（农产品加工及贮藏工程专业论文）新型淀粉酶在玉米淀粉制备结晶葡萄糖中的应用.pdf

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葡萄糖淀粉酶和新型普鲁兰酶协同作用进行糖化，可以缩短糖化时 间，提高葡萄糖转化率。 以新型耐高温a 一淀粉酶为液化酶，葡萄糖淀粉酶为糖化酶，用玉 米淀粉制备结晶葡萄糖过程中，液化d e 值控制在1 5 2 0 时，葡萄糖 最终转化率最高。低于1 5 或者高于2 0 ，最终糖化d e 值都会下降。 通过液化单因素试验，确定出影响液化的各因素最佳取值范围为： 粉浆浓度在2 0 3 0 之间，液化时间6 0 分钟左右，耐高温d 一淀粉酶用 量3 2u g # 自左右，液化温度在9 1 以上，液化p h 值在5 6 6 2 之间。 以影响液化各因素最佳取值范围为依据，利用正交试验确定出液化 最佳工艺参数为：温度9 7 。c 、p h 6 0 、粉浆浓度2 5 n 、液化时间6 0 分钟、 耐高温d 一淀粉酶用量2 4 u g # 。验证试验证明，利用优化参数进行液 化，最终液化d e 值达到1 8 0 0 ，透光率3 0 、o ，液化液中蛋白质等杂 质凝聚良好。 通过糖化单因素试验，确定出影响糖化的各因素最佳取值范围，结 论如下：糖化温度在6 0 左右，糖化p h 值在4 0 4 ，5 之间，糖化时间 在3 6 6 0 小时之间，葡萄糖淀粉酶用量在3 0 0 u g 左右，普鲁兰酶用 量0 1 0 a s p u g * 糟左右。 以影响糖化各因素最佳取值范围为依据，利用正交试验确定出糖化 最佳工艺参数为：糖化温度6 0 。c 、p h 值4 5 、糖化时间4 8 小时、葡萄糖 新型淀粉酶在玉米淀粉制备结晶葡萄糖中的应用 淀粉酶用量2 5 0 u g # 粉、普鲁兰酶用量0 1 0a s p u g 粉。验证试验证明， 利用优化参数进行糖化，最终糖化d e 值达到9 8 8 0 ，从而进一步提高 了葡萄糖转化率，为玉米淀粉制备结晶葡萄糖生产提供了新的理论依据。 关键词：玉米淀粉；结晶葡萄糖；液化：糖化；淀粉酶。 2 山东农业大学硕士学位论文 a p p l i c a t i o no f n o v e l a m y l a s e s i nt h ep r o c e s s i n go f c r y s t a l l i n e d e x t r o s ef r o mc o r l ls t a r c h a b s t r a c t t h et e c h n o l o g i e so f l i q u e f a c t i o na n ds a c c h a r i f i e a t i o na r et h ek e yf a c t o r s w h i c hd e t e r m i n et h ed ev a l u e ，t h eq u a l i t yo fg l u c o s ea n dt h ep r o d u c t i o n p e r i o d i nt h ep r o c e s s i n go fc r y s t a l l i n ed e x t r o s ef r o mc o r ns t a r c h ，a n dt h e a p p l i c a t i o no fa m y l a s ep e r f o r m sad e c i s i v ef u n c t i o n i no r d e r t om a k ea g o o d u s eo ft h ea b u n d a n td o m e s t i cr e s o u r c eo fc o r ns t a r c h ，e n h a n c et h e g l u c o s e c o n v e r s i o nr a t ea n di m p r o v et h ef i l t e r a b i l i t yo fg l u c o s es o l u t i o n ，a f f e c t i n g f a c t o r so fc o r ns t a r c hl i q u e f a c t i o na n ds a c c h a r i f i c a t i o nw e r es t u d i e di nt h i s p a p e rw i t ht h el i q u e f y i n ge n z y m e o fn o v e lt h e r m o s t a b l e o a m y l a s ea n dw i t h t h e s a c c h a r i f y i n ge n z y m e o f g l u c o a m y l