（分析化学专业论文）纳米微粒固载抗体蛋白构建高灵敏电流型免疫传感器的研究.pdf

摘要 纳米微粒固载抗体蛋白构建高灵敏电流 型免疫传感器的研究 分析化学专业博士研究生洪成林 指导教师 摘 袁若教授 要 发展高灵敏的免疫分析技术一直是免疫分析领域研究的一个重要方面，它对 于实现一些重要疾病标志物的检测有着至关重要的意义。电化学仪器具有简便、 灵敏、易于微型化和集成化等优点，电化学仪器被广泛研究并已在生物检测中逐 步得到应用。电化学免疫传感器利用抗原和抗体间的高度特异性结合，将传统的 免疫测试方法与近代生物传感技术融为一体，该技术既具有免疫反应的高选择性 又兼有电化学分析的高灵敏性，被广泛应用于临床诊断领域。纳米生物技术是纳 米技术与生物技术交叉渗透形成的新技术，是生物医学领域的一个重要发展方向。 纳米粒子特别是壳核型纳米粒子具有优良的电学、磁学、光学性质以及优越的生 物相容性，可用于固定抗体，在免疫分析中已得到广泛的应用。 本论文将纳米技术、生物传感技术和电化学分析技术结合用于免疫分析。应 用碳纳米管、纳米金、纳米二氧化钛、掺杂纳米二氧化硅以及壳核型普鲁士蓝等 纳米材料，采用不同方法在金电极表面构建功能化生物分子固定界面，制各了一 系列高灵敏的电化学免疫传感器；用扫描电镜( s e m ) 、透射电镜( t e m ) 、光谱技 术、电化学分析技术对电极的组装过程、功能界面进行了表征；探讨了其在生物 分析方面的应用。本文开展了如下工作： 1 采用反向微乳液法，合成出羧酸二茂铁掺杂的s i 0 2 新型纳米粒子，将制得的纳 米粒子表面氨基化后，通过简单的戊二醛连接反应固定癌抗体1 5 3 ( a n t i c a l 5 3 ) 的方法来构建免疫传感器。该电流型免疫传感器不仅生物相容性 好，固定抗体也简单方便。制备的传感器中，羧酸二茂铁掺杂s i 0 2 纳米粒子可 以直接给出电信号，经透射电镜( t e m ) 和x 射线电子能谱( x p s ) 表征，羧酸二 茂铁掺杂在s i 0 2 的s i o - s i 组成的笼中，不易泄漏。该传感器在寿命和灵敏度方 面显示出优势。线性范围2 0 - - - 2 4 0u m l ，检出限o 6 4u m l ( s n = 3 ) 。 2 制备出牛血清白蛋白( b s a ) 包覆的普鲁士蓝( p b ) 纳米粒子，再修饰一层 西南大学博士学位论文 金纳米粒子。该壳核型纳米粒子有三层结构。b s a 包覆p b 纳米粒子有以下 优点：( 1 ) b s a 可以保护p b 纳米粒子，防止其聚集；( 2 ) b s a 不仅生物相 容性优于其它材料，而且由于b s a 具有多个氨基和巯基，可以更加方便的在 其外部修饰另一层金纳米粒子；( 3 ) 内部的p b 具有电化学活性，而经b s a 包覆后不易流失。分布在外表面大量的金纳米粒子不仅具有较大的比表面积， 可以吸附更多抗体，而且使电子传输效率增强，同时纳米金还容易牢固的吸附 生物分子。以此纳米粒子固定a f p 抗体，成功构建了高灵敏的电流型a f p 免 疫传感器。该免疫传感器线性范围为0 0 2 2 0 0 0n g m l ，检出限0 0 0 6n g m l ( 胖3 ) 。 3 首次提出硫堇共价键合花四甲酸，键合产物再与纳米t i 0 2 形成有机无机纳米 复合膜。t i 0 2 成膜能力好，在金电极表面形成大的比表面，有利于增加甲胎 蛋白( a f p ) 抗体在电极表面的固载量。同时，硫堇共价键合花四甲酸的产物 具有电活性，电子传输能力强，其氨基利于结合纳米金，从而构建出生物相容 性好的a f p 抗体固载界面。用该方法制得的免疫传感器线性范围为2 5 , - - 2 0 0 0 n g m l ，检出限o 5n g m l ( s n = 3 ) 。 4 利用茈四甲酸酐与1 ，3 丙二胺的胺解产物、邻苯二胺、变价过渡金属离子c 0 2 + 制备了新型具有电化学活性的物质，该物质电子传输性能好，电极反应可逆， 可以作为电化学活性探针使用，而且因其含有很多氨基，便于进步结合纳米 金。本研究使用碳纳米管与制备的电化学活性物质共同修饰金电极，形成比表 面积大、吸附性能强且具有高导电能力的纳米粒子层，利用纳米金能与氨基 2 ) 共价键合的特点在电活性物质上固定纳米金，又以纳米金固定a f p 抗体 制备出a f p 免疫传感器，该传感器稳定性好，线性范围0 2 0 - - 1 2 0n g m l ，检测 限为o 1 , 2n g m l ( s n = - 3 ) 。 5 采用酶标记的生物素一亲和素生物反应放大系统，并结合纳米铂对h 2 0 2 的催化 作用构建了信号放大的新型电化学免疫传感器。首先在电极上修饰一层纳米金 掺杂的碳纳米管后，固定亲和素，然后利用生物素一亲和素反应固定生物素标 记的a f p 抗体，从而制得a f p 免疫传感器。采用双抗体夹心分析模式测定，将 生物素标记的二抗蛋白结合到免疫复合物上，再通过亲和素一生物素的高特异和 高亲合力作用，夹心免疫反应后的电极表面将捕获标记有辣根过氧化物酶( h r p ) 标记的亲和素与铂纳米颗粒的复合物。为了最大程度获得电化学信号，再次利 用具有多结合位点的亲和素与标记h r p 的生物素结合，以进一步增加h r p 的固 载量。在h r p 底物h 2 0 2 的存在下可以得到铂纳米颗粒h r p 复合物共同作用底物 产生的催化放大电流信号；并且由于电极界面纳米金掺杂的碳纳米管的修饰， 摘要 在增加电极比表面积，改善电极表面与生物分子之间的电子传输能力的同时还 能有效降低h r p 的氧化还原过电位，而且使免疫电极表面生物相容性更加优 异；生物素与亲和素之间具有高度亲和力，抗体分子经生物素化后，其结合抗 原的活性不受影响，酶生物素化后，其催化活性基本保持不变。该免疫传感器 将铂纳米粒子和h r p 的催化放大作用有机结合，能有效放大响应电流信号，显 著提高灵敏度。用该方法制得的a f p 免疫传感器线性范围为0 2 5 1 0 0 0n g m l ， 检出限0 1n g m l ( s n = 3 ) 。 