（物理电子学专业论文）一种新型表面等离子体谐振（spr）生化分析系统的研究.pdf

表 面等离子 体谐振( s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e , s p r ) 传感技术是一项 新 兴的 生物化学检测技术。 s p r传感技术具有免标记检测、 实时检测生化反应的动力学 过程、 无损伤检测等独特的优点。 本论文介绍了一种大范围、 高精度的角度扫描 s p r生化分析仪的研制、测试与应用实验。 该s p r 生 化分 析 仪具 有自 主 知 识 产 权 ( 授 权 发明 专 利 号: z l 9 8 1 0 2 3 6 6 .5 ) 。 它 是一种基于高精度机械扫描结构的谐振角调制 s p r系统，采用先进的虚拟仪器 技术以 及嵌入式微控制器为主体的仪器; 设计、 编制了操作简便、 功能完备的信 息处理软件和操作控制软件: 设计和制造了配套的小型流动注入系统、 温控测试 池及可批量制备的s p r生物传感芯片等，具有创新性。 根据m a x w e l l 方程和f r e s n e l 方程推导出5 层棱镜祸合s p r 数值化模型， 利 用数学软件m a t h c a d对该数学模型进行了 模拟， 讨论了 金属膜厚度姚、 生物膜 厚度d 3 和折射率” 3 、 载玻片厚度d i 与 谐振峰值b s p r 的关系。另外， 还发现了由 于载玻片引 起反射光发生干涉，干涉条纹在 s p r曲 线上产生了周期性的明暗条 纹变化。干涉条纹周期在原s p r谐振角附 近， 存在着一个奇异的 尖锐的 突起， 我们把这个尖突称为s p r千涉谐振峰， 相应的峰顶对应的入射角称为千涉谐振 角b in ,-s p r 。 干涉谐振角b irc t-s p r 在厚度d 3 或者折射率n ， 分别变化时，与 变化的 参 量( d 3 或。 办 有着良 好的线性关系， 与s p r 谐振角b s p r 的 线性具有相同的量级， 这 说明有可能通过测定干涉谐振角成t-s p r 来检测生物样品的细微变化， 从而提出了 一种确定s p r峰值移动的全新的方法。 已 成 功 研 制光、 机、 电 一 体 化、 智能 化、 实 用 化的 表 面 等离 子体 谐振 ( s p r ) 生化分析仪四台， 通过院级鉴定和科技部成果验收， 填补了 我国s p r生化分析 仪产品上的空白， 达到国际先进水平。 对仪器性能进行了测定， 角度扫描范围达 4 0 度一7 0 度，角度扫描分割精度优于。 .0 0 1 度。 应用本仪器进行了多 项生 化应 用实 验并提供多家科研单位使用， 使用反馈表明， 本仪器是目 前国内 唯一具有实 用化水平的国产化s p r仪. 关键词:表面等离子体谐振，生物传感器，虚拟仪器，s p r数值化分析 r e s e a r c h a n d d e v e l o p m e n t o f s u r f a c e p l a s mo n r e s o n a n c e ( s p r ) b i o c h e m i c a l a n a l y s i s i n s t r u m e n t c a i h a o y u a n ( p h y s i c a l e l e c t r o n i c s ) d i re c t e d 切p r o f . c u i d a f u ab s t r a c t s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e ( s p r ) i s a n e w b i o c h e m i c a l a n a l y t i c a l t e c h n o l o g y w h i c h h a s w i d e p r o s p e c t i n m e d i c i n e , c l i n i c d i a g n o s i s , e n v i r o n m e n t a l m o n i t o r a n d f o o d d e t e c t i o n e t c . s p r t e c h n o l o g y h as th e a d v a n t a g e o f l a b e l - f r e e d e t e c t i o n , r e a l - t i m e m o n it o r i n g , a n d n o n - i n v a s i v e a n a l y s i s . t h i s p a p e r p r e s e n t s t h e d e s i g n , m o d e l i n g a n d d e v e l o p m e n t o f a s u r f a c e p l as m o n r e s o n a n c e b i o c h e m i c a l a n a l y s i s i n s t r u m e n t . t h i s s p r i n s t