（生物医学工程专业论文）rbap46——一种新的肿瘤抑制基因.pdf

o u r p r e v i o u sw o r kd e m o n s t r a t e dt h a tr b a p 4 6m i g h tb ean o v e lt u m o r s u p p r e s s o rg e n et h a tf u n c t i o nt oi n h i b i ta b n o r m a lc e l lg r o w t ha n di tm a y b e i n v o l v e di nc e l l c y c l er e g u l a t i o ni nc e l l sw i t hd a m a g e dd n a w ef i n a l l y i n v e s t i g a t e dt h ee x p r e s s i o np r o f i l e so fr b a p 4 6i nc e l l st r e a t e dw i t hd n a d a m a g i n ga g e n t s a n di t sf u n c t i o n si nc e l l a p o p t o s i s i n d u c e d b y d n a d a m a g i n ga g e n t s w e h a v ef o u n dt h a t a d r i a m y c i n ( a d r ) c a p m t o t h e c i n ( c p t ) a n dg a m m a r a d i a t i o ni n d u c e ds i g n i f i c a n td e c r e a s eo f r b a p 4 6 m r n a l e v e l si nm c f - 7c e l l s t h ed o w n r e g u l a t i o no f r b a p 4 6m r n a w a sd o s e a n dt i m e d e p e n d e n t ；s i g n i f i c a n td o w n r e g u l a t i o nw a sf i r s to b s e r v e da t6h a f t e re x p o s u r et o5g ma d ro r10u mc p t g a r o m ai r r a d i a t i o ni n d u c e da d o s e - d e p e n d e n td o w n r e g u l a t i o n o fr b a p 4 6m r n a ，w h i c hq u a l i t a t i v e l y s i m i l a rt ot h a to fa d ra n dc p t t h ee x p r e s s i o np a r e mo f r b a p 4 6 i nd n a d a m a g e dc e l l s e x h i b i t e das t r o n gs i m i l a r i t yt ot h o s eo ft u m o rs u p p r e s s o r b r c a la n db r c a 2 a d ra n dc p ti n d u c e dd i s t i n c td o s e a n dt i m e d e p e n d e n ta l t e r a t i o n si ne e l lc y c l ed i s t r i b u t i o n ；b u tt h e s ea l t e r a t i o n sd i dn o t c o r r e l a t ew e l lw i t hc o r r e s p o n d i n gc h a n g e si nr b a p 4 6m r n a l e v e l s u s i n gt g 3 b c e l l s t r a n s f e c t e dw i t hr b a p 4 6e x p r e s s i o nv e c t o r ，w et e s t e d t h ee f f e c to f r b a p 4 6 o na p o p t o s i si n d u c e db ya d r i a m y c i n c o m p a r e dw i t h t g 3 bc o n t r o lc e l l s ，r b a p 4 6 e x p r e s s i n gt g 3 bc e l l se x h i b i t e dad e l a yi n a p o p t o s i s i nc e l l st r e a t e dw i t h5u ma d r t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a t r b a p 4 6m a yp l a yr o l e si nt h ec e l l u l a rr e s p o n s et od n a d a m a g i n ga g e n t s a n di nc o o r d i n a t i n gc e l lc y c l ea r r e s ta n dd n a r e p a i r i t s i n t e r a c t i o nw i t h b r c a lf u r t h e rh i 【g h l i g h t si t s i m p o r t a n c ei nm a i n t a i n i n gg e n o m i ci n t e g r i t y a n d p r e v e n t i o nf r o mt u m o r i g e n e s i s t a k e n t o g e t h e r ，t h e s e r e s u l t si n d i c a t et h a t r b a p 4 6 i sa n i m p o r t a n t p r o t e i nt h a tf u n c t i o na sat u m o rs u p p r e s s o ra n dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l e i n c e l lg r o w t h ，p r o l i f e r a t i o na n d a p o p t o s i s h o w e v e r ，t h em o l e c u l a r m e c h a n i s m b y w h i c hr b a p 4 6f u n c t i o n s d u r i n gd e v e l o p m e n tn e e d s m o r ee x t e n s i v e i n v e s t i g a t i o n k e y w o r d s ：r b a p 4 6 ；t u m o rs u p p r e s s o r ；d n ad a m a g ea n dr e p a i r ； c e l lc y c l e ；b r c a l ：a p o p t o s i s 致谢 本论文的研究和撰写工作是在尊敬的导师钱凯先教授和王兆一教授的悉 心指导下完成的，在此谨向两位导师表示深深的谢意。