离子的化合物组成，因为不会有两个核素的质量一样或者整数倍的。实验室中经常用到鉴定结构的质谱方法有：电子轰击质谱（EI - MS）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）、快原子轰击质谱（FAB-MS）、场解析电离质谱（FD-MS）等。3.2 核磁共振波普核磁共振波谱主要作用是测定分子中含有的氢原子及碳原子的类型、数目、和它们连接的方式、分子的构型、分子的构象等信息。3.3 紫外-可见吸收光谱紫外-可见吸收光谱属于分子光谱，是因为价电子的跃迁才产生的。利用物质分子在吸收紫外-可见光谱区的辐射来进行分析测定的方法，主要用来对化合物的骨架进行分析。紫外-可见吸收光谱的应用比较广泛，不仅仅用来对物质进行定量分析，还能依据吸收峰的特性测定它们的一些平衡常数、配合物配位比等；也可依用在无机化合物和有机化合物的分析，常量、微量或多组分都能够测定。3.4 红外光谱化合物内的化学键、官能团它们的振动频率与红外光的振动频率基本一样。所以当一束具有连续波长的红外光通过化合物，假如化合物分子中有一个基团的振动频率和红外光的频率相同的时候，这部分的红光就会被化合物吸收。不同的化学键、官能团，它们的振动频率是不相同的，所以吸收的不同频率的红光，它们将出现在红外光谱的位置也会不同。这方法经常应用在鉴别氨基、羟基、芳环、双键等特征官能团和芳环取代类型。测定图谱从而确定其包含的特征官能团。第4节 研究背景、目的和意义4.1研究背景近十年来,人类对天然产物化学的研究迅速的发展，这让人们意识到有一门新的学科正在诞生,它能直接或者间接的影响着生药学、生物学、生物化学、化学分类学等学科。新结构类型的化合物来源主要是生物体(动物、植物)，根据统计在全球大约有45万种植物,然而人类对它们的化学研究仅仅是很少的一部分，而且进行过活性测试的更加的少3。就目前来说，许多热带雨林的植物正逐渐走向灭绝而且人类对自然资源不合理的应用以及对生态系统的破坏越来越严重，更意味着天然产物的化学多样性和生物多样性研究情势非常的急迫。4.2研究目的和意义彩叶草之所以能在我国各大城市夏季的园林绿化中不断扩大应用，成为市场上的俏销商品，是因为它耐高温，对日照有比较强的忍耐力,叶色丰富多彩且最鲜艳的时候正好在夏季9。彩叶草能通过植物组织培养技术来快速繁殖,该技术成本不高,方法简单、容易上手,繁殖系数相对较高,繁殖量非常的大,而且品质均一性好,能较好地保持母本植株的优良性状,是一种较为成熟、理想的方法。迷迭香酸具有抗菌活性、抗炎活性、抗过敏活性、护肝作用、抗血小板和血栓作用多方面生物活性。迷迭香酸具有超强的抗氧化性,早就已经被开发成一种食品的抗氧化剂，并且市场上迷迭香酸的产品供不应求15。迷迭香酸是彩叶草次级代谢产物的主要产物之一，目前对彩叶草次级代谢产物的研究还比较少，希望通过本实验能有所发现。本实验主要针对中国吉林省长白山区域的彩叶草的次级代谢产物成分进行研究，希望能在易繁殖、易培养、分布广泛的彩叶草找到迷迭香酸类化合物或者发现其他化合物，满足市场，保护人类健康，也希望通过本次实验能够丰富我们对酚酸类化合物的认识，填补不足。22第二章 对用正丁醇萃取彩叶草粗提取物后的第三部分进行分离纯化第1节 基本实验步骤 第一步，采集彩叶草，紧接着对其进行干燥处理过后全部粉碎，经过粉碎后才能快速、充分的提取出彩叶草内含有的化合物。之后使用工业甲醇浸泡粉碎后的彩叶草至少两次，大致就能提取出彩叶草中总体化合物，合并两次甲醇滤液。第二，分离甲醇滤液中的化合物，用旋转蒸发仪蒸干甲醇滤液中的甲醇试剂，在分别用石油醚试剂、乙酸乙酯试剂、正丁醇试剂，按照极性由小到大的顺序来萃取蒸干甲醇后的液，最后就能得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液、水溶液一共四个部分。