r u m e n t h a s b e e n a w a r d e d f o r a n a t i o n a l i n v e n t p a t e n t 伊a t e n t n o . : z l 9 8 1 0 2 3 6 6 .5 ) . i t s a s p r i n s t r u m e n t b a s e d o n a n g u l a r i n t e r r o g a t i o n , w h i c h c a n f u l f i l l n o t o n l y w i d e r a n g e b u t a l s o h i g h l y s e n s i t i v e a n g u l a r s c a n . u t i l i z i n g t h e p r i n c ip l e o f v i r tu a l i n s t r u m e n t , a n e x p a n d a b le , e a s y t o u s e s y s t e m c o n t r o l a n d d a t a p r o c e s s i n g s o f t w a r e i s p r e s e n t e d . m i c r o fl u i d i n j e c t i o n s y s t e m , s p r c h i p s a n d t e m p e r a t u r e - c o n t r o l l a b l e fl o w c e l l a r e d e v e l o p e d a s t h e a c c e s s o r i e s o f t h e s p r i n s t r u me n t . a f i v e - p h a s e n u m e r i c a l m o d e l b a s e d o n p r i s m c o u p l e d i s d e r i v e d f r o m m a x w e l l e q u a t i o n a n d f r e s n e l e q u a t i o n . u s i n g t h e p r o f e s s i o n a l s o f t w a r e - ma t h c a d , c h a r a c t e r i s t i c o f th i s n u m e ri c a l m o d e l i s s i m u l a t e d . t h e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n d e p t h s o f t h e m e t a l f i l m , b i o - s e n s it iv e f i lm , c o v e r s l i d e , t h e r e f r a c t i v e i n d e x o f b i o - s e n s i t i v e f i lm a n d t h e r e s o n a n t a n g l e o s p r h as b e e n d i s c u s s e d r e s p e c t i v e l y . a d d i t i o n a l l y , a n e w p h e n o m e n o n a b o u t s p r c u r v e c a u s e d b y l i g h t i n t e r f e r e n c e i s d i s c o v e r e d . t h e i n t e r v a l s o f l i g h t s t r i p e h a v e a n i n t e r e s t i n g s h a r p p e a k n e a r t h e r e s o n a n t a n g l e . t h e c o r r e s p o n d i n g i n c i d e n t a n g l e o f t h e p e a k i s c a l l e d i n t e r f e r e n c e - s p r a n g l e , b in ,-s p r t h e s i m il a r l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n $ ; , s p r a n d t h e d e p t h o f b i o - s e n s i t i v e f il m , t h e r e f r a c t i v e i n d e x o f b i o - s e n s i t i v e f i l m r e s p e c t i v e ly c o m p a r e d w i t h t h e r e s o