a s e a n dn o v e l p u l l u l a n a s eb y d u a l e n z y m em e t h o d a tt h es a m et i m e ，t h et e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r so fc o m s t a r c hl i q u e f a c t i o na n ds a c c h a r i f i c a t i o nw e r ea l s oo p t i m i z e d t h em a i nr e s u l t sf i r ea sf o l l o w s ： t h el i q u e f a c t i o n p e r i o d w a ss h o r t e n e da n dt h e q u a l i t y o fl i q u e f y l u g s o l u t i o na sw e l la st h ec o h e r e n c yo fi m p u r i t i e ss u c ha sp r o t e i ni nl i q u e f y i n g s o l u t i o nb o t hc o u l db ei m p r o v e dw i t ht h ea i do ft h en o v e lt h e r m o s t a b l e d a m y l a s e s a c c h a r i f y i n g w i t ht h e c o o p e r a t i o n o f g l u c o a m y l a s e a n dn o v e l p u l l u l a n a s e ，s a c c h a r i f i c a t i o np e r i o d c o u l db es h o r t e n e da n d g l u c o s e c o n v e r s i o nr a t ew a sa l s oe 1 1 l a n c e d d u et ot h en o v e ll i q u e f y i n ge n z y m e ，t h et h e r m o s t a b l e 1 2 一a m y l a s ea n d w i t ht h eh e l po ft h es a c c h a r i f y i n ge n z y m e ，g l u c o a m y l a s ea n d p u l l u l a n a s e ，t h e f i n a lc o n v e r s i o nr a t eo fg l u c o s er e a c h e dt h et o pw h e nt h el i q u e f a c t i o nd e v a l u ew a sc o n t r o l l e db e t w e e n15 a n d2 0 i nt h ep r o c e s s i n go fc r y s t a l l i n e d e x t r o s ef r o mc o r ns t a r c h ，a n dt h ec o n v e r s i o nr a t eo f g l u c o s ed e c l i n e dw h e n t h ed ev a l u ew a sl o w e rt h a n15 o rh i g h e rt h a n2 0 t h eo p t i m a ln u m e r i ca r e ao fa l lf a c t o r s a f f e c t i n gl i q u e f a c t i o n w e r e o b t a i n e da sf o l l o w sb ys i n g l ef a c t o rt e s t ：c o r ns t a r c hc o n c e n t r a t i o n2 0 3 0 ， l i q u e f a c t i o np e r i o d6 0m i n u t e so rs o ，d o s a g eo f t h e r m o s t a b l e a a m y l a s e a b o u t3 2u ( gs t a r c h ) ，t e m p e r a t u r ea b o v e 9 1 ，p h v a l u e5 6 6 2 3 新型淀粉酶在玉米淀粉制备结晶葡萄糖中的应用 a c c o r d i n g t ot h eo p t i m a ln u m e r i ca r e ao f a l lf a c t o r sa f f e c t i n gl i q u e f a c t i o n ， t h e o p t i m a tp a r a m e t e r so fl i q u e f a c t i o n w e r eo b t a i n e db ) ，o r t h o g o n a lt e s t ： t e m p e r a t u r e9 7 。