（发酵工程专业论文）lactobacillus+kefiranofaciens发酵法生产开菲尔多糖.pdf

摘要 摘要 开菲尔多糖( k e f i r a n ) 是由一种特殊发酵乳一开菲尔( k e f i r ) 的发酵剂一开菲尔 粒( k e f i rg r i n ) 产生的乳酸菌胞外多糖。k e f t r a n 作为一种新型的活性多糖，不仅可 以作为增稠剂、稳定剂、乳化剂和凝胶剂，而且具有抗真菌、抗细菌、降压、降 血糖、降胆固醇和抗肿瘤的特性，是一种很好的消炎降压及免疫激活物质，在临 床医药、食品工业及有关生物研究领域都有着广泛的用途。 本论文在实验室规模上以一株能在胞外高积累k e f i r a n 的开菲尔基质乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sk e f i r a n o f a c i e n sj c m 6 9 8 5 1 ) 为生产菌株，以细胞和k e f i r a n 的高产量， 高得率和高生产强度为目标，对k e f i r a n 发酵过程进行了优化。主要研究结果如下： ( 1 ) 优化得到了摇瓶条件下k e f r i a n 生产的最优碳氮源种类及浓度：碳源为1 0 0g l 蔗糖，氮源为1 0 0g l 酵母粉。 ( 2 ) 不同p h 控制方式对k e f i r a n 分批发酵的影响有较大差异。通过对p h4 0 - 5 5 范围内k e f i r a n 分批发酵的各过程参数进行比较，确定k e f t r a n 分批发酵最适宜p h 为5 0 。 ( 3 ) 考察不同温度条件下k e f i r a n 分批发酵过程，并在深入分析各动力学参数的基 础上提出两阶段温度控制策略：发酵起始控制温度3 3 0 c ，发酵1 0h 后切换至2 8 0 c 并保持到发酵结束。该温度控制策略的实施可进一步提高k e f i r a n 的合成能力，比 温度控制在2 8 0 c 和3 3 0 c 时分别提高了1 2 和4 6 ，其生产强度比2 8 0 c 和3 3 0 c 分别提高了3 6 和3 3 。具有很好的实用性。 ( 4 ) 考察不同初糖浓度下k e f t r a n 分批发酵过程，发现仅通过分批培养难以实现细 胞和k e f i r a n 高产量，高得率和高生产强度的有机统一。分批补料、恒速流加和指 数流加等几种培养方式都可以实现乳酸菌细胞和k e f i r a n 的高产。综合比较来看， 4 欧l h ) 的蔗糖恒速流加方式下l k e f i r a n o f a c i e n s 细胞干重6 3 6g l ，k e f i r a n 产量 4 9 5g l ，比较适合k e f i r a n 的发酵生产。 ( 5 ) 为降低乳酸菌发酵过程中乳酸对菌体生长和产物合成的抑制作用，考察了乳 酸菌与酵母菌共培养对k e f i r a n 发酵的影响，其中三k e f i r a n o f a c i e n s 与& c e r e v i s i a e 好氧共培养合成k e f i r a n ，使k e f i r a n 发酵强度达到9 4 1 9m g ( l h ) ，比单菌厌氧培 养提高了5 3 7 ；lk e f i r a n o f a c i e n s 与cu t i l i s 好氧共培养合成k e f i r a n 使k e f i r a n 江南大学硕士学位论文 发酵强度达到8 6 4 4m g ( l h ) ，比单菌厌氧培养提高了4 1 1 ，并且产生了2 5 0m g l 的g s h 。采用这种共培养方式不仅可以降低乳酸菌发酵过程中乳酸对菌体生长和 产物合成的抑制而且可以合成高附加值的共同产物，对其他终端产物抑制发酵类 型有较好借鉴作用。 关键词：开菲尔多糖，开菲尔基质乳杆菌，分批发酵，流加培养，共培养 a b s t r a c t l a c t o b a c i l l u sk e f i r a n o f a c i e n s ，w h i c hw a si s o l a t e df r o mk e f i rg r a i n s ，p r o d u c e sa n e x o p o l y s a c c h a r i d e sc a l l e dk e f i r a n n o to n l yc a r lk e f i r a nb eu s e da st h i c k e n e r , s t a b i l i z e r , e m u l s i f e ro rg e l l i n ga g e n t ，b u ti ta l s oh a sa l la n t i t u m o ra c t i v i t y b e c a u s eo ft h i s ，t h e p r o c e d u r ef o rt h em a s sp r o d u c t i o no fk e f i r a nf r o mt h i sb a c t e r i u mi sc