关键词：免疫传感器甲胎蛋白纳米金掺杂纳米二氧化硅信号放大 a b s t r a c t s t u d y o nt h e h i g h l ys e n s i t i v ea m p e r o m e t r i c i m m u n o s e n s o rb a s e do nb i o m o l e c u l e i m m o b i l i z e do n n a n o p a r t i c l e s s p e c i a l i t y ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r yg r a d u a t e ：c h e n g l i nh o n g s u p e r v i s o r ：p r o f r u oy u a n a b s t r a c t d e v e l o p i n go fs e n s i t i v ei m m u n o a s s a yt e c h n o l o g yi so n eo ft h ei m p o r t a n tt a s k si n i m m u n o a s s a y , w h i c hi s c r u c i a lf o rr e a l i z i n gt h ed e t e c t i o no fs o m ev i t a ld i s e a s e s e l e c t r o c h e m i c a la p p a r a t u sa r es i m p l e ，s e n s i t i v ea n de a s yt ob em i n i a t u r i z e d s oi t a t t r a c t e ds u b s t a n t i a lr e s e a r c ha n dh a sb e e nw i d e l yu s e df o rt h ea s s a yo fb i o l o g i c a l a n a l y t e s t h ee l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o ru s e ss p e c i f i c i t yo ft h er e a c t i o no fa n t i g e n a n da n t i b o d yt oc o m b i n et r a d i t i o n a lm e t h o df o ri m m u n o a s s a yw i t ht h et e c h n o l o g yo f m o d e r ns e n s o r , w h i c hb o t hh a st h eh i 曲s p e c i f i c i t yo ft h ei m m u n o c h e m i c a ls y s t e ma n d h a st h eh i g hs e n s i t i v i t yo fe l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i sa n dh a sb e e nb r o a d l ya p p l i e di n c l i n i c a ld i a g n o s i s n a n o p a r t i c l e sh a v e e x c e l l e n tp r o p e r t i e si n e l e c t r i c i t y , m a g n e t i s m ，o p t i c sa n d p r e d o m i n a n tb i o c o m p a t i b i l i t y , i tc a nb eu s e da sap l a t f o r mt oi m m o b i l i z ea n t i b o d i e sb y a d s o r p t i o n ，e s p e c i a l l yc o r e s h e l ln a n o p a r t i c l e sw h i c he x e r tc r u c i a lf u n c t i o n si nt h e f i e l d so fb i o c h e m i c a li m m u n o a n a l y s i s t h i sd i s s e r t a t i o nf o c u s e so nd e s i g n i n ga n df a b r i c a t i n gn o v e lb i o m i m e t i ci n t e r f a c e c o m b i n i n gs o m ek i n d so fn a n o p a r t i c l e sw i t hb i f u n c t i o n a lc a r b o nn a n o t u b e s ，d o p e d t i t a n i a c o l l o i d s ，c o r e s h e l ln a n o - p r u s s i a n ，d o p e ds i l i c an a n o p a r t i c l e s ，a n d g o l d n a n o p a r t i c l e sf o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e s t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p y , s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y , a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y , u v - v i ss p e c t r a a n de l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e sa r eu s e d 