c ，p h6 0 ，c o r ns t a r c hc o n c e n t r a t i o n2 5 ，l i q u e f a c t i o np e r i o d 6 0m i n u t e s ，d o s a g eo ft h e r m o s t a b l e a - a m y l a s e2 4 u ( gs t a r c h ) t h e p r o v i n gt e s tg r o u n d e d o nt h e s eo p t i m a l p a r a m e t e r ss h o w e dt h a t t h ef i n a l l i q u e f a c t i o nd e v a l u er e a c h e d1 8 0 0 ，a n dt h a tt h et r a n s m i t t a n c ea c h i e v e d 3 0 o m e a n w h i l e t h ei m p u r i t i e ss u c ha sp r o t e i ni nl i q u e f a c t i o ns o l u t i o nw e r e c o h e r e dw e l ld u r i n gt h el i q u e f a c t i o np r o c e s s t h eo p t i m a ln u m e r i ca r e ao fa l lf a c t o r sa f f e c t i n gs a c c h a r i f i c a t i o nw a g o b t a i n e d b ys i n g l e f a c t o rt e s ta s f o l l o w s ：t e m p e r a t u r e a b o u t 6 0 ， s a c c h a r i f i c a t i o n p hv a l u e4 0 - 4 5 ，s a c c h a r i f i c a t i o np e r i o d 3 6 - 6 0 h o u r s ， d o s a g eo fg l u c o a m y l a s ea b o u t3 0 0 u 幢s t a r c h ) ，d o s a g eo fp u l l u l a n a s ea b o u t 0 10 a s p u ( g s t a r c h ) t h e o p t i m a lp a r a m e t e r s o fs a c c h a r i f i c a t i o nw a sa l s o a c q u i r e db y o r t h o g o n a lt e s t s e c u n d u mt h eo p t i m a ln u m e r i ca r e ao fa l lf a c t o r s a f f e c t i n g s a c c h a r i f i c a t i o n ：t e m p e r a t u r e6 0 。c ，p h4 5 ，s a c c h a r i f i c a f i o np e r i o d4 8h o u r s ， d o s a g eo fg l u c o a m y l a s e2 5 0u ( gs t a r c h ) ，d o s a g eo fp u l l u l a n a s e0 10 a s p u 乜s t a r c h ) t h ep r o v i n gt e s tb a s e do nt h e s eo p t i m a lp a r a m e t e r sr e v e a l e dt h a t t h ef i n a ls a c c h a r i f i c a t i o nd ev a l u er e a c h e d9 8 8 0 t h u sg l u c o s ec o n v e r s i o n r a t ew a se n h a n c e dg r e a t l y , a n dt h i sn e wt e c h n o l o