第三，蒸干正丁醇萃取所得溶液后，用凝胶柱层析、硅胶柱层析、反相柱层析的方法对其进行分离，在使用每一种方法进行分离后还会结合薄层层析法进行分析、判断。最后，鉴定化合物的结构要用到质谱、核磁共振波谱、紫外-可见吸收光谱、红外光谱等技术方法。实验的方法和路线： 采集和干燥：本次实验采用的彩叶草样品材料是在中国吉林省长白山地区采集获得，采集后进行干燥处理。粉碎和甲醇浸泡：用粉碎机粉碎干燥后的彩叶草，之后再加入甲醇充分的浸泡，尽可能的溶解出样品中的所有成分，这样对后续的分离操作有益。萃取：用极性不同的溶液，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，萃取甲醇提取液，最后就能得到包括水相在内的一共四个部分的溶液。分离和纯化：用凝胶柱层析方法、硅胶柱层析方法、反相柱层析手段对其进行分离，在使用每一种方法进行分离后还会结合薄层层析手段进行分析，判断是否还需要分离或者纯化。鉴定：对实验得到的物质单体结合使用质谱、核磁共振波普、紫外-可见吸收光普、红外光谱等技术方法，检测其分子的构型、结构等信息。第2节 实验用到的部分仪器、试剂2.1 部分实验仪器1. 不锈钢中药打粉机：直立型，手提式直立型-200克；2. DZF-6050型号的真空干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂制；3. 旋转蒸发器：上海申生科技有限公司制造；4. HH-4型数显恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司制造；5. 2X62815型移液枪（100-1000 ul）：上海荣泰生化工程有限公司制造；6. DB-3A型号的不锈钢电热板：常州金坛良友仪器有限公司制造；7. 实验室通风厨：北京世纪海泰实验室设备有限公司制造；8. ZF-6型号的三用紫外线分析仪：上海嘉鹏科技有限公司制；9. CA-1115A型号的冷却水循环装置，上海爱朗仪器有限公司制；10. 凝胶柱；11. Art.11868型反相色谱柱；12. 柱层析硅胶，山东君鸿生物科技有限公司，80-120目；200-300目；13. SH2-95A型号的循环水式多用真空泵：河南巩义市英峪予华仪器厂制；14. Q-A280型号的数控超声清洗器，昆山市的超声仪器有限公司旋转蒸发器：上海申生科技有限公司制；15. DHG-9140型电热鼓风干燥箱。2.2用到的部分实验试剂试剂：石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、纯甲醇、工业甲醇、二氯甲烷（广州市银环化工有限公司生产）。第3节 采集彩叶草且所做相关处理3.1 采集材料彩叶草本次实验所用的材料彩叶草是2016年8月7日在中国吉林省长白山地区采集收集所得的。3.2 材料彩叶草的预处理第一，将材料彩叶草用剪刀剪切成小段，把它们平铺在合适的不锈钢板上，之后将钢板放到真空干燥箱（DZF-6050型）或者电热鼓风干燥箱（DHG-9140型）内实行干燥手段，干燥两天左右，尽可能蒸发彩叶草小段中水分，就可以取出来，即完成干燥这个步骤。第二，用不锈钢中药打粉机将所有干燥后的彩叶草小段进行粉碎后，把所得的粉碎体装入合适的容器，然后加入用于工业的甲醇的量是容器体积的五分之四，再把容器放到HH-4型数显恒温水浴锅，浸泡一周后，就可利用抽滤瓶和SH2-95A型循环水式多用真空泵抽滤。完成抽滤环节后，再次往容器中加入跟上次差不多量的工业甲醇，把容器放置在HH-4型数显恒温水浴锅经过两天后，用同样的方法的步骤再一次的进行抽滤。