n a n t a n g l e b s p r . i t s h o w s t h a t i t i s a b l e t o u s e i n t e r f e r e n c e - s p r a n g l e , b ;, -s p r as a i n d i c a t o r t o m o n i t o r v e r y s m a l l c h a n g e s i n b i o c h e m i c a l s a m p le s i n s t e a d o f t h e r e s o n a n t a n g l e 氏p r . f o u r i n t e l l i g e n t i z e d s p r h a v e b e e n d e v e l o p e d s u c c e s s f u l l y . t h e p e r f o r m a n c e o f t h e s p r i n s t r u m e n t i s t e s t e d . t h e f u l l s c a l e o f a n g u l a r s c a n i s b e t w e e n 4 0 d e g r e e t o 7 0 d e g r e e a n d t h e a n g u l a r r e s o l u t i o n i s b i o c h e m i c a l e x p e r i m e n t s h a v e b e e n r e s e a r c h e d o n t h e p r a c t i c a b i l i t y i n b i o c h e m i c a l a n a l y s i s . b e t t e r t h a n 0 .0 0 1 d e g r e e . s e v e r a l t h i s s p r i n s t r u me n t a n d c o n fi r m k e y w o r d s : s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e s p r , b io s e n s o r , v i r t u a l i n s t r u m e n t , n u me r i c a l a n a l y s i s o f s p r 第一章 绪论 第一章绪论 夸 1 . 1概述 表面等离子体谐振( s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e , s p r ) 传感技术是一项新兴的 生 物化学 检 测技术。自 从 n y l a n d e 内l i e d b e r g 于1 4 8 2 年首 次将 s p r 传 感技术 用于 气 体 检 测 和 生 物 传感 器中 。 ,z 1 , 2 0 年 来， s p r 传 感 技术 在 实 现方 式、 仪 器 开 发 和 应用领域拓展上都获得了飞速的发展。 s p r 传感技术基于一种名为表面等离子体谐振( s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e , s p r ) 的 物 理 光 学 现象。 当 光 线由 光 密 媒 质 ( 折 射 率 o f ) 照 射 到 光 疏 媒 质 ( 折 射 率 n 2 , 并 且 n j n 力 时， 在 入 射 角 大 于 某 个 特定 角 度时 ， 会 发 生 全反 射 ( t o t a l i n t e r n a l r e fl e c te d , t i r ) ii 象 。 如 果 在 两 种 媒 质 的 界 面 之 间 ， 存 在 一 层 合 适 厚 度 ( 约 为 几 十 n n t ) 的 金 属 膜， 在 发 生 全 反 射 的 条 件 下 ， 入 射 光 线 的 消 逝 波 ( e v a n e s c e n t w a v e ) la l 的 p 偏振分量将穿透导电金属层，并与金属层中的自由电 子相互作用，激发出 沿 金 属 导 体 表 面 传播 的 表面 等 离 子 体 波 ( s u r f a c e p l a s m o n w a v e , s p w ) ， 适当 的 改 变 入射光角度或者波长，当入射光波矢在媒质界面方向上的投影 瓦与s p w的固有 传 播 波 矢k sp 满 足: 权 = 娜( 1 . l ) 消逝波与s p w发生谐振， 入射光的大部分能量被s p w吸收，使得反射光能量急 剧下降， 从而出 现谐振吸收峰， 由 于发生了入射光的能 量吸收， 这种全反 射形式 也 被 称 为 衰 减 全反 射 ( a t t e n u a t e d t o t a l r e fl e c t io n , a t r ) o s p w 的k sp 与 金 属 折 射 率及光疏媒质折射率有关: k sp = 里 c 右 m s . ( 1 . 