钱教授将我重新引入了学术研 究的大门，他渊博的学识、严谨的治学学风、献身科学的精神和接纳新生事物的态度 给我留下了深刻的印象并将激励我不断进取! 本实验研究工作是在美国哈佛大学医学 院b e t hi s r a e ld e a c o n e s s 医学中心王兆一教授的实验室完成的，王教授不仅是我专业 上的导师，也是生活中的朋友，他出众的才华，超群的智慧将是我一生学习和追求的 目标。有缘相识两位导师是我一生的荣幸! 在美国学习期间得到了tf d e u e l 教授、s o n dj h a v e r i s c h n e i d e r 博士、h a r o l d p a r i s e n 博士等美国朋友的大力支持，以及李官成博士、张腾飞博士的帮助，特别要 感谢管丽双小姐在整个研究工作中的指导和无私帮助。感谢孟琨博士为我的哈佛之 行提供了帮助。感谢浙江大学细胞与基因工程重点实验室的师兄、师姐们的关心和支 持! 感谢我的硕士导师盛志廉教授及其他哺育我成长的老师! 特别感谢杭州汇能生物技术有限公司的吕民主先生等五十余位员工，是他们为 我潜心研究创造了条件! 感谢我的岳母钟幼芳女士，她的辛勤劳动为我们解除了许多后顾之忧，衷心地 祝愿她老人家健康长寿! 感谢父母多年来的养育之恩，是他们教会我要做一个有用的人，做一个好人! 最需要感谢的是我的爱妻胡伟莲女士，感谢她长期以来对我的照顾、理解与支 持。为了我而耽误了自己的学业、事业，除包办家务外，她还经常陪我在实验室工作 到午夜。一声谢谢是远远不够的，请允许我借此机会向她表示真挚地爱! 谨以此文，献给我聪明健康漂亮的女儿旖旖、旎旎、和思思! c h a p t e ri i n t r o d u c t i o n a g e n e t i cb a s i sf o rt h ed e v e l o p m e n to fc a n c e rh a sb e e nh y p o t h e s i z e d f o rn e a r l yac e n t u r y ，a n dh a sb e e ns u p p o r t e db yf a m i l i a l ，e p i d e m i o l o g i c a l ， a n dc y t o g e n e t i cs t u d i e s o n l yi nt h ep a s t2d e c a d e s ，h o w e v e r ，h a sd e f i n i t i v e e v i d e n c eb e e no b t a i n e dt h r o u g hm o l e c u l a rg e n e t i cs t u d i e st h a tc a n c e ri sa g e n e t i cd i s e a s e ac u r r e n tv i e wi st h a tc a n c e r sa r i s et h r o u g ham u l t i s t a g eo f e v o l u t i o n a r yp r o c e s sd r i v e nb vi n h e r i t e da n ds o m a t i cm u t a t i o n so fc e l l u l a r g e n e s a n dc l o n a ls e l e c t i o no fv a r i a n tp r o g e n yw i t h i n c r e a s i n g m o r e a g g r e s s i v eg r o w t hp r o p e r t i e s t h r e e c l a s s e so fg e n e s ：p r o t o o n c o g e n e s ， t u m o rs u p p r e s s o rg e n e s ，a n dd n a r e p a i rg e n e sa r et a r g e t e db yt h em u t a t i o n s t h ev a s tm a j o r i t yo ft h em u t a t i o n st h a tc o n t r i b u t et ot h ed e v e l o p m e n ta n d b e h a v i o ro fc a n c e rc e l l sa r es o m a t i ca n da r ep r e s e n to n l yi nt h en e o p l a s t i c c e l l so ft h ep a t i e n t a l t h o u g ho n l yar e l a t i v e l ys m a l ls u b s e to fa l lm u t a t i o n s i nc a n c e rc e l l sa r ep r e s e n ti nt h eg e r ml i n eo fa f f e c t e di n d i v i d u a l ，s u c h m u t a t i o n sn o to n l yp r e d i s p o s et oc a n c e r ，b u ta l s ob ep a s s e do nt of u t u r e g e n e r a t i o n s t h e r ei s ，p r o b a b l y ，ag e n e t i cc o m p o n e n tt ot h eo r i g i no fa l lc a n c e r s m o r et h a nf i f t yf o r m so fh e r e d i t a r yc a n c e ra r ek n o w n ，s om a n y ，i nf a c t ，t h a t i th a sb e e ns u g g e s t e de v e r yc a n c e re x i