将这两次得到的滤液合并，之后在一起做处理，使用旋转蒸发仪对甲醇滤液进行浓缩，蒸干甲醇，这样就算得到了彩叶草次生代谢产物的粗提取液。分别使用正丁醇试剂、乙酸乙酯试剂、石油醚试剂（极性由小到大的顺序）萃取粗提取液，最后就得到了四个部分的混合溶液分别是水溶液、正丁醇溶液、乙酸乙酯溶液、石油醚溶液。用旋转蒸发仪把正丁醇溶液蒸干，然后用适量二氯甲烷完全溶解后上样。在上样之前要先经过脱脂棉过滤，之后才能将滤液缓慢的沿壁滴加到硅胶柱，使里面的化合物能得到分离，洗脱剂是甲醇与二氯甲烷按一定比例混合的溶液，甲醇与二氯甲烷的体积比分别是1:100,1:50,1:20,1:5和1:1，滴速控制在7秒一滴左右。总共接收了60瓶流出的样品，把接到的样品点在薄层层析色谱上，进行分析，经过分析最后合成了6个部分，分别是： 2-10号、11-14号、15-23号、24-29号、30-46、47-58号。因为1号、59号、60号这3个样品经薄层层析色谱分析后，它们的现象不明显，所以就舍去了这些部分。第三部分（15-23号）样品就是本次实验所研究的彩叶草次级代谢产物部分的样品。图2.1（图为分离出的但是还没有合并的部分样品溶液）第4节 彩叶草正丁醇萃取溶液的第三部分的分离纯化首先进行装柱，硅胶柱所用的固定相是200-300目的硅胶，均匀的装入大小合适的玻璃柱中，硅胶装入柱中的高度需要是样品拌硅胶后装入柱中的高度的5倍左右，把硅胶装入柱后，用手轻轻的拍打玻璃柱，让硅胶上层表面水平光滑，这样有利于样品的分离，随后用真空泵抽去在硅胶柱缝隙中的空气，6分钟左右即可，将硅胶柱压实。使用旋转蒸发仪将彩叶草正丁醇萃取溶液的第三部分样品蒸干后，用一定量二氯甲烷完全溶解它，在加入到装有一定量的80-120目硅胶（不够再加）的蒸发皿中混合搅拌均匀，一边搅拌一边利用设置温度在50度左右的可调式电热板加热，这样就能使样品更快、均匀的覆在硅胶颗粒表面顺便也使样品原有的试剂更快的蒸发掉，容易让硅胶颗粒干燥有利于化合物的分离。用干法上样的方法，加入到装有200-300目硅胶的柱中，要它作为样品硅胶层。在加入样品覆盖在表面的硅胶时，缓慢、均匀加入，同时用手轻轻拍打硅胶柱有助于样品硅胶层表面层的水平，这样有益于样品中化合物分离完全。最后，需要在样品硅胶层上面再加上一层80-120目的硅胶，这层硅胶的表面层也要水平。硅胶柱完全装柱后需要梯度洗脱，洗脱试剂是用二氯甲烷与甲醇不同的体积比组成的混合液。在最开始的时候，洗脱试剂是二氯甲烷与甲醇的体积比是100:1，慢慢的适当的减少二氯甲烷体积的比例，当二氯甲烷与甲醇体积变为30:1时，用荧光灯观察硅胶柱有颜色的样品层快流出来，开始对样品的收集。还是按一定比例继续改变二氯甲烷和甲醇的体积比例，减少二氯甲烷的含量，到最后用的洗脱试剂是二氯甲烷与甲醇体积比为1:1。最后，一共就收集到56瓶的样品，对接到的样品在硅胶板上点样，展开后在荧光灯下分析，因一部分化合物较少或者极性过大故舍去不作处理，其他的化合物多、极性相近原因能合并成三个样品分别记为A部分、B部分、C部分。 4.1 A部分的分离纯化把A部分上样到硅胶柱手段中进行分离纯化，洗脱试剂还是二氯甲烷与甲醇按一定体积比混合的溶液，接到样品后，在硅胶板上点样，展开后在荧光灯下观察分析，舍弃极性大和杂质多的样品，合并极性相近的，最后得到记为A1部分、A2部分的相对较纯的化合物，A1部分中的杂质含量不多，标号SY-1。A2部分的极性和B部分相近，所以决定把它和B部分合并在一起之后再做处理。