2 ) 科|了 材+ 。 式 ( 2 ) 中，“ 是入射光在真空中的角频率， c 是入射光在真空中的 速度。 理论计算 表明 5 1 ， 当 光疏媒质折射率发生极细微的变化时， 将会相应的改变谐振吸收峰的 位置。 s p r 传感技术就是利用上述原理对金属表面的被分析物进行检测的。 利用s p r 传感技术 检 测生 化反 应时， 首先 将 一种反 应物 ( 如配体 ) 固定 在 传感 芯片表面金属膜上， 然后将分析物的 样品 ( 受体 以 恒定的速度通过传感芯片， 与 第一章 绪论 传感芯片上分子m的相互作用， 引 起表面膜的 折射率变化，从而使s p r光学信 号的改变， 实时的记录整个反应过程的信号变化， 将可以获得反应的吸附和解离 常数，被测物的浓度等非常有用的参数。 与传统的生化分析方法相比，s p r传感技术具有以下几个显著的优点: . 免标记 检测。 s p r传感技术对被测物质的折射率非常敏感， 它与荧光分 析或 e l i s a检测方法不同，省去了 样品纯化和材料标记 等样品准备步 骤， 大大节省了 额外的时间， 并消除了标记物对反应造成干扰的可能性: 另外， 它可以 观察每个实验步骤对反应的影响， 而不像其他实验方法只 能得到实验的最终结果; . 实时检测。 采用s p r传感技术， 反应的进展情况可以直接地显示在计算 机屏幕上， 这种对实 验步骤的实时反馈， 加快了实验开发和分析的 速度。 最为 吸引人的 是， s p r 传感技术可以 对反 应进行动力学参数分析， 这是 其他分析方法所无法比 拟的。 . 无损伤检测。 s p r传感技术是一种光学检测方法， 光线在传感芯片表面 被反射回来， 并不与被测所接触;由 于光线并不是穿透样品， 甚至是混 浊或不透明的样品，也同样可以进行检测. 传统的分析方法局限于体外实验或使用离体器官进行， 例如 x射线光电子 能 谱( x p s ) 、 俄歇电 子能谱( a e s ) 以 及次级离子质谱( s i m s ) 等， 不仅费用比 较昂贵， 设备 庞大， 灵敏度有限， 而且都不能 研究有关动力 学过程。 与传统技术相比， s p r 技术的 优点极为明显。 s p r分析技术的出 现， 大大加快和优化了 免疫测定过程， 更为d n a和蛋白 质之间的研究带来了 重大突破。 儿十年来， d n a和蛋白 质之间 相互作用， 特别是其反 应动力学的测定一直没有简便快捷的方法， 而s p r技术 解决了这一难题。 1 1 9 4 1 2发展历程 1 9 0 2年， w o o d 16 1 首次描述了 入射光波在衍射光栅上引起的反常 衍射现象。 年， f a n o 17 1根据金属 和空 气界面上 表面电 磁 波的 激发 解 释了 这一 现象。 随 后， 有人提出了体积等离子体的概念，认为这是金属中体积电子密度的一种纵向 波 动; r i t c h ie 8 1 注意到，当高能电子通过金属薄片时， 不仅在体积等离子体频率处 有能量损失峰，在更低频率处也有能量损失峰， 认为这与金属薄膜的界面有关。 第一章 绪论 ， ， 功 玉 d _1 r. 夕 r ( 9 ) 0 .6 只 7 ( 9 ) 刃( . )。 3 3 9 17 7 7. 30 1, 9 1 一 i 一 140 43 1 6 4 氏 ，u 飞 i / 图1 .2典型的s p r 峰值曲线 仔细分析谐振条件式( i . 1 ) 还可以 发现， 如果固定入射角， 采用非单色光入 射， 并利用光谱仪检测反射光的光谱成分， 同 样也可以 获得反射光强 度r 与波长 a的s p r 峰值曲 线。通常把固定入射光波长，改 变入射角度来获得s p r 峰值曲 线的方法称为s p r 角度扫描方法， 而把固定入射角度， 利用含有多种波长成分的 入射光获得s p r 峰值曲 线的方法称为s p r 波长扫描方法。 总的来说， 基于棱镜祸合的a t r方法简单实 用， 较容易达到很高的灵敏 度 。 目 前， 采 用 角 度 扫 描 的 方 法， 获 得 了 折 射 率 分 辨 率 好 于3 x 1 0 - 7 r i u ( r e f r a c t i v e i n d e x u n i t ， 折射率单位 ) 的 实 验结 果; 采用波 长扫描的 方法， 获得了8 0 0 0 n m / r i u 的 实 验 结 果。 现 在， 如 何 把 棱 镜 祸 合的a t r 实 验 结 构小 型 化 1 1 1 ， 并 把多 通 道 检 测 结 合 起 来 ( 12 , 13 1 ， 是s p r 仪 器与 应 用开 发 的 一 个 研 究 热点 . 1 . 3 . 2 基于光栅报合方式的s p r 传感器 当入射光线照射在由 金属层和介质层构成的光栅表面时。 如图1 .3 所示， 将 会发生散 射现象。 反射的散射光线按照不同的散射角度被散射， 如果某一阶( m = 士 1 ， 士 2 士 n ) 的 动 量 在界 面 方向 上 的 投 影 与s p w的 动 量 相 等 的 话， 将与s p w 发生谐振。与棱镜藕合的方式类似，光栅祸合的 s p r传感器也可以 通过检测光 强分布或波长分布两种方式来获得s p r峰值曲线. 