弱t o o l sf o r s t u d y i n gt h ep r o p e r t i e so f i n t e r f a c e w ed i s c u s s e dt h e i ra p p l i c a t i o n si nb i o a n a l y s i sd o m a i n t h i sr e s e a r c hf o c u s e s o nt h ed e t a i l sa sf o l l o w ： i i nt h i sw o r k ，aw a t e r - i n o i lm i c r o e m u l s i o nm e t h o dw a su s e dt o d e v e l o p f e r r o c e n e c a r b o x y l i c - - d o p e ds i 0 2n a n o p a r t i c l e s ( f c - - c o o h d o p e ds n p s ) i nw h i c h v 两南大学博士学位论文 t h ef c c o o hw e r eh o m o g e n e o u s l yd i s p e r s e da n dt i g h t l yc a p t u r e d i na t h r e e d i m e n s i o n a lc a g eo ft h es i l i c an e t w o r k t h e n ，t h es u r f a c eo ff c c o o h d o p e d s n p sw e r ef u n c t i o n a l i z e dw i t ha m i n og r o u p sb y3 - 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s h e l l s h e l l n a n o p a r t i c l eo f f e rs o m ea d v a n t a g e sa sf o l l o w s ：( 1 ) p r o t e c t i n gt h ep bn p sf r o m a g g l o m e r a t i o n i nas t a b l e a q u e o u ss u s p e n s i o n ；( 2 ) p r o v i d i n g b i o a c t i v e f u n c t i o n a l i t i e s t h r o u g h o u t t h e n a n o p a r t i c l e s u r f a c ef o rf u r t h e r b i o l o g i c a l i n t e r a c t i o n so rc o u p l i n g s ( w i t ha n t i b o d i e s ，f o re x a m p l e ) ( 3 ) t h eo u t e rl a y e ro fg o l d c o l l o i d sm a yi m p r o v et h ee l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t ya n db i o c o m p a t i b i l i t yb e c a u s e t h en a n o a up o s s e s s e dh i ：g hs u r f a c e t o - v o l u m er a t i oa n dg o o db i o c o m p a t i b i l i t y t h ef a b r i c a t i o np r o c e d u r e so ft h ei m m u n o s e n s o ri ss i m p l i c i t y u n d e ro p t i m a l c o n d i t i o n s ，t h ep r o p o s e di m r n u n o s e n s o re x h i b i t e dh i g hs e n s i t i v i t ya n daw i d el i n e a r r a n g ef r o m0 0 2t o2 0 0 0n 舢t o w a r d sa f p w i t had e t e c t i o nl i m i to fo 0 0 6 n g m l ( s n = 3 ) 3 an e we l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e c t i o no fa 一1 一f e t o p r o t i e n ( a f p ) w a sd e v e l o p e db a s e do na f pa n t i b o d y ( a n t i a f p ) 一f u n c t i o n a l i z e do r g a n i c i n o r g a n i c h y b r i dn a n o - 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- 12 0n g m la n dad e t e c t i o n l i m i to f0 12n g m l ( 彤= 3 ) 5 w eh a v es u c c e s s f u l l yd e v e l o p e das e n s i t i v i t yo fa m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o r b a s e do na v i d i n - b i o t i ni m m o b i l i z a t i o na n da m p e r o m e t r i cs i g n a l