4.2 B部分的分离纯化B部分B1部分B2部分B3部分B4部分B1-1B1-2B1-31B1-1-1B1-2-1B1-1-2B1-2-2B2-1B3-1B2-2B3-2B2-1-1B2-1-2SY-2SY-3SY-4SY-5图2.1.1（B部分大致的分离步骤）正确使用旋转蒸发仪，把B部分蒸干，加入适量的二氯甲烷使B部分完全溶解，再加到含有一定量的80-120目硅胶的蒸发皿中混合搅拌均匀，一边搅拌一边利用设置温度在50度左右的可调式电热板加热，等硅胶颗粒干燥完全后把样品硅胶装入到准备好的硅胶柱中，洗脱试剂是二氯甲烷与甲醇体积比组成的混合溶液，进行硅胶柱层析分离纯化。接到的样品经点硅胶板，且展开后在特定波长的紫外灯下观察、分析，舍去化合物比较多的和极性大的，合并化合物不多、极性相近的，最后得到四个样品分别记为B1部分、B2部分、B3部分和B4部分。4.2.1 B1部分的分离纯化观察到装有B1部分的小锥形瓶有固体析出，要给B1部分上硅胶柱的时候，先经过赛有脱脂棉的小漏斗，使得液体部分和固体部分分离开来，液体部分继续上硅胶柱，固体部分记为B1-3。液体部分上硅胶柱分离后，对接到的样品进行薄层色谱分析，最后得到两部分溶液记为B1-1、B1-2。分别给B1-1、B1-2上凝胶柱做进一步的分离，对各自得到的样品进行点板，做薄层色谱分析，B1-1得到两部分溶液记为B1-1-1、B1-1-2，B1-2得到两部分溶液记为B1-2-1、B1-2-2。B1-1-1的成分比较多而且每个成分的含量不是很多，经多方面的思考决定舍去；B1-1-2和B1-2-1的薄层色谱的结果是一样的，杂质都比较少，所以合并一起后再一次通过硅胶柱做进一步的提纯，对得到的样品记为SY-2； 而B1-2-2它和B1-3是相同化合物，把这两个合并后记为SY-3。所以，B1部分最后收集到两种不一样的物质：SY-2，SY-3。 4.2.2 B2部分的分离纯化处理B2部分步骤跟处理B1部分的步骤比较相近。规范的使用旋转蒸发仪把B2部分蒸干，用适量的二氯甲烷完全溶解后，再加入到装有适量的80-120目硅胶的蒸发皿中混合搅拌均匀，一边搅拌一边利用设置温度在50度左右的可调式电热板实施加热，待二氯甲烷完全蒸发出来，硅胶颗粒足够干燥后，干法上样，装到装好适量的200-300目硅胶的硅胶柱中作为硅胶样品层，最后在完成最终的组装，洗脱试剂还是二氯甲烷和甲醇一定体积比组成的混合溶液，完成分离。滴出来的样品用干净的小锥形瓶收集后，进行点板，展开后在特定波长得紫外灯下进行观察、分析，舍去量少且极性不一样的样品，剩下的经合样就得到两个样品记为B2-1、B2-2。而B2-1有两种极性不相同的物质，所以给B2-1上反相柱做进一步的分离。先用纯甲醇洗脱干的反相柱，带纯甲醇液面高出固体上层表面将近1厘米的时候，加入纯甲醇与水体积比为6:4的混合溶液，再用超声波把柱内的空气泡震出来，持续震半个小时左右。用旋转蒸发仪把B2-1蒸干，再加入适量的二氯甲烷完全溶解，待混合液面即将与柱内固体上层表面重合时缓慢、沿壁加到柱内，等样品快全部进入固体层时再向柱内加纯甲醇与蒸馏水体积比为1:9的混合溶液，下次加溶液纯甲醇与蒸馏水体积比为2:8的混合溶液，溶液按照这比例加，最后加的是纯甲醇。在溶液高出固体上层表面1厘米以上时候加入溶液才不会影响分离效果，每一次所加入液体的高度与柱内固体的高度差不多一致。至最后用纯甲醇。样品从进入柱内到出来这个过程，在每加一次溶液需要用到手提的紫外线灯去照射柱子，观察颜色层分离情况，一直到没有颜色层滴出为止。对滴出的样品进行点板，展开后在紫外线灯下观察分析，合并后最终得到两个样品记为B2-1-1、B2-1-2，其中 B2-1-1成分比较多相对复杂，而且每个部分的成分的量不多，经各方面考虑，只能舍去。但是B2-1-2与 B2-2的薄层色谱结果是一样的，每一个的杂质都不多，把它们合并起来后再一次的通过硅胶柱，做进一步的纯化，纯化后得的样品记为SY-4。所以， B2部分只得到了一种样品化合物：SY-4。