g yo fl i q u e f a c t i o na n d s a c c h a r i f i c a t i o nd e s t i n e dt oc o n t r i b u t eal o tt ot h ep r o d u c t i o no fc r y s t a l l i n e d e x t r o s ef r o mc o i ns t a r c h k e y w o r d s ：c o i t i s t a r c h ；c r y s t a l l i n ed e x t r o s e ；l i q u e f a c t i o n ；s a c c h a r i f i c a t i o n ； a m y l a s e 4 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 葡萄糖是自然界分布最广，也是最重要的单糖。葡萄糖的用途很广 泛，特别是结晶葡萄糖，现在广泛应用在食品、医药、化学等工业。在 食品上用在罐头、面包、糕点、果酱、果冻、低热量啤酒等生产中。医 药上用来生产口服葡萄糖、注射葡萄糖液。作为基质可以生产多类抗菌 素及维生素，也可转化生产氨基酸。化工上用来生产葡萄糖酸、葡萄糖 醇、甘油、山梨酸、柠檬酸、苹果酸等有机酸及其衍生物( 罗明朗，1 9 9 5 ) 。 众所周知，葡萄糖是淀粉最重要的下游产品之一，同时也是玉米的 重要深加工产品。尤其在美国，以玉米为原料生产的淀粉糖己全面代替 了蔗糖，广泛进入了工业加工及家庭食用等各个领域( 刘炎，2 0 0 4 ；石桂 春，2 0 0 1 ) 。 我国有着非常丰富的玉米资源，1 9 9 9 年己达1 2 亿吨，占世界第二 位。同时，由于玉米易于运输和贮藏，可供周年生产，不受季节限制， 淀粉含量高，制作较简便，主产品质量好，副产品种类多，利用价值高， 所以玉米已逐渐成了我国制造淀粉的主要原料，玉米淀粉已占我国淀粉 总产量的9 0 左右，因此，也就成了制造葡萄糖的理想选择( 孙义 章，2 0 0 1 ) 。 据中国淀粉工业协会统计数字显示，2 0 0 0 年全国的结晶葡萄糖的需 求量为8 万吨，2 0 0 1 年为9 万吨，增长了1 2 5 ，2 0 0 2 年以后年需求仍 以1 5 的速度递增；而2 0 0 0 年生产量仅为5 4 7 万吨，2 0 0 1 年生产量为 5 7 6 万吨，增长了5 3 ，2 0 0 2 年以后生产量基本稳定。可见，结晶葡萄 糖的生产增长速度远远跟不上市场的需求增长速度，生产规模还不能满 足市场需要。因此，进行玉米淀粉制各结晶葡萄糖的深入研究，提高葡 萄糖的转化率，缩短生产周期，从而提高生产能力，对于促进农业经济 发展，具有重要意义。 1 1 玉米淀粉的结构及加工性质 1 1 1 淀粉的分子结构 淀粉分子是以白色固体淀粉粒的形式存在，淀粉粒是淀粉分子的聚合 体，它由直链淀粉、支链淀粉和中间型多糖构成。直链淀粉是脱水葡萄 糖单位间经过n 一1 ，4 糖苷键连接的d 一葡萄糖的多聚体，其分子量在5 新型淀粉酶在玉米淀粉制各结晶葡萄糖中的应用 2 0 万之间，相当于2 0 0 1 2 0 0 个葡萄糖分子聚合而成。支链淀粉是以a l ，4 糖苷键连接为主，同时还有2 4 通过a 一1 ，6 糖苷键连接而成的 d 一葡萄糖的聚合体，其中，a 一1 ，4 糖苷键连成的链作主链，在主链上通 过n l ，6 糖苷键形成众多的侧链。支链淀粉的分子量在2 0 6 0 万之间， 相当于1 3 0 0 3 6 0 0 0 个葡萄糖聚合而成( t a k e d a ya n dh i z u k u r is ，1 9 8 6 ； t a k e d aa n ds h i r a s a k ak ，1 9 8 4 ) 。淀粉颗粒中除了直链淀粉和支链淀粉 外，还存在着中间型多糖( r u t e n b u r g ，1 9 8 4 ) ，这种中间型多糖分支高、 分子量小，其含量的多少对淀粉糊化后粘度的变化有较大的影响。直链 淀粉和支链淀粉的分子结构如图1 和图2 所示。 “o 图1 直链淀粉分子结构 c h ：o h 。姆。 ho h 图2 支链淀粉分子结构 f i 9 2 m o l e c u l es t r u c t u r eo fa m y l o p e c t i n 6 山东农业大学硕士学位论文 1 1 2 淀粉的糊化 将淀粉倒入冷水中，因淀粉不溶于冷水，只能混于水中，经搅拌会成 为乳白色的不透明悬浮液，称为淀粉乳。停止搅拌，则淀粉颗粒慢慢下 沉，经一定时间后，淀粉沉淀于下部，上部为水。将淀粉乳加热，淀粉 颗粒无定形区域吸水膨胀，而结晶束区域具有弹性，仍保持颗粒结构。 随温度上升，淀粉吸收水分更多，体积膨胀更大，达到一定温度后偏光 十字消失，温度继续上升，淀粉粒继续膨胀，可达原体积的几十倍甚至 数百倍，高度膨胀的淀粉粒间互相接触，变成半透明粘稠状液体，虽停 止搅拌，也不会发生沉淀，称为淀粉糊，这种由淀粉乳转变成糊的现象 称为淀粉的糊化。