u r r e n t l yb e i n g e x t e n s i v e l ys t u d i e d i nt h i sp a p e r , l a c t o b a c i l l u sk e f i r a n o f a c i e n sj c m 6 9 8 5 t ，as t r a i nc o u l da c c u m u l a t em 曲 c o n c e n t r a t i o no fe x o p o l y s a c c h a r i d e ( k e f i r a n ) w a ss e l e c t e df o rk e f i r a np r o d u c t i o n o p t i m i z e t h el 。k e f i r a n o f a c i e n sc u l t i v a t i o n p r o c e s s e s t oa c h i e v e h i 9 1 1p r o d u c t c o n c e n t r a t i o n ，h i g hy i e l da n dh i 曲p r o d u c t i v i t yo fk e f i r a n m a i nr e s u l t so ft h i s d i s s e r t a t i o ni n c l u d ef o l l o w i n ga s p e c t s ： ( 1 ) t h er e q u i r e d c a r b o na n d n i t r o g e n s o u r c e sf o rk e f i r a n p r o d u c t i o nb y 三 k e f i r a n o f a c i e n si ns h a k i n gf l a s k sw e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o n so ft h e c a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sw e r eg a i n e da sf o l l o w i n g ：s u c r o s e10 0g l ，y e a s te x t r a c t 1 0 0 g l ( 2 ) t h em o d eo fp hc o n t r o li sa ni m p o r t a n tf a c t o rf o rb a t c hk e f i r a nf e r m e n t a t i o n i tw a s s h o w nt h a tp h5 0w a st h eo p t i m u mc o n d i t i o nt oi m p r o v et h ek e f i r a np r o d u c t i o nb y c o m p a r i n gt h ep a r a m e t e r so ff i v eb a t c hp r o c e s s e sc o n t r o l l e da tt h ep hr a n g i n gf r o m4 0 t o5 5a n dw i t h o u tp hc o n t r 0 1 ( 3 ) t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e ，v a r i e df r o m2 5 0 ct o3 3 0 c ，o nt h eb a t c hf e r m e n t a t i o no f k e f i r a nw a si n v e s t i g a t e d o w i n gt ot h ed i f f e r e n c eo c c u r r e di nt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e f o rc e l lg r o w t ha n dk e f i r a np r o d u c t i o nb yt h o r o u g h l ya n a l y z i n gt h ek i n e t i c so fb a t c h k e f i r a np r o d u c t i o nu n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ，at w o - s t a g et e m p e r a t u r ec o n t r o l s t r a t e g y , i nw h i c ht h et e m p e r a t u r ew a sk e p ta t3 3 0 cd u r i n gt h ef i r s t 10h o u r so f c u l t i v a t i o n ，f o l l o w e db yas