第一章 绪论 m = 1 被测物 金属 光 栅 图1 .3基于 光栅祸合的s p r 传感器 光栅祸合s p r传感器的优点在于 利用现代的 微加工工艺， 可以很方便的实 现传感器微型化和批量化生产。n i k i t i n 14 巧妙的利l i t 半导休i艺中ty li s c h o t tk y - b a r ie r 结 构 制 作了s p r 光 栅 ， 获 得 了i x 1 0 -j r i u 的 折 射 率 灵 敏 度 。 它 刘于企属层厚度的要求也没有棱镜祸合方式那么严格。 光栅藕合s p r传感器的折射率灵敏度与棱镜祸合s p r传感器相比要小一些。 m .j . j o 矛is 噜人 将 此 种 结 构 应 用 于 气 体 传 感 器 中 ， 获 得了1 0 0 0 n n il r i u 的 波 长 分 辨率，大致相当于角度扫描方式的 1 0 0度/ r i u灵敏度。此外，光栅祸合 s p r传 感器的数学模型和理论计算也要比 棱镜祸合方式复杂得多 1 6 1 。由于被测样品覆 盖在光栅表而， 光栅祸合方式的被测样品和流通池必须是透明的， 这也给检测带 来了额外的噪声因素。 ; 1 . 3 . 3 光波导 s p r传感器 光波导s p r传感器的原理是: 如图 1 . 4 所示，光波在波导中传播， 当光波经 过表而覆盖有金属层的区域时，消逝波将穿透金属薄层，如果金属表而的 s p w 的相位与光波导波模式的相位相符?1 的话， 将激发出s p r谐振现象， 并在波导 被测物 金属层 在波导中传播的光波 图 1 .4基于光波导结构的 s p r传感器 的出口检测到 s p r峰值曲线。 光波导 s p r传感器的 s p r现象的产生原理与a t r 棱镜结构十分相象，它的理论上可达到的检测折射率精度也与 a t r棱镜结构相 第一章 绪论 仿。 它具有一些很吸引人的优点: 光波的 传输路径可以 人为 控制; 易于实现微型 化:稳定性好等特点。 夸 1 . 3 . 4 光纤 s p r 传感器 光纤 s p r传感器采用光纤作为光的传输媒介，由于光纤的特殊性， 使得这 种 s p r传感器具有其他类 s p r传感器所没有的特点:它可以很方便的探测一些 人类 难于进入或有害的地方; 它可以通过 光纤对敏感信号的传输， 实现远程检测 和 分 布 式 检 测 。 1 9 9 3 年， j o r g e n s o n a n d y e e 17 首 次 提出 了 光 纤s p r 的 结 构。 目 前 报导的光 纤s p r 传感器的 折射率灵敏度约为1 0 - 6 r i u e 妇. 4 s p r 传感器用于检测和分析生物分子亲 和反应 妇 . 4 . 1 检测生物分子亲和反应的原理和基本步骤 s p r生 物 传 感 器 特 别 适 用 于 实 时 检 测 生 物 分 子 在 金 属 薄 膜 ( 最 常 用 的 是 金 膜 ) 时 间 图1 .5 : s p r 检测受体配体反应的原理图。 ( a ) s p r 生 物传感器检测原理图。 ( b ) 典型的 s p r传感图 ( s e n s o r g r a m )反映生 物亲和反应的各个阶段。 上的吸附或结合 1 8 1 ， 见图 1 . 5 。当 用 s p r技术监测 生物分子亲和反应时， 亲 和对的其中之一固定于 金属膜表面作 为捕捉分 子( c a p t o r ) ，当作为分析 物的另一配对物溶液通 过金属膜表面时， 亲和 反 应将分析物捕捉在膜表 面引起附近局部折射率 的增 加， 反 映在s p r 吸收 峰的移 动上。 通 过实 时检 测这种局部折射率的增 加，就可以无需标记的， 实时检测生物分子间的 第一章 绪论 仿。 它具有一些很吸引人的优点: 光波的传输路径可以人为控制; 易于实现微型 化:稳定性好等特点。 夸 1 . 3 . 4 光纤 s p r 传感器 光纤 s p r传感器采用光纤作为光的传输媒介，由于光纤的特殊性， 使得这 种s p r传感器具有其他类s p r传感器所没有的特点:它可以很方便的探测一些 人类难于进入或有害的地方; 它可以通过光纤对敏感信号的传输， 实现远程检测 和 分 布 式 检 测 。 1 9 9 3 年， j o r g e n s o n a n d y e e 17 首 次 提出 了 光 纤s p r 的 结 构 。 目 前 报导的光纤s p r 传感器的 折射率灵敏度约为1 0 -6 r i u e 妇. 4 s p r 传感器用于检测和分析生物分子亲和反应 妇. 4 . 1 检测生物分子亲和反应的原理和基本步骤 s p r生 物 传 感 器 特 别适 用 于 实 时 检 测生 物 分 子 在金 属 薄 膜 ( 最 常 用的 是 金 膜 ) 时间 图1 . 5 : s p r 检测受体配体反应的原理图。( a ) s p r 生物传感器检测原理图。 ( b )典型的 s p r传感图 上的吸附 或结合 1 8 1 ， 见图 1 .5 。当用s p r技术监测 生物分子亲和反应时， 亲 和对的其中之一固定于 金属膜表面作为捕捉分 子( c a p t o r ) ，当作为分析 物的另一配对物溶液通 过金属膜表面时， 亲和反 应将分析物捕捉在膜表 面引起附近局部折射率 的增加， 反映在s p r吸收 峰的移动上。 