淀粉糊并不是真正溶液，而是由膨胀淀粉粒的碎片、 水合淀粉块和溶解的淀粉分子组成的胶状分散物( 张力田，1 9 9 9 ) 。 淀粉发生糊化现象的温度称为糊化温度，又称胶化温度。即使同一品 种的淀粉，颗粒大小不同，糊化难易程度也不相同。淀粉中大的颗粒容 易在较低的温度下先行糊化，称糊化开始温度，待所有淀粉颗粒全部被 糊化，所需的温度称糊化完成温度，两者相差约1 0 。糊化温度不是指 某一个确定的温度，而是指从糊化开始温度到糊化完成温度的一定范围。 普通玉米淀粉的糊化温度在6 2 7 2 ( 高嘉安，2 0 0 1 ) 。 淀粉的糊化受很多因素的影响。含直链淀粉较高的淀粉粒相对糊化 要难些；许多溶剂如液态氨、甲醛、甲酸、氯乙酸、二甲基亚砜、盐酸 等，由于它们能破坏淀粉颗粒中分子间的氢键或与淀粉形成可溶性配合 物，从而促进淀粉发生糊化；某些化学试剂如碱( o o s t e n ，1 9 8 4 ) 、盐 ( e v e n s ，1 9 8 2 ) 、醇( h i z u k u r i ，1 9 7 8 ；o o s t e n ，1 9 8 0 ) 等也能降低或提高淀 粉糊化作用的温度以及影响糊化进行的程度；糊化温度随糖浓度的增加 而增高。 1 1 3 淀粉的回生 淀粉糊放置一定时间后会逐渐变浑浊，最终可产生不溶性的白色沉 淀，而将浓的淀粉分散液冷却，可迅速形成有弹性的胶体，这种现象称 为淀粉的回生，也叫淀粉的老化或凝沉。因此，回生是指淀粉基质从溶 解、分散成无定型游离状态返回至不溶解、聚集或结晶状态的现象。凝 沉淀粉为结晶结构，不溶于水，具有b 一型x 光衍射图样。淀粉糊或淀粉 新型淀粉酶在玉米淀糟制备结晶葡萄糖中的应用 溶液的回生具有下列效应：强度增加；呈现不透明和浑浊；在热糊表面 形成不溶解的结膜：不溶性的淀粉粒沉淀；形成胶体；脱水收缩。 淀粉回生的本质是糊化的淀粉分子在温度降低时，由于分子运动缓 慢，直链淀粉分子和支链淀粉分子的分支都回头趋向于平行排列，相互 靠拢，彼此以氢键结合，重新组成混合微晶束，其结构与原来的生淀粉 粒的结构很相似，但不呈放射状，而是零乱地组合( j e o n g o kk i m ，1 9 9 7 ) 。 由于所得的淀粉糊中氢键较多，分子间缔合很牢固，水溶解性下降，如 果淀粉糊的冷却速度很快，特别是较高浓度的淀粉糊，直链淀粉分子来 不及重新排列结成束状结构，便形成凝胶体。淀粉糊中直链淀粉回生机 带j f 见图3 。 飞 j 符 i 踅 图3 直链淀粉回生示意图 通常回生在淀粉糊冷却过程以及在7 0 或7 0 。c 以下贮存时发生，然而 还有另外一种形式的回生存在，它是在7 5 9 5 。c 贮存淀粉溶液时发生的， 并形成均匀的颗粒状沉淀，称为高温回生现象。玉米淀粉经1 2 0 1 6 0 。c 糊化，得到的淀粉糊在7 5 9 5 贮存时，就发生回生，形成沉淀颗粒 山东农业大学硕士学位论文 ( g i d l e ymj ，1 9 9 5 ) 。沉淀颗粒是由玉米直链淀粉同游离脂肪酸结合成络 合物而形成的。普通玉米淀粉在9 5 。c 以上贮存时没有高温回生现象发生， 说明直链淀粉同脂肪酸结合形成的络合物在此温度下被解离。 淀粉的回生速率是以淀粉糊从9 5 。c 冷却至5 0 。c 后强度的增加来表 示。高嘉安等研究证明，玉米淀粉糊回生相当快，其原因主要是直链淀 粉含量高( 2 8 ) ，d p 小( 2 0 0 1 2 0 0 之间) 和类脂体含量高( 0 8 ) 。玉米 淀粉回生的速度与淀粉粉浆的浓度以及p h 值等因素有关，粉浆浓度3 0 6 0 ，p h 值5 7 之间回生速度最快( 高嘉安，2 0 0 1 ) 。在玉米淀粉制备 葡萄糖的过程中，回生淀粉不能被酶水解，从而影响葡萄糖的产率和质 量( 李志达，1 9 9 4 ；马德，2 0 0 4 ) 。 1 1 4 淀粉的水解 淀粉与水一起加热即可引起分子裂解。当与无机酸一起加热时，可 彻底水解成葡萄糖，水解过程是分几个阶段进行的，同时有各种中间产 物相应形成： 淀粉可溶性淀粉卜糊精卜麦芽糖卜葡萄糖 淀粉酶在一定条件下也会使淀粉水解，根据淀粉酶的种类( 。一淀粉 酶、b 一淀粉酶、葡萄糖淀粉酶及异淀粉酶) 不同，可将淀粉水解成葡萄 糖、麦芽糖、三糖、果葡糖浆、糊精等成分。 1 2 玉米淀粉制备葡萄糖的方法 淀粉水解产品是淀粉应用的一个主要方向，其中尤以甜昧剂为主。 通常把利用淀粉为原料生产的糖品统称淀粉糖，葡萄糖是重要的淀粉糖， 在制备葡萄糖时，首先要通过酸或酶把淀粉水解，然后利用水解所获得 的糖浆，通过不同途径转化成相应的精制品。淀粉水解的基本方法有三 种：酸解法、酸酶结合法、双酶法( 林勇，1 9 8 6 ) 。 