h i rf r o m3 3 0 ct o2 8 0 c ，t h e nm a i n t a i n e da t2 8 0 cu n t i lt h ee n d o ft h ec u l t i v a t i o n ，w a sd e v e l o p e di no r d e rt oe n h a n c et h ep r o d u c t i o no fk e f i r a n t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a t ，t h ek e f i r a np r o d u c t i o nw a s4 6 5g l ，w h i c hw a sr e s p e c t i v e l y i n c r e a s e db y12 a n d4 6 c o m p a r e d 丽也t h a ta t2 8 0 ca n d3 3 0 c ，a n dk e f i r a n p r o d u c t i v i t y w a si n c r e a s e db y3 6 a n d3 3 c o m p a r e d 、析t ht h a ta ta b o v et w o i i i 江南大学硕士学位论文 t e m p e r a t u r er e s p e c t i v e l y ( 4 ) f i v ei n i t i a l s u c r o s ec o n c e n t r a t i o n sw e r es t u d i e dt od e t e r m i n et h e i re f f e c t so n m i c r o b i a lg r o w t ha n ds u b s t r a t ec o n s u m p t i o n i tw a sc o n c l u d e dt h a th i g hc o n c e n t r a t i o n ， l l i g hy i e l da n dh i 曲p r o d u c t i v i t yo fb o t hc e l la n d k e f i r a nc o u l dn o tb ec o n s o l i d a t e di na b a t c hp r o c e s s t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc u l t i v a t i o nm o d e ss u c ha sb a t c hf e e d i n g ， c o n s t a n t r a t ef e e d i n g ，e x p o n e n t i a lr a t ef e e d i n go nk e f i r a np r o d u c t i o nw e r ea l s os t u d i e d h i g l lp r o d u c t i o no fc e l la n dk e f i r a nw e r ea l lr e a l i z e di nt h e s ec u l t i v a t i o nm o d e so f s u c r o s ef e e d i n g a saw h o l e ，f e d - b a t c hc u l t u r ew i t hc o n s t a n tf e e d i n gr a t ea t4g ( l h ) w a st h em o s ts u i t a b l ea p p r o a c ht oa t t a i nn o to n l yh i g hc o n c e n t r a t i o n sb u ta l s oh i 曲 y i e l d sa n dh i g hp r o d u c t i v i t i e so f c e l la n dk e f i r a ni nt h ec u l t i v a t i o no fl k e f i r a n o f a c i e n s u n d e rw h i c ht h em a x i m u md r yc e l lw e i g h ta n dk e f i r a nr e a c h e d6 3 6g la n d4 9 5g l r e s p e c t i v e l y ( s ) t h eh i g h c o n c e n t r a t i o no fl a c t i ca c i d p r o d u c e dd u r i n g t h ec o u r s eo fl k e f i r a n o f a c i e n sf e r m e n t a t i o ni n h i b i t sk e f i r a np r o d u c t i o n y e a s tw a sc o c u