s t si nb o t hah e r e d i t a r y ( g e n e t i c ) f o r m a n dan o n i n h e r i t e d ( s p o r a d i c ) f o r m ( k n u d s o n19 8 5 ) 1 g e n e t i cb a s i sf o rt u m o rd e v e l o p m e n t t h a tc a n c e ri nh u m a n sa n do t h e ra n i m a l sm i g h tb ei n h e r i t e dh a sb e e n a p p r e c i a t e df o ro v e rac e n t u r y b r o c a ，i n 18 6 6 ，d e s c r i b e daf a m i l yw i t ha h i g hp r o p o r t i o n o fm e m b e r sw h od e v e l o p e db r e a s to rl i v e rc a n c e ra n d p r o p o s e dt h a ta ni n h e r i t e da b n o r m a l i t yw i t h i nt h ea f f e c t e dt i s s u ea l l o w e d t u m o rd e v e l o p m e n t ( b r o c a 18 8 6 ) s t u d i e so fd i f f e r e n c e si nt h er a t e so f s p o n t a n e o u sm a m m a r yt u m o rf o r m a t i o na m o n gv a r i o u si n b r e ds t r a i n so f m i c el e dt ot h ep r o p o s a lb yh a a l a n dt h a tt u m o r i g e n e s i sb e h a v e di naf o r m a l s e n s ea sam e n d e l i a ng e n e t i ct r a i t ( h a a l a n d ，1911 ) s i m i l a r l y ，w a r t h i n s a n a l y s i so ft h ep e d i g r e e so fc a n c e rp a t i e n t sa tt h eu n i v e r s i t yo fm i c h i g a n h o s p i t a lb e t w e e nl8 9 5a n d19 l3i d e n t i f i e df o u rm u i t i e n e r a t i o n a lf a m i l i e s w i t hs u s c e p t i b i l i t i e st os e v e r a l s p e c i f i cc a n c e rt y p e st h a ta p p e a r e dt ob e t r a n s m i t t e da sa u t o s o m a ld o m i n a n tm e n d e l i a nt r a i t s ( w a r t h i n ，1913 ) a l t h o u g ht h e s es t u d i e ss u g g e s t e dt h a t ，i ns o m ec a s e s ，ag e n e t i cb a s i sf o r c a n c e rm i g h te x i s t ，o t h e re x p l a n a t i o n sf o rf a m i l i a lc l u s t e r i n gw e r ep o s s i b l e ， a n df u r t h e r m o r e ，i tw a sa r g u e dt h a tm o s tc a n c e r sa r o s ea ss p o r a d i c ，i s o l a t e d c a s e s ar o l ef o rs o m a t i cm u t a t i o n si nc a n c e rw a sf i r s tp r o p o s e db yb o v e r i ， w h on o t e dt h a ti ns e au r c h i ne g g sf e r t i l i z e db yt w os p e r m ，a b n o r m a lm i t o t i c d i v i s i o n sl e a d i n gt ot h el o s so fc h r o m o s o m e so c c u r r e di nd a u g h t e rc e l l s a n d a t y p i c a lt i s s u em a s s e sc o u l db es e e ni nt h er e s u l t i n gg a s t r u l a ( b o v e r i ，l9 2 9 ) h eb e l i e v e dt h a tt h e s ea b n o r m a lt i s s u e sa p p e a r e dp h y s i c a l l ys i m i l a rt ot h e p o o r l yd i f f e r e n t i a t e dt i s s u em a s s e ss e e ni nt u m o r s ，a n dh y p o t h e s i z e dt h a t c a n c e ra r o s ef r o mac e l l u l a ra b e r r a t i o nt h a tp r o d u c e da b n o r m a lm i t o t i c f i g u r e s t h i sh y p o t h e s i sa p p a r e n t l yd i dn o tg a i nf a v o ra tt h et i m e ，i n i t i a l l y b e c a u s eo ft h e1 a c ko fd i r e c te x p e r i m e n t a l s u p p o r t 开o ms t u d i e so ft h e k a r y o t y p e so fa n i m a la n dh