1 2 1 酸解法 酸法水解淀粉最早始于西方，1 8 11 年化学家k i r c h o f f ( 柯尔乔夫) 在添加硫酸于马铃薯淀粉乳以制胶粘剂时，错误地多加了酸，得到了具 有甜味的糖浆，这是淀粉制糖的开始( 张力田，1 9 9 7 ) 。此后，淀粉水解 制糖发展缓慢，直至2 0 世纪2 0 年代初，美国开始较大规模地用酸法技 术制取葡萄糖和果糖糖浆等，酸法水解淀粉才开始快速发展，国内最传 9 新型淀粉酶在玉米淀粉制各结晶葡萄糖中的应用 统的玉米淀粉制备葡萄糖的方法也是酸解法。但这种传统酸法水解工艺 存在很多缺点：需要耐酸耐压设备；需要精制淀粉为原料；淀粉投料的 质量分数较低，仅为2 0 左右；水解后必须中和，色泽深，精制费用大； 淀粉转化为葡萄糖的收率低，不超过9 0 ( 刘佐才，2 0 0 1 ) ；水解过程中， 由于葡萄糖的逆聚合反应而生成较多带苦味的低聚糖，葡萄糖必须用结 晶法精制才能将苦味去除；久贮后还因生成氧化甲基糖醛而转变成褐色 等。因此，这种传统工艺逐渐被新兴的酶法技术替代。 1 2 2 双酶法 酶法制糖始于我国，我国饴糖的制造已有2 0 0 0 多年的历史，古籍早 有记载：“饴，米蘖煮也”( 说文) ，就是说饴糖是米饭与谷芽共同煮 熬而成。古人不知道什么是酶，酶的概念的提出以及将酶提取出来使用， 是1 9 世纪才开始的。1 8 3 3 年p a y e r 等人从麦芽提取液中加酒精沉淀获得 淀粉酶，可使2 0 0 0 倍的淀粉分解，不久淀粉酶被用于棉布退浆 ( u h l i g ，1 9 8 8 ) 。1 8 9 2 年c a l m e t t e 从我国的药酒中分离出纯种根酶糖化 酶，用于酒精发酵( m a y e r ，1 9 5 9 ) 。1 8 9 6 年，本高峰让吉首先用米曲霉固 体培养法生产“他卡”淀粉酶，作为消化荆( f u k u m o t o ，1 9 1 5 ) 。1 9 1 7 年法 国人b o i d i n 与e f f r o n t 等又先后发现枯草杆菌可以分泌耐热且活性更强 的a 淀粉酶( w e l l kne ，1 9 6 3 ；g o d f r e y ，1 9 8 3 ) ，并于1 9 2 6 年在德国设 厂生产( m a y e r ，1 9 5 9 ) ，为微生物酶的工业化生产奠定了基础，直至1 9 4 9 年日本开始采用深层培养法生产细菌。一淀粉酶( w e l l kne ，1 9 6 3 ) 后，微 生物酶制剂的生产才进入大规模工业化的阶段。随着酶工业技术的进步， 1 9 5 5 年德氏根酶与黑曲霉糖化酶首先被做成结晶( p a z u rjh ，1 9 7 1 ) 。1 9 5 9 年酶法生产葡萄糖获得成功( g o d f r e y ，1 9 8 3 ) ，大约1 9 6 0 年，日本开始用 n 一淀粉酶液化和葡萄糖淀粉酶糖化的双酶法生产结晶葡萄糖 ( m a y e r ，1 9 5 9 ) 。这不仅是葡萄糖工业的重大革新，也是葡萄糖生产史上的 第一次大飞跃。 与传统酸法水解淀粉相比，酶法具有独特的优点( 刘佐才，2 0 0 1 ) ：可 在常温常压和温和酸度下，高效地进行催化反应，简化了设备，改善了 劳动条件和降低了成本；酶催化所需的活化能极低，催化效率远比无机 酸高，a 一淀粉酶与糖化酶共同作用于淀粉，得到的葡萄糖液d e 值可以 山东农业大学硕士学位论文 达到9 8 ；酶水解具有专一性，制得产品的纯度高( s l o m i n s k a ，1 9 8 6 ) ： 酶本身是蛋白质，无毒，对酸碱度极为敏感，故可简单地采用调节酸碱 度、改变反应温度或添加抑制剂等方法来控制反应的进行；酶的来源广 泛，许多动植物和微生物都可作为某些酶的原料：酶可以回收，重复利 用( 冼雪芬，1 9 9 9 ) 。 1 2 3 酸酶结合法 约在1 9 4 0 年美国开始采用酸酶合并糖化工艺生产高甜度糖浆。传统 的酸酶法是先采用加酸至p h l 5 左右加压糖化，此后接着用酶转化。陈 三宝等曾经研究利用酸酶法水解玉米粉制备葡萄糖( 陈三宝，1 9 9 8 ) ，虽然 利用酸水解有效率高、速度快、时间短、过滤容易的优点，但酸水解选 择性差，杂质分解多，颜色深，精制费用高。 另外，由于葡萄糖的复合反应和分解反应，加上转苷酶的作用，糖化 过程中会产生潘糖等杂糖，这些杂糖总含量在酸酶法工艺中约为7 8 ， 酸法工艺约为1 2 1 5 ，双酶法工艺约为3 4 ( 高嘉安，2 0 0 1 ) 。这 些杂糖的去除，主要是通过葡萄糖结晶时析出，而后从母液分离中排掉， 杂糖的存在会严重影响结晶速度和葡萄糖收率。 根据以上几点，现在玉米淀粉制备结晶葡萄糖生产中大多使用双酶 法。 1 3 淀粉酶的应用 与玉米淀粉制备结晶葡萄糖有关的淀粉酶主要包括a 一淀粉酶、葡萄 糖淀粉酶、普鲁兰酶等( u h l i g ，1 9 8 8 ) ，虽然也出现了一些新型复合酶制 剂，但其在玉米淀粉制备结晶葡萄糖的生产中并不理想( 王怀贵，2 0 0 1 ) 。 