l t u r e dw i t hl k e f i r a n o f a c i e n st oi m p r o v ek e f i r a np r o d u c t i o nb yc o n s u m i n gl a c t i ca c i dt od e c r e a s et h e i n h i b i t i o ne f f e c t t h ep r o d u c t i v i t yo ft h ec o c u l t u r eo fl 眈f i r a n o f a c i e n sa n d & c e r e v i s i a e u n d e ra e r o b i cc o n d i t i o nr e a c h e d9 4 19m g ( l h ) ，5 3 7 h i g h e rt h a nw h i c ho ft h ep u r e c u l t u r e a n dt h ep r o d u c t i v i t yo ft h ec o c u l t u r eo fl k e f i r a n o f a c i e n sa n dcu t i l i su n d e r a e r o b i cc o n d i t i o nr e a c h e d8 6 4 4m g ( l 1 1 ) ，41 1 h i g h e rt h a nw h i c ho ft h ep u r ec u l t u r e ， a n o t h e rp r o d u c to fg l u t a t h i o n ea l s or e a c h e d2 5 0m g l k e y w o r d s ：k e f i r a n , l a c t o b a c i l l u sk e f i r a n o f a c i e n s ，b a t c h c u l t i v a t i o n , f e d - b a t c h f e r m e n t a t i o n ，c o c u l t u r e i v 独创生声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本 人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 签名： 日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 日 期： 第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论帚一早殖化 1 1 1 乳酸菌胞外多糖 乳酸菌胞外多糖( e x o p o l y s a e e h a r i d e ，简称e p s ) 是乳酸菌在生长代谢过程中分 泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于细胞壁形成荚膜，称 为荚膜多糖( c a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e ，简称c p s ) n 捌，它们都是微生物适应环境的产 物。 。 来自乳酸菌的胞外多糖可以分为两类：( 1 ) 同型多糖：含有四种聚糖，即a ) q d 葡聚糖，主要由葡萄糖残基以a 1 ，6 键连接，同时在3 位有不同程度的分支，在2 位和4 位很少有分支；b ) 3 - d 葡聚糖，由葡萄糖以d 1 ，3 键连接，以d 1 ，2 键形成 分支；c ) 果聚糖，主要由以d 2 ，6 键连接的d 果糖分子组成；d ) 其它的，像聚半 乳糖，它是由结构一致的重复单体以不同的糖苷键连接组成的。( 2 ) 异型多糖：由 嗜热菌和嗜温菌产生，其对发酵乳制品的感官、质地和口感有很重要的影响【3 】。 乳酸菌一直被认为是天然的，生产食品级多糖的优良菌株。乳酸菌胞外多糖 由于独特的物理学特性及良好的流变学特性，并且安全无毒，被广泛应用于增稠 剂、凝胶剂、稳定剂、乳化剂和持水剂等【4 j 。例如，在食品发酵过程中，由乳酸菌 生产的胞外多糖提高酸乳产品的粘度和组织状态，使酸奶产品的质地更加细腻光 滑；用于开发新产品和改良产品品质，像低乳固形物酸奶、低脂肪酸奶、奶油化 酸奶等。目前也有报道指出乳酸菌胞外多糖对人体健康具有促进作用，如：抗肿 瘤、抗溃疡、免疫调节、降低胆固醇等功效【5 】。因此将乳酸菌e p s 作为功能性食 品的成分进行开发和研究具有很大潜力【6 】。 近年来国外已有报道分离得到具有抗肿瘤和抗炎活性的乳酸菌e p s ，但是国 内对乳酸菌胞外多糖的研究报道不多。 1 1 2 开菲尔多糖及其性质 开菲尔多糖( k e f t r a n ) 是由一种特殊发酵乳一开菲尔( k e f l r ) 的发酵剂一开菲尔 粒( k e f i rg r a i n ) 产生的乳酸菌胞外多糖。开菲尔是起源于高加索地区的一种传统酒 精性发酵乳饮料，迄今已有上千年的食用历史。