u m a nt u m o r s ，a n dl a t e rb e c a u s eo fu n c e r t a i n t y a b o u tw h e t h e rt h ec h a n g e si nc h r o m o s o m en u m b e ri nt u m o rw e r eac a u s eo r a l le f f e c to ft h en e o p l a s t i cp h e n o t y p e al a n d m a r ko b s e r v a t i o ni nt h ei d e n t i f i c a t i o no fag e n e t i cb a s i sf o r c a n c e rw a sr e p o r t e db yr o u si n1911 ，w h e nh es h o w e dt h a ts a r c o m ac o u l d b ei n d u c e di nc h i c k e n sb yc e l l f r e ef i l t r a t e so fas a r c o m at h a ta r o s e s p o n t a n e o u s l y i nac h i c k e n ( r o u s ，1911 ) a l t h o u g ht h i so b s e r v a t i o n f u r n i s h e ds t r o n ge v i d e n c et h a tn e o p l a s m sc o u l db ev i r a l l yi n d u c e d ，i ta l s o p r o v i d e ds u p p o r tf o rt h ep r o p o s a lt h a tc a n c e rc o u l db ea t t r i b u t e dt od i s c r e t e g e n e t i ce l e m e n t s s i x t yy e a r sa f t e rr o u s i n i t i a lr e p o r t ，t h eo n c o g e n i cr e g i o n 2 o ft h er o u ss a r c o m av i r u sw a si d e n t i f i e d ，a n df u r t h e rc h a r a c t e r i z a t i o na n d c l o n i n go ft h i sr e g i o nd e m o n s t r a t e dt h a tt h eo n c o g e n i c i t yo ft h ev i r u sw a s d e p e n d e n to nv s r c ，at r a n s d u c e dc e l l u l a rg e n e ( m a r t i n ，19 7 0 ；s t e h l i n ，19 7 6 ； b i s h o p 19 8 5 ) s u b s e q u e n t l y ，a l lo n c o g e n e so fa c u t e l yt r a n s f o r m i n gr n a t u m o rv i r u s e sh a v e ，i nf a c t ，b e e nf o u n dt ob et r a n s d u c e dc e l l u l a rg e n e s ( t h e p r o t o o n c o g e n e s ；v a r m u s ，19 8 4 ；b i s h o p 19 8 5 ) w h i l et h eb i o c h e m i c a l m e c h a n i s m sb yw h i c hm o s tv i r a lo n c o g e n e sc a u s en e o p l a s t i ct r a n s f o r m a t i o n s t i l la r en o t p r e c i s e l yd e f i n e d ，t h e v i r a l o n c o g e n e sa p p e a r t oc a u s e t r a n s f o r m a t i o nb e c a u s e t h e y a r em u t a t e dv e r s i o n so fc e l l u l a rp r o t o o n c o g e n e s a n d o ra r e e x p r e s s e da b e r r a n t l y i n h u m a nc a n c e r s ，s o m a t i c m u t a t i o n sg e n e r a t eo n c o g e n i ca l l e l e s ( b i s h o p19 8 7 ；19 91 ；w e i n b e r g ，19 8 9 ) n e a r l y10 0p r o t o o n c o g e n e sh a v eb e e nd i s c o v e r e di nm a m m a l s ，m a n yb y a n a l y s i so fc h r o m o s o m a la b e r r a t i o n si nt u m o r so rc e l ll i n e s n e v e r t h e l e s s ，d e s p i t et h es i g n i f i c a n c eo fo n c o g e n e si nt h eg e n e s i so f m a n yd i f f e r e n th u m a nt u m o rt y p e s ，m a n yo ft h ep r o p e r t i e s o fn e o p l a s t i c c e l l s ，i n c l u d i n gi m m o r t a l i t ya n dt u m o r i g e n i c i t y ，a p p e a rt o r e s u l tf r o mt h e i n a c t i v a t i o no rl o s so ff u n c t i o no fn o r m a lc e l l u l a rg e n e s ( s a g e r ，19 8 6 ； s t a n b r i d g e ，19 8 2 ；19 8 9 ) t h e s ec e l