通过实时检 测这种局部折射率的增 加，就可以无需标记的， 实时检测生物分子间的 ( s e n s o r g r a m ) 反映生物亲和反应的各个阶段。 第一章 绪论 亲和识别过程。 检测的过程一般包括4 个步骤: 先通入缓冲液到固定了亲和对之 一的芯片表面， 清洗获得平衡基线; 然后通入待检测的样品， 即另一 配体， 检测 结合反应直到响应达到平衡: 再通入缓冲液， 检测反应形成的复合物的解离; 最 后通入再生液彻底洗脱掉待检样品， 而让芯片上的所有特异性位点得以再生，用 于 下一 循环的 检 测。 见图 ( 1 .s b ) a 1 . 4 . 2 动力学分析 真正令 s p r生物传感器成为标准的生物分子相互作用分析手段的，是它能 进行亲和反应动力学分析的 特点，正是这一点使它成为独特而有力的分析工具。 k a r l s s o n 9 等第一次报道了用于对抗原抗体免疫反应进行动力学分析的成熟方 法， 应该指出的是， 这个动力学分析方法几乎可以不加修改的用于许多其他的亲 和反 应类别。 在这个方法的 基础上， 许多 用于其他类别的生物分子亲和反 应的动 力学分析方法很快建立起来， 这主要是 b i a c o r e公司研究团队，及其合作实验 室的 贡献2 0 ,2 1 1 。 在生物分子亲和反应检测和动力学分析的另一个重大突破是s p r 成 功 实 现 对 溶液中 小 分 子 5 0 0 0 d 的 检 测 和 动 力 学 分 析 2 2 1 大量的论文也讨论了 有关质量传递对s p r动力学分析的影响。 e d w a r d s 等对 质量传递对固相表面亲和反应的影响做了 详细的理论分析 . s p r传感器是基 于表面的检测手段， 当液相溶液中的溶质结合于固相表面时， 会造成固液表面附 近的液相薄层中溶质浓度的降低，这样会形成这个薄层与外层液相本体的浓度 差， 这个浓度差会产生质量传递效应， 反过来促进这个浓度差的消除。 这种效应 也同样存在于解离过程。在固一 液表面亲和反应中，表面亲和反应和质量传递是 同时 进行的，因此实际上 s p r动力学分析结果反应的是两个分步反应的总体动 力学参数。 总体动力学参数接近限 速步骤的常数。 因 此， 如果质量传递成为限 速 步骤或者对总体反应速率影响较大， s p r传感器分析的k a 和 k t 将严重偏离要检 测的表面亲和反应的动力学常数。 只有当质量传递足够快， 检测到的信号才比较 真实的反映表面亲和反应， 分析的动力学常数才比 较真实。 有效的解决的办法就 是加快流动系统的流速， 不过这样也会加大单次检测的耗样量。 一般而言，当反 应处于 质量传递限 制的 模式下时， s p r 传感器主要用于平衡分析， 因为平衡分析 实际上是对反应热力学特性的分析， 与过程无关。 不过有不少研究小组报道了在 第一章 绪论 质量 传 递限 制下 如何 进行动力学 分析 2 4 ,2 5 1 ， 这 将有助于 节省 耗 样量。 妇. 4 . 3 传感芯片表面的活化 一 特异生物分子的固定 芯片表面的活化是指为了检测和分析某一亲和反应， 将亲和反应对中的一个 成员固定于芯片表面，从而成为检测这个反应的特异性芯片。由于大多数 s p r 生物传感器用的都是金膜， 这里仅仅总结了金膜上的生物分子成膜方法。 在其他 金属膜上成生物膜的方法类似。 有关金膜的方法主要有: 金膜直接物理吸附法 金膜能通过疏水相互作用力将蛋白质吸附在表面，对于表面含疏基的蛋白， 金膜还能形成少量a u - s 键而加强结合牢固度。 蛋白a表面富含疏基， 能在金膜 表面形成牢固的膜。 早期的研究经常采用此方法， 但该方法存在很多缺点。 如大 多 数蛋白 不能在金膜上形成稳定的 膜， 而且覆盖稀疏， 这将导致待检测的生 物分 子非特异的吸附在膜表面， 或者发生蛋白间的置换; 物理吸附常导致蛋白某种程 度上的构象变化， 非定向结合往往会掩盖活性位点， 加上空间位阻， 都会影响检 测灵敏度的下降和反应本身动力学特性的改变。 因此这种办法现在仅仅用于少数 特殊的蛋白质固定， 如蛋白a， 它的表面富含琉基， 能在金膜表面形成牢固的膜。 加上 蛋白a 对与i g g f c 片断的 特异 性结 合， 蛋白a 常常 作为 有效 地定向 固 定i g g 的媒介。 通过金膜上的自 组装层共价连接生物分子 金与这类双功能分子一如 1 6 - 疏基十六烷酸一的末端琉基能形成牢固的 a u - s 键， 能耐大多数中等浓度的强酸和强碱，以 及高浓度盐溶液的长时间清洗， 这类分子的另一端往往是梭基， 氨基， 和轻基等基团， 可以 用e d c / n h s 等活化 试剂处理成为活性基团， 捕获待固定的蛋白 表面的 氨基、 狡基或者m基形成共价 键， 从而将蛋白 分子牢固的结合在芯片表面 2 6 ,2 7 1 第一章 绪论 通过金属鳌合作用将生物分子结合在芯片表面。 常 用的 金属离 子是镍离子。 s p i n k e 等将n i t r i l o t r i a c e t i c a c i d ( n t a ) 固 定于 金 膜 上，然后用n i 鳌合的办法将多聚组胺酸标记的生物分子结合上2 8 1 通过空间网状的高聚物分子固定大量的生物分子 常用的高聚物有葡聚糖、聚丙烯酞胺， 琼脂糖等。 