1 3 1q 一淀粉酶 q 一淀粉酶水解淀粉是从分子内部进行的，水解中间地位的a - 1 ，4 键，先后次序没有一定规律，是杂乱的，因此，归类于内切水解酶，简 称内酶。糖苷键水解过程中，相邻葡萄糖单位间的c l o 口键断裂，加 上一个水分子，断裂处发生在c 。一o 键上。由于水解时，作用于长链比短 链更有活性，所以最初阶段水解速度很快( r a m e s hm v ，1 9 9 0 ) 。把庞大的 淀粉分子迅速断裂成小分子，此时淀粉浆的粘度也随之急剧降低，失去 粘性，称为液化。液化作用的主要产物是糊精，随水解继续进行，糊精 新型淀粉酶在玉米淀粉制备结晶葡萄糖中的应用 由大逐渐变小，淀粉遇碘的颜色反应也由开始的蓝色逐渐转变为紫、红、 棕色，当小到一定程度时，遇碘不再变色，称为消色点。除遇碘显色的 变化外，还原性也会随分子变小而升高。在快速水解阶段完成之后，酶 对小分子的水解活性明显降低，进入一个缓慢水解过程。 不同来源的n 一淀粉酶其性质有很大差别，a 一淀粉酶主要来源于真 菌、细菌及霉菌( 周恒刚，1 9 9 6 ) 。在国内，生产上普遍使用的a 一淀粉 酶是由枯草杆菌生产的中温n 淀粉酶，其作用温度范围一般在6 5 8 0 。耐高温a 一淀粉酶是近几年在我国市场出现的新型酶制剂，其温度适 用范围为6 0 1 i 0 c ，( 林剑，2 0 0 3 ：刘仲敏，1 9 9 9 ) ，它是通过固体发 酵或者液体深层发酵由地衣芽孢杆菌生产的( r a m e s hm v ，1 9 9 0 ) ，因其 具有相当的酶活力和较好的热稳定性，可以将淀粉的a 一1 ，4 葡萄糖苷 键任意切割成短链糊精( m a r c h a llm ，1 9 9 9 ) 。诺维信有限公司生产的 诺维信 耐温淀粉酶s u p r a 是最新一代液体耐高温a 一淀粉酶，除了具有 很好的耐温性及相当的酶活力，还可在完全无钙及p h 5 5 下稳定运行， 基于以上优点，本研究拟采用该新型淀粉酶作为液化酶。 图4 a 一淀粉酶水解直链淀粉和支链淀粉示意图 f i 9 4 a a m y l a s eh y d r o l y z e sa m y l o s ea n da m y l o p e c t i n 山东农业大学硕士学位论文 1 3 2 葡萄糖淀粉酶 葡萄糖淀粉酶是一种外切酶，水解淀粉或短链糊精时，是从非还原 末端的a 一1 ，4 键开始，使个葡萄糖单位分离，产生的葡萄糖为b 一构 型，水解产物只有葡萄糖，没有其它种糖生成。水解过程中葡萄糖单位 之间的c 。一o c 。中的c 。一0 键断裂，与n 一淀粉酶一样，也是作用于长链 比短链活性大( j e n n y l y n da j a m e s ，1 9 9 6 ) 。 虽然葡萄糖淀粉酶能优先水解a 一1 ，4 键，但对d 一1 ，3 和a 一1 ，6 键也有一定活性，只是水解速度很慢，仅及水解a 一1 ，4 键的6 6 和3 6 。葡萄糖淀粉酶水解淀粉分子和较大分子的低聚糖属单链式，即水解 一个分子完成后，再水解另一个分子，但水解较小分子的低聚糖属多链 式，即水解一个分子几次后，脱离再水解另一个分子。 影响葡萄糖淀粉酶作用的主要因素是p h 和温度，不同来源的葡萄糖 淀粉酶在适用温度和p h 上有一定差异。曲霉为5 5 6 0 。c ，p h 3 5 - - 5 0 ( m i b r a h i mr a j o k a ，2 0 0 5 ) ：根霉为5 0 5 5 ，p h 4 5 - - 5 5 ；拟内抱霉为 5 0 。c ，p h 4 8 5 0 。糖化时间一般为几十小时。糖化过程中5 5 温度下 长时间水解，易感染杂菌，糖化在6 0 。c 进行，可以避免杂菌生长。低p h 下糖化，有色物质生成少，颜色浅，易于脱色。基于以上分析，生产上 主要使用来源于曲霉的耐温耐酸型的葡萄糖淀粉酶( e h a bs e r o u r ，2 0 0 2 ) 。 1 3 3 普鲁兰酶 普鲁兰酶是支链淀酚酶，它能水解支叉结构的n - i ，6 键，还能水解 线性直链分子中的a l ，6 键。但这种酶不能水解潘糖、异麦芽糖以及只 含n 一1 ，6 键的多糖，说明它切开的一1 ，6 键的两头至少要有两个以上的 一l ，4 键( g w o j e n ns h e n ，1 9 9 0 ) 。工业上使用的支链淀粉酶主要由微 生物制取，n o v o 公司生产的支链淀粉酶商品名为p r o m o z y m e ，是由酸性 解普鲁兰芽孢杆菌所生产，酶最适p h 5 0 ，最适温度6 0 。c ，耐酸、耐热 稳定性好( 陆健，1 9 9 8 ) 。无锡杰能科生物科技有限公司生产的新型 o p t i m a xl - 3 0 0 普鲁兰酶适用范围为温度5 5 6 5 、p h 值4 o 4 5 ，这 一参数与来源于曲霉的葡萄糖淀粉酶很匹配，因此，该新型普鲁兰酶也 是本研究拟采用的新型淀粉酶。 