sa m p l i f i e db y a v i d i n - l a b e l e dh r p f u n c t i o n a l i z e dp tn a n o p a r t i c l e sa n da m p l i f i e da g a i nb yh r p t h es a n d w i c h t y p ee l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e c t i o no fa f p u s i n g e n z y m em u l t i l a y e r sa n dp tn a n o p a r t i c l e s ( p t n p s ) o na v i d i nt h a ta s s o c i a t e dw i t ht h e n a n o h y b r i d f i l mo f g o l dn a n o p a r t i c l e s m u l t i - w a l l c a r b o nn a n o t u b e s ( a u n p m w c n t s ) m o d i f i e d e l e c t r o d ei s p r e s e n t e d t h e d e t e c t i o no f c t 一1 一f e t o p r o t e i n ( a f p ) i m m u n o l o g i c a l r e a c t i o ni sb a s e do nd u a l s i g n a l a m p l i f i c a t i o n ：( 1 ) al a r g ea m o u n to fh r pi n t r o d u c e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c e t h r o u g ha v i d i n - l a b e l e dh r p f u n c t i o n a l i z e dp t n p s ( 2 ) h 2 0 2a n db i o t i n l a b e l e d h r pi n d u c e dc m a l ”i co x i d a t i o n ，w h i c hr e s u l t si ng r e a te n h a n c e m e n to fc u r r e n t r e s p o n s e t h ei m m o b i l i z a t i o no fa n t i a f pi sa c c o m p l i s h e db y a v i d i n b i o t i n v l i 两南大学博十学位论文 i i i m m o b i l i z a t i o nt e c h n i q u e ，i to f f e r sv a r i o u sa d v a n t a g e ss u c ha s i ti se x t r e m e l v s p e c i f i ca n ds t r o n gn o n c o v a l e n tb i n d i n gm e t h o d ；t h ea v i d i n b i o t i ni m m o b i l i z a t i o n p r o c e d u r eg e n e r a l l ym a i n t a i n sb i o r e c e p t o rb i n d i n ga c t i v i t ym o r es u c c e s s f u l l yt h a t o t h e rr e g u l a rm e t h o d s a tt h es a m et i m e ，t h en a n o h y b r i df i l ma u n p m w c n t s c a l l i m p r o v et h er e s p o n s et ot h en m n u n o s e n s o r sd u et oi t sh i g h e re x p o s e ds u r f a c ea r e a , f a c i l i t a t e dt oe l e c t r o nt r a n s f e ra n de x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t y t h ed e t e c t i o nl i m i t f o ra f pi sf o u n dt ob eo 1n g m la t 腓3a n dt h ed e t e c t i o nc o n c e n t r a t i o nr a n g e i sf r o m0 2 5t o1 0 0n g m l k e y w o r d s ：i m m u n o s e n s o r a - 1 - f e t o p r o t i e n g o l dn a n o p a r t i e l e d o p e ds i 0 2 n a n o p a r t i c l e ss i g n a l sa m p l i f y v i i i 独创性声明 学位论文题目：纳鲞丝垫圈塑垫签堡鱼塑壅高曩塾垫速型鱼瘗堡盛墨 鱼塑壅 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中己加 了标注。 学位论文作者：澎姣希卜 签字日期： 芝刃夕年年月彳日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：谚嘁率礼 签字日期：五珍7 年乒月彩日 导师签名： 签字日期：彦叩年垂月 1 7 黾 多 陟 第一章综述 第一章综述 1 1 传感器技术概述 传感器是能将温度、光、辐射、化学或生物反应转换为可被测量信号的装置。 