b i a c o r e 公司的c m 5 芯 片是这类芯片的典型代表2 9 ) 。他们先在芯片上连接 c m - 葡聚糖， 然后再用 e d c / n h s 活化c m- 葡聚糖上的梭基为活性酷， 最后捕获待固定蛋白的侧链氨基 基团。 l 日膜方法 l b ( l a n g n 3 u i r - b lo d g e t t ) 膜是一 种超薄 有 机分 子 膜. 该方法 利用l b膜将 液面 上有序排列的某些有机化合物逐层的转移到固定基片上， 实现基片上的特定分子 的高 度有 序排列 3 0 1 。 膜厚 度可以 精 确到 数十埃。 分子印膜技术 加拿大c a r l e o n 大学将此技术 应用于s p r 生物传感器中结合， 并结合s a m技 术， 提高检测的灵敏度和稳定性3 q 固定方法也可以归为两类: 定向固定和非定向固定。 非定向固定的优点是分 子上的固定位点多， 固定效率高; 缺点是， 总是有些分子的活性位点被共价交联 或者因空间 位阻造成活性的部分丧失。 定向 固定能 够较好的克服这个缺点。 上面 介绍的 通过金属离子鳌合作用固定多聚组胺酸标记的蛋白， 就属于这一类。 另外 固定抗体时， 通过与抗体f c 片断特异性结合也属于这一类，比如初步修饰的芯 片与 片 断 上的 糖基( 确 切的 说是 糖 基上的 醛 基 ) 共价结 合， 或者 用蛋白a包 被 ( c o a t i n g ) 的 芯片特异性结合f c 片断， 都能很好的让f a b 片断得到很好的展示。 活化后的芯片也可分为平板型芯片和空间网状型， s p r生物传感器的检测灵敏度 和动力学分析的可靠性与此有十分微妙的关系。 一方面， 一般而言， 把芯片先固 第一章 绪论 定一 层网 状的， 含有大量可活化基团的高 聚物， 然后用这个“ 空间网” 可以固 定 远远多于平面芯片几十到几百倍的活性蛋白， 形成大量的特异性位点， 因而这种 芯片的检测灵敏度相对于采用类似固定方法的平板型芯片可以提高几个数量级。 另一方面， 网状结构往往不利于得到正确的动力学分析结果。 在连续流动系统中， 空间网状结构不利于表面溶液与本体溶液的迅速扩散和对流， 因而会造成网络内 的样品 溶液浓度不稳定并与本体溶液存在浓度差， 也就是说， 虽然在动力学分析 中我们假设被测样品的浓度为常数， 即为连续流动系统中的本体溶液的浓度， 事 实上在这种情况下质量传递可能会成为限制反应速率， 甚至成为限速步骤。 动力 学分析的结果可能会严重偏离要检测的 亲和反 应的 特性， 特别是当 亲和反 应的结 合和解离都很快时。 解决的一个办法是加大微通道的样品流速， 另一个是减少网 络中的活性蛋白的固定量。 因此两类芯片各有特点， 使用者应依据研究目 的和反 应的基本特性进行综合权衡和选择。 ; 1 . 5 s p r 传感技术的应用领域 1 . 5 . 1 s p r 用于分析生物分子间的识别 s p r的 优点即 在于通用性和易操作性。 它可以 分析各种大小分子间的 识别反 应， 分析大小不一的结合常熟和亲和常数。 s p r能够分析的物质的分子量可以 从 从 几百 道尔 顿到 整个细胞， 范围 非 常大 3 2 ,3 3 1 . 一 般的， s p r能 够分 析的 有效 亲 和 性从纳摩尔到微摩尔， 通过一些手段， 可以 将范围 扩展到从亚皮摩尔到毫摩尔以 上。 如果反应的亲和性过于大， 解离过程就十分缓慢，反 而非常不好测。比 如: 用s p r 检 测 一 个 解 离 常 数k op = 1 0 -6 s - ， 的 反 应 ， 要 花 费1 0 4 秒 来 检 测 到 复 合 物 解离掉1 %。 如何分析这些微小信号确实是一个挑战。 可以通过长时间样品注射 和测量不同浓度下到达结合平衡的条件来实现测量高亲和性的反应的各个特性 3 4 1 。 分析低亲和力的反应同 样要小心，因为杂信号特别是非特异性吸附 有可能 掩盖 有效 信号 3 5 1 . 文献3 6 1还介绍了 一 种称为 “ 双参 照 ” 的 技术， 对消除系 统噪音 十分有效。 s p r分析可以 在各种化学环境下进行( 温度、 离子强度、 p h等) 。分析各种 化学条件下的动力学和热力学常数能 够为分析结合反应的机理提供很多独特的 第一章 绪论 线索。 a n d e r s s o n 等 3 7 讲述了 一 个系 统的 方 法来 开发 缓冲液空间，以 获得结 合 反 应的信息， 同时获得芯片再生的最价条件。 有几个研究小组研究了离子强度对结 合反应的 影响， 这些研究显示了 静电引 力在各个反应中发挥的作用3 8 ,3 9 1蛋白 质 - d n a结合反应分析中， 特异性结合和非特异性结合的区别之一就在于它们对离 子强度的依赖特点t州。非特异性结合的亲和性对离子强度有更大的依赖性，因 为d n a的骨架中磷酸根负离子对静电引力贡献很大。 通过分析在不同温度下结 合速率和亲和常数的变化， 可以提供一些反应的热力学参数信息。 