1 4 双酶法液化、糖化工艺中尚存在的问题 新型淀粉酶在玉米淀粉制各结晶葡萄糖中的应用 在玉米淀粉制备结晶葡萄糖的过程中，液化、糖化工艺是决定葡萄 糖的转化率、葡萄糖质量以及生产周期的关键环节。目前生产中还存在 一些尚待解决的技术问题： 一是葡萄糖转化率不高。一般的酶法生产葡萄糖转化率只有9 5 左 右，导致葡萄糖转化率不高的原因主要有两个：其一是液化过程中淀粉 的高温回生，高温回生是指淀粉在7 5 9 5 的高温下发生的回生现象， 普通玉米淀粉在9 5 以上时则不会有高温回生现象，而玉米淀粉液化过 程中普遍使用的中温a 一淀粉酶作用温度一般在9 0 以下，这样高温回 生现象也就不可避免，由于回生以后的淀粉不能被淀粉酶水解( 马德， 2 0 0 4 ) ，从而造成葡萄糖转化率偏低；导致葡萄糖转化率不高的第二个原 因是葡萄糖淀粉酶的水解局限性，葡萄糖淀粉酶对a 一1 ，4 糖苷键分解 很快，对n 1 ，6 糖苷键却分解很慢( j e n n y l y n da j a m e s ，1 9 9 6 ) ，在 玉米淀粉中具有n i ，6 糖苷键的支链淀粉含量在7 0 以上，这就造成 了玉米淀粉在糖化过程中转化率降低。 二是液化、糖化的生产周期较长，制约了葡萄糖的生产能力。在玉 米淀粉制各结晶葡萄糖生产中，一般液化时间需要几个小时，糖化时间 则需要7 0 8 0 小时( 孙义章，2 0 0 1 ) 。这主要是由淀粉酶水解特性决定 的，a 一淀粉酶只能水解a 一1 ，4 糖苷键，因此，玉米淀粉分子中1 7 1 1 ， 6 糖菅键的存在就降低了其水解速度，同时，a 一淀粉酶对长链淀粉比短 链淀粉分解快( r a m e s hm v ，1 9 9 0 ) ，随着水解的进行，短链淀粉增加，a 一淀粉酶水解速度也必然会受到影响；葡萄糖淀粉酶虽然能水解a l ， 6 糖苷键，但水解速度很慢，葡萄糖淀粉酶的水解速度也受淀粉和糊精链 的长短影响，太长和太短的链都不利于其水解，生产中为了提高葡萄糖 产率，一般采用延长糖化时间的方法，这样就造成了生产周期较长。 三是利用一般的酶法生产葡萄糖时，蛋白质等杂质凝聚性差、糖液 过滤性差。在以往的生产中，人们只注重葡萄糖的转化率，而忽视了蛋 白质等杂质的凝聚性和糖液的过滤性。蛋白质等杂质的存在对糖化后的 过滤以及葡萄糖的结晶都会造成不良的影响，严重制约了结晶葡萄糖的 质量( 马德，2 0 0 4 ) 。葡萄糖加工过程中蛋白质等杂质的凝聚主要是在液 化阶段，糖化阶段因为温度太低很难凝聚，因此生产中应该在液化阶段 山东农业大学硕士学位论文 控制好杂质的凝聚( 陈乐仁，2 0 0 4 ) 。生产中衡量杂质的凝聚性指标主要 是透光率，透光率高则杂质凝聚好，反之，则凝聚差。 1 5 本研究主要内容 本研究拟采用新型耐高温a 一淀粉酶进行高温液化，利用新型普鲁 兰酶对n 一1 ，6 糖苷键的分解特性，协同葡萄糖淀粉酶进行糖化，以期 达到提高葡萄糖转化率，缩短生产周期，改善糖液中蛋白质等杂质的凝 聚性的目的，进而确定液化、糖化最佳工艺参数，为玉米淀粉制各结晶 葡萄糖的生产提供理论指导。 本研究主要内容包括： ( 1 ) 不同液化程度对糖化d e 值的影响研究 ( 2 ) 影响玉米淀粉液化的因素研究： ( 3 ) 玉米淀粉液化优化参数的研究及验证试验； ( 4 ) 影响玉米淀粉糖化的因素研究； ( 5 ) 玉米淀粉糖化优化参数的研究及验证试验。 新型淀糟酶在玉米淀粉制各结晶葡萄糖中的应用 2 材料与方法 2 1 试验材料 玉米淀粉：山东沂水大地玉米有限公司，一级品； 耐高温一淀粉酶s u p r a ：诺维信公司，酶活力2 0 0 0 0 u m 1 ； 葡萄糖淀粉酶：杰能科生物工程有限公司，酶活力1 0 万u m l ； 普鲁兰酶o p t i m a xl 3 0 0 ：杰能科生物工程有限公司，酶活力 2 5 0 a s p u m l 。 2 2 仪器设备 7 2 2 s 分光光度计：上海精密科学仪器有限公司； a y 2 2 0 电子分析天平：日本岛津公司； 数显恒温水浴锅：常卅i 国华电器有限公司； p h s 3 c 精密p h 计：上海雷磁仪器厂； k d m 型调温电热套：山东鄄城光明仪器厂； l x j i ib 多管离心机：上海安亭有限公司 电热恒温干燥箱：山东龙口市先科仪器厂。 2 3 主要试剂 乙酸锌分析纯天津大茂化学试剂厂 柠檬酸分析纯天津大茂化学试剂厂 磷酸氢二钠分析纯天津大茂化学试剂厂 亚铁氰化钾分析纯安徽省萧达精细化工厂 氢氧化钠分析纯天津市博迪化工有限公司 无水葡萄糖分析纯上海伯奥生物科技有限公司 可溶性淀粉分析纯莱阳经济技术开发区精细化工厂 可溶性糯米淀粉分析纯莱阳经济技术开发区精细化工厂 碘化钾分析纯天津大茂化学试剂厂 碘分析纯山东省化学研究所 盐酸分析纯莱阳经济技术开发区精细化工厂 硫酸铜分析纯天津市化学试剂三厂 酒石酸钾钠分析纯天津市化学试剂三厂 亚甲基蓝分析纯中国医药集