图2.2（得到的SY-4）4.2.3 B3部分与B4部分的分离纯化 首先，对B3部分进行硅胶柱层析，方法是与B1部分、B2部分进行的硅胶柱层析差不多一样，都是蒸干后拌样，再装柱，洗脱试剂也一样。最后，对接到的样品进行点板，展开后在紫外线灯下观察分析，合并得到的两个样品记为B3-1、B3-2。然而B3-1所含的化合物单一，感觉量比较大，杂质相对较少，再一次经过硅胶柱做进一步的纯化，对得到的化合物样品记为SY-5。B3-2部分中成分多且极性相差不大、量较少，因时间、经济等方面原因舍去不做处理。所以，B3部分最后得到的一个样品化合物：SY-5。 B4部分在硅胶板上点样，展开后在紫外线灯下观察分析。它所含的化合物种类比较多，且极性相差不大，每一个成分的量偏少，经各方面考虑决定舍去不作进一步的处理。4.3 C部分的分离纯化C部分C1部分C2部分C1-1C1-2C1-2-1C1-2-2C2-1C2-2C2-3C2-4SY-6SY-7SY-8SY-9图2.3（C部分的大致分离步骤）把C部分经旋转蒸发仪蒸干其含有的所有试剂后，加入适量的二氯甲烷使之完全溶解，再加到含有一定量的80-120目硅胶的蒸发皿中混合搅拌均匀，一边搅拌一边利用设置温度在50度左右的可调式电热板加热，等硅胶颗粒干燥完全后把样品硅胶装入到准备好的硅胶柱中，洗脱试剂是二氯甲烷与甲醇体积比组成的混合溶液，进行硅胶柱层析分离纯化。接到的样品经点硅胶板，且展开后在荧光灯下观察、分析，舍去化合物比较多的和极性大的，合并化合物不多、极性相近的，最后得到记为C1部分和C2部分两个部分化合物。4.3.1 C1部分的分离纯化把C1部分上到硅胶柱中进行分离，得到样品后点板，紫外灯下观察分析，最后合成两个样记为C1-1、C1-2。再对这两部分点板，在紫外灯下观察，C1-1在紫外的照射下颜色不明显，成分比较少量也不多，为此，不继续做后续的处理。C1-2在紫外的照射下有两处颜色明亮且不相同，所以对C1-2上到硅胶柱中做进一步的分离，经过点板后，紫外灯观察后合样，得到两个化合物记为C1-2-1、 C1-2-2。这两个部分都有一些杂质，分别通过硅胶柱再作进一步的纯化，最终对得到的两个样品化合物记为SY-6、SY-7。4.3.2 C2部分的分离纯化观察到装有C2部分的小锥形瓶有固体析出，要给C2部分上硅胶柱的时候，先经过赛有脱脂棉的小漏斗，使得液体部分和固体部分分离开来,固体部分记为C2-1, 液体部分经旋转蒸发仪蒸干后，用适量的二氯甲烷完全溶解后，再加入到装有适量的80-120目硅胶的蒸发皿中混合搅拌均匀，一边搅拌一边利用设置温度在50度左右的可调式电热板实施加热，待二氯甲烷完全蒸发出来，硅胶颗粒足够干燥后，干法上样，装到装好适量的200-300目硅胶的硅胶柱中作为硅胶样品层，最后在完成最终的组装，洗脱试剂还是二氯甲烷和甲醇一定体积比组成的混合溶液，完成分离。用干净的小锥形瓶收集从硅胶柱滴出的样品，收集完全后进行点板，展开后在紫外线灯下观察，合样成为三个样品分别记为C2-2、C2-3和C2-4。用甲醇完全溶解C2-1、C2-2、C2-3和C2-4后，再一次点板，展开后在紫外灯照射下观察样板分析，C2-1成分单一且杂质较少记为SY-8；C2-2和C2-3极性相近、颜色一样是同一种物质，但有杂质较多所以把这两个合样后再一次通过硅胶柱进行纯化，所得到的样品记为SY-9；然而C2-4的杂质、颜色区域有很多但是他们的区域分得不是很明显有重叠比较复杂，所以就舍去这一部分不再做进一步的分离。最终C2部分得到了两个样品物质分别是SY-8和SY-9。第3章 实验结果与讨论第1节 实验结果 本次样品虽然得到了9个，但是由于时间的原因只有3个拿去做鉴定。由于纯度的不够3个中只能鉴定出来一个。