除了著名的范 德霍夫图， 结合和解离的速率对温度有很大的依赖性，因此可以为反应过程的活 化能 ( d e la t h , d e l t a s , d e l t a g ) 的 测 量 提 供宝 贵 的 数 据 4 11 人 们 一 直 认为 蛋白 质 折叠 事 件可以 用 复 杂的 能 谱 ( e n e r g y l a n d s c a p e ) 来 描 述， 并对 许多 在折叠路 径中 可能的中 间 体 进行了 各 方 面性质的 确定 4 2 1 。 相反， 分 子 结合反应的能谱4 3 】 则很少报道。由 于s p r分析手段不需要测量热力学参数和测 量结合和解离常数所需的能垒， 因此它从另一面给这些生化反应过程提供了新的 线 索。 通过收 集一定范围 的 温 度和离子强 度下的 动力学 和 热力学 信息， f ri s h 4 4 1 等发现在芽抱杆菌r n a酶和芽抱杆菌r n a酶抑制剂间的反应过程中存在一个 过渡态。 另外有几个小组还用s p r手段分别测定了结合和解离过程的活化能 4 5 1 这些研究对了 解大分子反应的能谱十分关键。 用s p r分析结合反应的动力学和热力学特性， 有助于理解分子识别反应的 复 杂 机 制 。 m y s z k a 等 4 6 将s p r 与 等 温 热 量 测 定 ( i s o t h e r m a l t itr a t i o n c a lo r i m e tr y ) , 分 析 超 速离 心 机( a n a l y t ic a l u l t r a c e n t ri f u g e ) 、 以 及从x 一 射线晶 体学 结合起来， 试图 描 述c d 4 与g p l 2 0 之间 的反 应。 他 们的 分 析结 果显 示， 在配 体结 合过程中 存在 着 广 泛的 结 构 重 组。 d e c r e s c e n z o 等 4 7 发 现t g f - a 与 表 皮 生 长因 子 ( e g f ) irh 1 的 反 应存在着复杂的动力学过程。他们建立了 几套结合机制，结果发现s p r传感器 获得的数据与其中一种构想变化模型相符。 按照这种模型， 配体结合的同时受体 也形成了二聚体的构象。这个结果与其他关于e g f的生物物理研究十分相符。 g u n n a r s s o n 等 4 8 用s p r 来 研 究 人 类。 2 一 巨 球 蛋白 ( m a c r o g lo b in ) 的 构 想 变异， 从 中 发现了 一个关键的位点，它与一个配体识别位点的暴露有关。在其他的s p r系 统中 也发现了背离于理想的1 : 1 l a n g m u i r 模型的 现象，从中获得的 信息可以 用 来建立配体介导的 活化现象4 9 - 0 1 . l e f e r i n k 等15 1 发现， 在生长因子与e r b b - 1 的 第一章 绪论 反 应中 ， 动力 学 速率常 数与m i n t o g e n i c a c t i v i t y 的 相关 性要比 与 平衡常数的相 关 性还好。 m c d o n n e l l 等5 2 1 鉴定了免疫球蛋白e中的ce 2 在过敏反应中的作用。 从i g e 除去这个域很少影响到i g e 与其受体f c e r i 间的总体的亲和性， 但是 会 使解离常数变得很大。因此， 正是ce 2 导致了i g e 与f c e r i 复合物格外难以 解离， 这是i g e 介导的m a s t c e l l s e n s i t i z a t io n ( 过敏反应的一部分) 的重要因素之一。 通过数据拟合软件可以提高对复杂反应的动力学研究的效率。除了各 s p r 产况 . 商家 提供的 软件， 互联网上也有不少优秀的免费 软件提供， 如c l a m p 软件 5 3 ,5 4 1和s p r e v a l u t io n 软 件 5 5 1 。 通 过 小 心 精 细 的 实 验 设 计 和 数 据 采 集 手 段 5 6 1 ， 并 且运用优化的数据分析手段， 包括对质量传递的影响的模拟， 我们可以很好的去 除掉试验的噪音。在早期的s p r研究中， 这些噪音很普遍 5 1 ,5 8 1 。 有效的去掉了 这些噪音以后，研究人员就有信心来用获得的动力学数据解释生物反应机理了。 吞 1 . 5 . 2 s p r 用于 膜结 构与 功能的 研究 十几年前，当时s p r还未成为分析生物分子识别过程的流行技术，材料科 学家就己 经用等离子体共振光谱技术来分析分子膜的表面和光学特性 5 9 ,6 0 1最 近，用于分析膜上事件的芯片和s p r系统出现了不少。相对于传统的溶液分析 手段， 用于膜分析的s p r芯片膜表面都是平坦的， l i g a n d 也很容易在表面定向 地固定， 这些特点都使s p r成为更好的 膜结构研究手段。 e r b 等 6 1 1 分析了 一种 用于 脂 质体 吸附的s p r 芯片的 各 个 性质。 他 们 用原 子力 ( a t o m i c f o r c e ) 显微 镜和 荧光显微镜观察到脂类在芯片表面形成均一的单分子层， 从而说明它能很好的 模 拟生物膜。 用这种脂