l u l a rg e n e s ，h y p o t h e s i z e d t o r e g u l a t e c e l l u l a rp r o l i f e r a t i o na n dg r o w t hi nan e g a t i v ef a s h i o n ，h a v eb e e nt e r m e d t u m o rs u p p r e s s o rg e n e s 2 t u m o rs u p p r e s s o rg e n e s t u m o rs u p p r e s s o rg e n e s ( t sg e n e s ) a r eg e n e sw h o s ep r o t e i np r o d u c t s f u n c t i o ni nt h ec o n t r o lo fc e l l u l a rp r o l i f e r a t i o n ( f i g1 1 ：a c t i o no ft sg e n e s ) i nc o n t r a s tt o o n c o g e n i c a l l e l e sh a r b o r a c t i v a t i n gm u t a t i o n s ，t u m o r s u p p r e s s o rg e n e sa r ei n a c t i v a t e di nh u m a nc a n c e r ( b i s h o p19 91 ) o n c o g e n e s s t i m u l a t ec e l ld i v i s i o na n dt u m o rd e v e l o p m e n t ，a n dt sg e n e sn o r m a l l ya c tt o i n h i b i tt h e s ep r o c e s s e s i fo n c o g e n e sa r ev i e w e da sg a sp e d a l s ，a c t i n gt o a c c e l e r a t et h eg r o w t ho fc a n c e rc e l l s ，t sg e n e sc a r lb ev i e w e da sb r a k e s ， a c t i n gt os l o wd o w nc e l lg r o w t h i nm a n yt u m o r s ，m u t a t i o n sl e a dt ot h el o s s o ri n a c t i v a t i o no ft sg e n e s ，t h e r e b ye l i m i n a t i n gt h e i n h i b i t o r so fc e l l d r o l i f e r a t i o n t h ef o r m a t i o no fo n c o g e n e sa n dt h ei n a c t i v a t i o no ft sg e n e s 3 t h u sr e p r e s e n tc o m p l e m e n t a r ye v e n t si nt h e d e v e l o p m e n to fc a n c e r ，b o t h c o n t r i b u t i n gt oi n c r e a s e dc e l ld i v i s i o na n dl o s so f n o r m a lg r o w t hc o n t r 0 1 c e t d i v i s i o n1 n h i b i t e d f i g u r e 1 1a c t i o no ft u m o r s u p p r e s s o rg e n e s a g r o w t h i n h i b i t o r yf a c t o rb i n d s t oac e l l s u r f a c er e c e p t o ra n ds t i m u l a t e st h e a c t i v i t yo fat u m o rs u p p r e s s o r ( r s l g e n ep r o d u c t t h et sg e n ep r o d u c t t h e na c t st ob l o c kc e l lp r o l i f e r a t i o n t sg e n e sw e r ed i s c o v e r e dm o r er e c e n t l yt h a no n c o g e n e s ，s os c i e n t i s t s c u r r e n t l yk n o wl e s sa b o u tt h e m h o w e v e r ，a b o u tad o z e no ft sg e n e sn o w a p p e a rt ob ei n v o l v e di nh u m a nc a n c e r s a n ds i n c et h i si sav e r ya c t i v ea r e a o fr e s e a r c h ，n e wt sg e n e sa r er a p i d l yb e i n gi d e n t i f i e da n da n a l y z e d a tl e a s t s o m eo ft h e s eg e n e sn o r m a l l ya c ti nt h er e g u l a t o r yp a t h w a y st h a ti n h i b i tc e l l p r o l i f e r a t i o n a sw ek n o w ，n o r m a lc e l l sa r er e g u l a t e db ys i g n a l st h a ti n h i b i t a sw e l la ss t i m u l a t et h e i rg r o w t h ，a n di t a p p e a r st h a tt sg e n e sm a yb e i n v o l v e di ns u c hg r o w t hi n h i b i t o r ys i g n a l i n gm e c h a n i s m s t h ei n a c t i v a t i o n o ft h e s eg e n e st h e r e f o r el e a d st ot h ef a i