开菲尔的发酵剂开菲尔粒是一种 类似花椰菜样的粒状结构体，直径1 - 2 0m i l l ，白色或浅黄色，由乳酸菌，酵母菌 和醋酸杆菌等共生而成【7 j 。 1 9 6 7 年，l a r i v i e r e 8 】等首次发现了开菲尔粒中2 5 的干重是由l 。b r e v i s ( 现名 为l 艇缈) 分泌的胞外多糖所构成，并对粒的结构进行了细致的研究，发现粒上的 微生物栖息于由微生物自己产生的由半乳糖和葡萄糖所构成的具有弹性的多糖基 江南大学硕士学位论文 质上，并命名此多糖基质为k e f i r a n ，中文称为开菲尔基质或开菲尔多糖，可迸一 步细分为两种，即包在菌体表面形成荚膜的那部分荚膜多糖以及分泌到发酵液中 的那部分胞外多糖。 k 0 0 i m a l l 【9 】于1 9 6 8 年对k e f i r a n 的主要化学结构进行了研究，1 9 9 0 年，y o k o i 也对此多糖进行凝胶过滤色谱分析，发现上清液和荚膜多糖各有两个峰，上清液 多糖的两个峰分别是4 0 x 1 0 6d a 和1 5 1 0 6d a ；荚膜多糖组分的两个峰分别为 4 0 x 1 0 6d a 和1 0 x 1 0 6d a 1 0 j 。1 9 8 8 年，f u j i s a w a 通过甲基化作用、水解法、1 3 c 、 1 h - n m r 及i r 等分析测定方法对k e f i r a n 的化学结构等也进行了研究，发现除具 有k o o i m a n 所报道的结构外，还含有6 0 取代半乳糖的结构 1 l 】。1 9 9 9 年，m i c h e l i 等报道指出k e f i r a n 分子量在1 o 1 0 6d a 左右，含有几乎相等的d 葡萄糖和d 半 乳糖残基，葡萄糖与半乳糖的比例为1 ：1 0 5 ，本身由规则的五碳糖组成，支链是 六碳糖或七碳糖的重复单元【1 2 】，如图1 1 。 k e 三摹譬。希辨。嘧、k 、 h 呲玺 图1 1k e f i r a n 结构示意图 f i g u r e1 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f k e f i r a n k e f i r a n 是一种水溶性的中性支链多糖，不易溶于有机溶剂。在冷水中溶解缓 慢，热水中溶解较快，不易水解，2 的溶液即成一种粘性的液体。k e f i r a n 也是一 种耐水解的多糖，但在三氯乙酸( t c a ) 溶液中会发生降解，有研究指出其降解 程度达5 0 ；在2 5 0c 时，k e f i r a n 的比旋光度 0 【 d = + 5 4 0 ；粘度较低，h 】_ 5 4 0 5 d u g ；m u k a i 和m i t s u e 等【1 3 , 1 4 , 1 5 j 遵过研究k e f i r a n 的胶凝性和流变学性质，发现 l 5 ( w v ) 的k e f i r a n 水溶液在低温下( 5 0c ) 放置一段时间会自动胶凝，但是形成的 凝胶缺乏硬度。当其水溶液中加入5 - 8 的乙醇后即可形成具有一定强度的凝胶， 且凝胶强度随乙醇用量的升高而增加。此外，甲醇、丁醇、乙二醇也具有促使k e f i r a n 形成凝胶的作用。若经化学改性后，k e f i r a n 的胶凝性质会发生显著变化，例如经 酰化作用后的丁二酰k e f i r a n 在低温下( 5 0c ) 不会发生胶凝，即使在其水溶液中加入 4 0 的乙醇，也几乎完全不胶凝，在低温下放置6 个月之久仍能保持稳定的溶液状 态。 2 第一章绪论 1 1 3 开菲尔多糖的功能及应用前景 k e f i rg r a i n 对人体具有显著的医疗保健价值【1 6 】，而k e f i r a n 是存在于k e f l rg r a i n 中唯一的多糖，并且在各种微生物间作为黏合剂形成了k e f i rg r a i n 结构的骨架，是 微生物固定化的单体，使它们在繁殖再生过程中具有极好的自我调节能力，因此 k e f n a n 的生理功能引起了人们的注意。 s m o m i r 7 】及c e v i k b a s 1 8 】等先后发现k e f l r a n 的生物学活性，它具有抗真菌、抗 细菌、降压、降血糖、降胆固醇、抗癌和抗肿瘤的特性，从而能预防肿瘤的恶化， 抑制癌细胞增殖，并且对形成干扰素伊皮甾醇和去甲肾上腺素具有促进效果，是 一种很好的消炎降压及免疫激活物质【1 9 , 2 0 】。同时动物实验表明，这种多糖可提高 肿瘤鼠的迟发型过敏性应答，而具有高迟发型过敏性应答的肿瘤的增大能被显著 抑制【1 7 】。对埃利希瘤( e n l i c h ) 和肉瘤s 1 8 0 的抑制率分别为4 0 5 9 和2 1 8 0 。并 且可使胃液和小肠中的蛋白酶活提高两倍多，体外实验可使蛋白酶和脂肪酶的活 性提高3 5 5 5 【l 6 。 目前，k e f i r a n 作为一种新型的活性多糖，其纯品主要应用在医药领域。2 0 0 5 年，k a m i l a 再次指出k e f i r a n 在各种疾病诊治中，是一种相当好的抗菌、消炎、伤 口愈合的药剂【2 1 1 。