其结构如图3.1，把得到的数据和文献26做对比查证确定其化学式是C15H12O4名为1-hydroxy-6-methyl-8-hydroxymethylxanthone的化合物。图3.1 SY-4样品结构第2节 实验讨论此次的实验主要是由彩叶草的采集、干燥，提取其次级代谢产物且萃取，常规柱层析分离纯化以及最后的质谱和核磁共振波谱结构鉴定构成。在实验的过程中，出现了很多的问题。主要有： 1、在实验过程中，因为操作的不正确，造成多次浪费样品的现象，影响分离纯化，使得最后样品量过少，做不了结构鉴定。2、在色谱柱层析的过程当中，柱子和洗脱剂选用不恰当，使得实验的效率不高。3、对天然产物化学的认识不够，对分离化合物的过程比较盲目，效率比较低。值得高兴的是，最终还是有成果的，有几种单体化合物被分离出来了，可惜的是只有一种通过了结构鉴定，得到了结构相关的信息。当然，其他几种没有鉴定出来的，可能是因为样品量太少，或者是因为化合物纯度不够造成的，也很遗憾。但是这类实验毕竟是我第一次了解并自己动手做的实验，很多操作不当也是难免，做的好的地方值得发扬，不好的地方自然也要吸取相应的教训。结果虽然不尽如人意，但是在实验的过程中，我学到了很多：1、学习到了许多研究天然产物化学的实验技术，包括：各种色谱柱的使用，以及其他各种实验仪器的使用等。2、这次实验经历让我接触到了实验室，了解到了作科研的艰辛与快乐。3、从实验室师兄、师姐和老师的身上，学到了作为科研工作者所具备艰苦奋斗的、坚持不懈、苦中作乐的工作精神。 在时间有限和实验经验不足两方面的限制下，本次实验做的不算成功，实验成果有很大的局限性。希望后来者能通过这次实验的成果和经验，使得下一次实验取的更大的成功。致谢时光飞逝，大学四年的美好生活即将结束，在此，我首先感谢我的父母和吉林大学是你们给我上大学的机会，让我学到了知识，丰富了我的精神；也谢谢永远青春年少的同学们，是你们让我的生活变得不平淡，变得丰富多彩，美化了我的精神世界。更加感谢的是赵磊老师，还有给予我极大帮助的秦建春老师，两位老师对实验的见解非常的独到，思维很活跃能想到别人想不到的地方。跟两位老师做实验开阔了我的知识面的同时，也极大的扩展了我的视野和思路，同时在他们严谨的治学态度影响之下，我的信心得到了非常大的激励和鼓舞，实验技能得到了显著的提高。跟两位老师学习的这段时间能够让我终身收益，获益匪浅。我的毕业论文设计从一开始课题的选择，实验的设计，原料的采集，仪器的使用，实验从进行到论文的撰写都是在两位老师的耐心帮助下完成的，在此我谨再次向两位老师以十二分诚挚的谢意。最后感谢邱师兄、孙师兄、郭师姐以及实验室的其他师兄师姐，感谢你们给予的帮助，是你们的帮助让我减少操作失误更快的完成实验，更好的撰写论文。结束也是一种开始，衷心的祝愿大家明天的生活越发美好！参考文献1鞠倩. 生长调节剂及蔗糖浓度对彩叶草组织培养物迷迭香酸含量的影响 D. 山东农业大学;2007.2M Petersen，E Husler，B Karwatzki，J Meinhard. Proposed biosynthetic pathway for rosmarinic acid in cell cultures of Coleus blumei Benth J . Planta, 1993, 189(1):10-14.3方颖，温明章. 我国资源植物化学与天然产物化学基础研究的现状与发展 D.生命科学；2015.4汪秋安，刘吉开. 药用天然产物化学研究现状及发展J.大自然探索；1998，2.5吴婷 ,张卫明,顾龚平,沈奇 ,陆长梅 ,吴国荣. 植物次级产物修饰研究进展J. 中国野生植物资源;2016,12.6赵华,张金生,李丽华. 植物精油提取技术的研究进展J.辽宁石油化工大学学报;2006,12.7薛姣. 紫苏迷迭香酸提取工艺及其应用