l u r eo fac e l lt or e s p o n dt og r o w t h i n h i b i t o r ys i g n a l s ，r e s u l t i n g ，l i k et h ea c t i o no fo n c o g e n e s ，i nu n c o n t r o l l e d c e l ld i v i s i o n a c c o r d i n gt ot h ek n u d s o n “t w o h i t t sg e n em o d e l w h i c hw a s i n i t i a l l yp r o p o s e d t o e x p l a i n t h eo c c u r r e n c eo ff a m i l i a la n d s p o r a d i c r e t i n o b l a s t o m a ( k n u d s o n ，19 71 ) ，i n a c t i v a t i n gm u t a t i o n si nb o t ha l l e l e so fa t sg e n ea r er e q u i r e dt og i v eac e l lag r o w t ha d v a n t a g er f i g 1 2 ：m u t a t i o n s i nb o t ha l l e l e so fat sg e n el e a dt ot u m o rt r a n s f o r m a t i o na n du n c o n t r o l l e d j c e l l g r o w t h ) i na ni n h e r i t e dc a n c e rp r e d i s p o s i t i o ns y n d r o m e ，t h ef i r s t i n a c t i v a t i n gm u t a t i o n ( ip ，t h e f i r s th i t ) o c c u r si ng e r m 1 i n ed n aa n dt h e m u t a t i o ni nt h er e m a i n i n gw i l d t y p ec o p yo ft h eg e n e ( i e ，t h es e c o n dh i t ) o c c u r ss o m a t i c a l l y t h u s ，ap a t i e n tw i t hac a n c e rp r e d i s p o s i t i o ns y n d r o m e w h od e v e l o p sm u l t i p l et u m o r sw o u l db ep r e d i c t e dt oh a v ed i f f e r e n ts e c o n d h i tm u t a t i o n si ne a c ht u m o r i nc a n c e r sa r i s i n gs p o r a d i c a l l y ，b o t ht h ef i r s t a n dt h es e c o n dh i t so c c u rs o m a t i c a l l y f i g u r e1 2m u t a t i o n si nb o t ha l l e l e so fat u m o rs u p p r e s s o rg e n e ( t s g ) l e a dt o n e o p l a s t i ct r a n s f o r m a t i o na n du n c o n t r o l l e dc e l lg r o w t h a n o r m a lc e l lh a st w oc o p i e so fat s g a f t e rm u t a t i o no c c u r si nb o t h a l l e l e s ，l o s so ft s gf u n c t i o nc o n t r i b u t e st ou n r e s t r a i n e dc e l lg r o w t h 2 1p r o p e r t i e so ft u m o rs u p p r e s s o rg e n e s m o s tt sg e n e sh a v et h r e ep r o p e r t i e si nc o m m o n ：( 1 ) t h e ya r em u t a t e d i ni n h e r i t e dc a n c e rp r e d i s p o s i t i o ns y n d r o m e s f 2 1s o m a t i cm u t a t i o n sa r e f o u n di ns p o n t a n e o u st u m o r s ，o f t e no ft h es a m ep a t h o l o g i ct y p e st h a to c c u r i nt h ea s s o c i a t e di n h e r i t e ds y n d r o m e ( 3 ) t h e ya r ea b l et oi n h i b i tt h eg r o w t h o ft r a n s f o r m e dc e l l si nv i t r o t h e r ei s ，h o w e v e r ，n os i n g l ed e f i n i t i o no fw h a t c o n s t i t u t e sat sg e n e s o m ea u t h o r sf e e lt h a tt sg e n e ss h o u l dm e e ta l lt h r e e o ft h e s ec r i t e r i a ( c l u r m a n ，19 9 7 ) o t h e r sp r e f e rm o r es i m p l ed e f i n i t i o n ss u c h a s “g e n e st h a ts u s t a i nl o s s o f - f u n c t i o n m u t a t i o n si nt h ed e v e l o p m e n to f c a n c e r ”( h a b e r ，19 9 7 ) o r “g e n e sw h o s ee x p r e s s i o n i sr e d u c e do