另外，可以将酰化改性后的k e f i r a n 添加到饮料中以增加其粘性， 添加到化妆品中则具有保湿的功效，并且提高了化妆品的质感。2 0 0 6 年，g a b r i e l 等最新研究指出k e f i r a n 能诱导胃肠粘膜免疫应答反应【2 2 1 。随着生物技术的发展， k e f l r a n 在医疗( 如抗肿瘤剂、眼及关节外科、肝素类似物、血浆代用品等) 、化妆 品、细胞和酶技术等方面具有潜在的开发价值，见表1 1 。 表1 - 1k e f i r a n 的生理特性及其应用 t a b l e1 - 1p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f k e f i r a na n di t sa p p l i c a t i o n 江南大学硕士学位论文 1 2 生物法合成开菲尔多糖的研究动态 1 2 1 开菲尔多糖生产菌株的分离与鉴定 人们一直在设法确定究竟k e f i rg r a i n 中的何种微生物是k e f i r a n 的产生者，尽 管r i v i e r e s l 等认为l k e f i r 是产生k e f i r a n 的微生物，但此菌一经分离在第一次传 代至生长培养基上时，产生荚膜的能力随即消失。因此k a n d l e r 和k u n a t h 2 3 】认为 厶k e f i r 不是k e f i r a n 的产生者；r o s i 和r o s s i 认为是一种同型发酵的乳杆菌，并称 之为“a t y p i c a l s t r e pt o b a c t e r i u m ( 非典型链杆菌) 产生了k e f i rg r a i n 中的多糖【2 4 1 。 o h e r a 也从加入酵母自溶物的乳清培养基中分离出了一株同型发酵荚膜杆菌【2 5 1 ，堀 俊民由h a n s e n p sk g 中用m r s 培养基分离出了一株菌落巨大的三n i d i f i c u s 并鉴定 为l a c i a o p hi l u s 之亚种【2 6 】。19 8 6 年t o b a 等运用k p l 琼脂培养基从k e f i rg r a i n 中 分离出来的一株同型发酵的荚膜杆菌，这株菌不同于任何其它已分离出来的微生 物【27 j ；1 9 8 8 年，f u j i s a w a 借助于新改进的k p l 培养基也从k e f i rg r a i n 中分离出该 菌株并对这株菌进行了研究，并命名为l a c t o b a c i l l u sk e f i r a n o f a c i e n ss p n o v t l l 】。其 后，人们对它产生的多糖进行了进一步的分析，发现该多糖葡萄糖与半乳糖之比 接近于为1 ：1 ，并命名此菌为l a c t o b a c i l l u sk e f i r a n o f a c i e n s 。t o b a 认为k e f i rg r a i n 中水溶性多糖主要是由lk e f i r a n o f a c i e n s 产生的，并强调lk e f i r a n o f a c i e n s 、l 起缈、乳糖发酵性酵母和乳糖非发酵性酵母对k e f i rg r a i n 的形成和性质维持都是必 需的，而且也认为l k e f i r a n o f a c i e n s 是k e f t r a n 的产生菌。 2 0 0 4 年，v a n c a n n e y t 2 8 j 等将19 8 8 年f u j i s a w a 等【1 1 】对l k e f i r a n o f a c i e n s 的描述 进行了修正，即三k e f i r a n o f a c i e n s 为g + ，不游动，无芽孢形成，杆状，大小为 0 5 , - - 1 2 x 3 0 2 0p m ，单个或成对出现，偶尔成链状出现。菌落的形态学上为独立 的亚种，在1 5 0 c 和4 5 0 c 下无生长或生长缓慢。是兼性厌氧菌，并且同型发酵产 d l 乳酸，不产生过氧化氢酶。七叶树素的水解是不定的。在葡萄糖和葡萄糖酸盐 中生长时不产气，精氨酸不会发生脱氨基作用。在牛奶中发酵时，牛奶会发生凝 结。在半乳糖、d 葡萄糖、d 果糖和乳糖中产酸，而在核糖醇、d 阿拉伯糖、l 阿拉伯糖、d 阿拉伯醇、l 阿拉伯醇、己元醇、赤藓醇、d 海藻糖、l 海藻糖、 葡萄糖酸盐、2 酮基葡萄糖酸、5 酮基葡萄糖酸、甲基c 【d 葡萄糖苷、甘油、糖原、 肌醇、甘露醇、d 甘露糖、甲基0 【d 甘露糖苷、松三糖、鼠李糖、核糖、山梨醇、 l 山梨糖、淀粉、d 塔格糖、木糖醇、d 木糖、l 木糖或甲基一d 木糖苷中不产酸。 在苦杏仁苷、纤维二糖、p 龙胆二糖、n 乙酰葡糖胺、菊粉、麦芽糖、蜜二糖、 d 棉子糖、水杨苷、蔗糖、海藻糖中的产酸取决于菌株。d n a 中g + c 含量是 3 7 3 3 8 2m o l ( h p l c ) 或3 4 3 3 8 6m o l ( t m ) 。典型的菌株为l m g1 9 1 4 9 。