通常主要由两部分组成：感受器；换能放大装置。感受器感知温度、光、化学或 生物反应等物理或化学变化，换附放大装置将感知的信号转换为电、声、光等信 号。 。镧嗡囡l 寄篓冬 hi 圈 | jj 豆 r 堕璺j i i 誊 f i g t u cl 1s c h e m a t i cd l a g r a n ls h o w i n g t h e m a r e c o m 咖e n bo f a b i o s e r “o r ( t e p r o d u c c d f r o m r c f l 【1 ) 图11 传摩器结构 生物传感器是将生物技术和微电子技术结合利用生物识别反应进行定量或 半定量分析的装置，是基于生物活性物质为感受物质的生物传感器。其核心部件 为生物识别物质( 如：酶、抗原抗体、激素受体、双链d n a 等) 口“。生物识 别物质在复杂体系中起到选择性( 或称特异性) 结合被测物的作用，这种结合提 供有关浓度的信息。换能做大装置将这种信息转换成可供检测的化学或物理信号。 生物传感器的换能放大装置多种多样；电化学装置、光学装置、压电装置和表面 声能装置等1 2 , 4 。s 】。因此生物传感器也有很多种。 生物识别物质可以粘附在换能器的表面或嵌入换能器的内部1 6 】，可以利用一 些官能团键合于换能器上，还可以物理吸附在换能器上。将生物活性物质附着在 换能器上称为生物物质的固定。 灵敏度、选择性和稳定性是生物传感器的重要性能指标。生物识别物质虽然 提供了较高的选择性，但生物识别物质同时对温度、胡和离子强度敏感，容易失 活( 在细胞液罩，酶、抗体等大约五天) i ”。因此，寻找生物相容性好的固定摹质 ( 固定界面) 来防止生物识别物质失活是一项重要研究内容。 1 2 生物传感器的分类 目前生物传感器主要按生物敏感物质和信号转换装置两种方式分类。 ( 1 ) 根据生物传感器中的敏感物质分类。生物传感器与其它传感器的最大区别 在于生物传感器的信号检测中含有敏感的生物物质。根据敏感物质的不同生物 垩雪奎耋璺老：篓耋蚤 传感器可分酶传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞器侍感器、免疫传感器、 d n a 传感器等n ( 2 ) 根据生物传感嚣的信号转换装置分类。生物传感器可以利用电化学电极、 场效应晶体管、热敏电阻、光电器件、声学装置等作为生物传感器中的信号转换 器。因此，又将生物传感器分为电化学生物传感器、测光型生物传感器、测声型 生物传感器等。 电化学生物传感器是目前研究与应用比较成熟的生物传感器。它包括电位 型、电流型、电导型和电容型等生物传感器。 - - - m 凡1 一，* j “ f i g u m1 2 p m k o f t h e a m p e r o m c u i c b i o s c n r 图1 0 电流型传盛器 光学生物传感器以光学信号变化量为测定信息，由于可利用的光学信号很多， 包括光吸收、反射、散射、荧光、磷光、化学发光、表面等离子体共振等，所以t 光学生物传感器具体类别很多，可大致包括荧光标记生物传感器、化学发光生物 传感器、电致光学生物传感器等。m a x w e l l 9 等人在寡核甘酸探针分子的两端分别 n u l + _ 一 t 蝣l f i g u r e l 3p r i n c i p l eo f t h e h u o r e s c e n c e b i o s e n s o r 匣13 荧光型生物传畦器原理 标记纳米金颗粒和荧光激发基团，探针由于碱基互补形成“发卡”结构，荧光激 鑫 b 一 矗 第一章综述 发基团和纳米金颗粒靠近，引起激发荧光湮灭；而当探针与特异性靶d n a 结合后， 其构象发生变化，纳米金颗粒和荧光激发基团分离，从而激发出荧光。该原理可 用于核酸的实时荧光检测，以及单碱基突变多态性检测等 t o l 。 表面等离子体共振即s p r i n 1 4 l 。s p r 主要由光波导耦合器件、金属膜、生物分 子膜等组成。用光纤作为光波导耦合元件的s p r 生物传感器是将一段光纤中的一部 分外包层剥去，在光纤芯上沉积一层高反射率金属膜，入射光线在光纤芯与光纤 包层的界面上发生全反射，渗透过界面的消失波将在金属膜与生物分子膜的界面 产生s p r ，s p r 对吸附在金属膜表面的基质( 生物分子膜) 的折射率变化非常敏感， 从而引起等离子共振角( 入射角) 的改变。固定入射光角度，改变入射光波长，在光 纤的出口端检测输出光强度与波长分布的关系，可进行被测物的定量分析。s p r 生物传感器具有非破坏性，高灵敏度和实时在线检测等优点。 盟逍盟皇里 夏天嘉天 f w 。 ! r ( 。 f i g u t e l4 p r i n c i p l e o f t h es u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e b i o s e m o r 图14 表面等离子体共振生物传感器原理 声波生物传感器，其原理如图15 。声波生物传感器是检测待检测物质引起声 波频率改变的传感器。其中，研究最多的是石英晶体微天平( q u a r t zc r y s t a j m i c r o b a l a n e e ，q c m l 生物传感器。在晶体的两面采用离子束沉积等方法形成两个平 行金属( a u a g ，p t ，n i ，p d 等) 膜电极( 如图1 6 所示) 。膜电极的表面固定识别 分子，识别分子因其有特异性而结合待检测分子引起电极表面的质量变化，从 而改变石英晶体的振荡频率。如果在待检测分于上修饰纳米颗粒，会显著提高待 检测分子的质量，0 检测信号也随之增强。w a r d l l5 1 等人用纳米胶颗粒标记抗体， 通过抗体一抗原免疫方法将其结合到石英晶体表面由于修饰胶体颗粒( 溶胶颗粒 西南大学博士学位论文 的直径在s 1 0 0 n m ) 提高了标记分子的质量，石英晶体的振荡频率也相应得以提高， 因而检测信号被放大，检测灵敏度提高，检测下限降低。 r c f i g u r e1 5p r i n t i d eo f t h es u r f a c ea c o u s t i