o ( = j c m 6 9 8 5 1 = a t c c4 3 7 6 11 ) ，菌体形态见图1 2 。 4 * 一章廿论 i j 7 ，t ：o ，? j j j j 二：再：? ? ：。 j ：f ：，_ 秘l i 1 2 2 发酵法生产开菲尔多糖 由于k e f u a a 的产生菌鲫讹n 确c 据坩发现历史不长所以对其合成多糖的 机理的研究也较少。目前，主要是日本对开菲尔多耱的发酵生产、性质、改性及 应用方面的研究较多。最早利用发酵法生产k e m a n 的是m u k a i 等口”在1 9 9 0 年将 工k e f i r a n o f a c i e n s 在i k p l 培养基中，3 0 。c 下培养三天，多糖的产量为6 3r a g l ： 1 9 9 2 年，y o k o i 等p ”报道了发酵法生产k e f i r a n 的产量达2 0 4 0 r a g l ：1 9 9 8 年，m i t s u e 等1 利用紫外诱变后的工k e f i r a n o f a c i e n s k f 一7 5 和t o r u l a s p o r a d e 舾r u e c l d i i f 0 1 6 2 6 混合培养的方法可实现工业化生产开菲尔多糖，产量达3 7 0 0m e d l ；1 9 9 9 年m i t s u e 等p 2 l 又进一步研究了上k e f i r a n o f a c i e n s 与不同的酵母菌株混合培养对开菲尔多糖 产量的影响，发现利用k e f i r a n o f a c i e n s 单独发酵生产得到的多糖产量为1 8 8 0 m e c l ，与t o r u l a s p o r ad e b r u e c 觚i f 0 1 6 2 6 ( t d 1 6 2 6 ) 混合培养6 天得到的产量为 2 3 8 0m g l ，而将lk e f i r a n o f a c i e n s 与t o r u l a s p o r ad e l b r u e c k i ii f 0 1 6 2 6 分批混合培 养7 天，产量可达3 7 4 0r n g l 。2 0 0 1 年，c h e i r s i l p p ”等建立了lk e f i r a n o f a c i e n s 生 产k e f i r a n 的数学模型，考察了n h 的影响、底物和产物对细胞生长的影响以及多 糖的形成和底物的同化作用。2 0 0 3 年，他们通过乳酸菌工k e f i r a n o f a c i e n s 与酵母 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ( 对乳酸有同化作用) 的捏合培养，在厌氧条件下，相对于 单独培养，乳酸菌的生产率由2 4m 趴lh ) 增加到3 6m g ( l ”。在供氧条件下，相 对于无氧条件得到了更高的生产率：4 4m g ，( l1 1 ) 。添加新鲜培养基可以提高微生物 的生长与生产能力，因此通过补料混合培养最终得到了6 2m g ( l m ) 的高产率，其 k e f i r a n 产量高达5 4 1 0m g l 删：2 0 0 4 年，h i r o a k i 口”等利用大米水解液为培养基， 以上妇f i r a n o f a c i e n s 为发酵菌株发酵生产k e f i r a n ，其产量为2 5 0 0m g l ；2 0 0 5 年， 国内毕洁等率先研究了发酵条件对乳酸菌工k e f i r a n o f a c i e n s 发酵产k e f i r a n 的影响， 在其考察的最优条件下k e f t r a n 产量为2 6 0 0m g l “。生产k e t l r a n 的主要微生物及 生产条件如表1 2 。 江南大学硕士学位论文 表l - 2 生产k e f i r a n 的主要微生物及其生产条件 t a b l e1 2a no v e r v i e wo ft h em a i ns t r a i n sa n dt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s f o rt h ep r o d u c t i o no fk e f i r a n 1 3 本论文主要研究内容 1 3 1 发酵法生产开菲尔多糖研究中仍存在问题 k e f i r a n 在医疗，化妆品，细胞和酶技术等方面的应用潜力巨大，加大研制开 发的力度并投入生产已经势在必行。目前，对开菲尔乳及开菲尔粒的研究及对开 菲尔多糖的发酵生产、性质、改性及应用方面的研究较多，其中日本采用发酵法 生产开菲尔多糖已达到工业化水平，但是总体来说，对整个k e f t r a n 发酵过程的把 握和分析还相对肤浅，对k e f i r a n 产量、得率和生产强度等主要技术指标的影响因 素的探讨还不够透彻。 1 3 2 本论文主要研究内容 本论文在实验室规模上以一株能在胞外积累k e f l r a n 的开菲尔基质乳杆菌 ( l a c t o b a c i i l u sk e f i r a n o f a c i e n sj c m 6 9 8 5 1 ) 为生产菌株，以细胞和k e f i r a n 的高产量， 高得率和高生产强度为目标，在摇瓶和发酵罐培养中采用针对发酵过程的外因f 基 于微生物反应原理的培养环境优化) ，内因( 基于代谢特性的分阶段培养) ，外因定 量化( 基于动力学模型分析的优化和控制) 及基于解除终端产物抑制的优化和控制 等一系列可行性方案对k e f l r a n 的发酵过程进行了较为系统和深入的研究。具体研 究内容主要分为以下几个部分： ( 1 ) 考察摇瓶条件下发酵生产k e f i i a n 的碳氮源，确定适宜培养基组分； ( 2 ) 不同p h 控制方式对k e f i r a n 分批发酵的影响有较大差异。考察不控制p h 条 件及p h4 o 5 5 范围内k e f i r a n 分批发酵的各过程参数，确定最优p h 条件； 6 第一章绪论 ( 3 ) 分析不同温度下k e f i r a n 分批发酵动力学参数，提出提高k e f i r a n 产量的温度 控制策略； ( 4 ) 考察k e f i r a n 的分批发酵过程中，不同初始蔗糖浓度对细胞生长和k e f l r a n 合 成的影响，在此基础上研究分批补料、恒速流加和指数流加等几种培养方式下 k e f i r a n 的发酵结果，并结合发酵动力学参数进行比较分析，为放大研究奠定基础： ( 5 )为降低乳酸菌发酵过程中乳酸对菌体生长和产物合成的抑制作用，考察了乳 酸菌与酵母菌共培养对k e f i r a n 发酵的影响。并对共培养过程中，在提高k e f i r a n 产量的同时，生产高附加值共同产物进行了初步探讨。 7 第二章开菲尔基质乳杆茵发酵生产开菲尔多糖营养及环境条件 第二章开菲尔基质乳杆菌发酵生产开菲尔多糖营养及环境 条件 2 1 前言 营养和环境条件的选择优化是对目标发酵过程进行优化研究的基础性工作。 对于乳酸菌胞外多糖k e f i r a n 的发酵生产来说，培养条件对乳酸菌生长代谢有着重 要的影响，适宜的环境条件不仅有利菌体的生长，而且可以提高乳酸菌对底物的 利用能力，使代谢向着有利于产物多糖合成的方向进行。因此要提高乳酸茵生产 k e f i r a n 的总量，对营养和环境条件进行优化显得尤为重要。 首先，发酵过程中培养基的p h 值是一项重要的控制参数，是菌体细胞在一定 环境条件下代谢活动的综合指标【3 7 】：( 1 ) p h 因影响细胞质膜的电荷而使其发生变 化，引起质膜对个别离子渗透性的改变，从而影响细胞对培养基中营养物质的吸 收利用以及代谢产物的排出，进而影响到菌体生长和新陈代谢的正常进行。由于 胞内大多数生化反应都与质膜的表面作用有着密切的关系，所以培养基的p h 对细 胞的生长发育和其他生理作用都会产生极为显著的影响。( 2 ) p h 直接影响到细胞内 酶的活性，只有在合适的p h 范围内，细胞中的酶系才能表现出最大的活性。( 3 ) p h 还通过改变培养基中营养物质和中间代谢产物的离解形式而影响细胞的正常代谢 过程，从而对代谢产物的质量和产量产生影响。 其次，在发酵过程中需要保持菌体生长和产物合成所需的最适温度。菌体生 长和产物合成代谢都是在各种酶的催化下进行的，而温度又是保证酶活性的重要 条件，因此在发酵过程中对温度的控制非常关键【3 8 j ：( 1 ) 温度对菌体细胞的影响不 仅表现为改变细胞生活的外部环境，还可以热量的形式传递到胞内并对胞内结构 物质产生作用。温度和菌体生长的关系，一方面在其最适温度范围内，菌体的生 长速度随温度的升高而增加，发酵周期也相应缩短；另一方面，不同生长阶段的 菌体对温度的反应有所不同。( 2 ) 细胞的生命活动是相互连续的酶反应过程，温度 升高则酶反应速度加快，产物生成提前；同时高温会使酶很快失去活性，表现出 菌体细胞容易衰老，从而影响发酵产物的最终产量。( 3 ) 温度可以通过改变发酵液 的物理性质和细胞对营养物质的吸收利用速度，从而间接影响到微生物细胞的生 长及产物合成代谢。( 4 ) 温度还会影响到微生物细胞的生物合成方向。( 5 ) 对于同 一种微生物细胞，细胞生长和代谢产物积累的最适温度往往也是不同的。因此温 度对发酵过程的影响是非常复杂的。 t o b a 等【2 7 】与f u j i s a w a 等【1 1 】先后于1 9 8 6 年和1 9 8 8 年从k p l 培养基中分离得到 三k e f i r a n o f a c i e n s ，用于培养l k e f i r a n o f a c i e n s 的培养基中必须添加昂贵的葡萄酒， 而且k e f i r a n 的产量很低( 8 0m e j l ) 。1 9 9 0 年，y o k o i 等【3 0 j 在新改良乳清培养基中分 9 江南大学硕士学位论文 离得到l a c t o b a c i l l u ss p k p b l 6 7 b ，它在乳清培养基和m r s l 培养基中都能合成 k e f i r a n ，随后y o k o i 等进一步对m r s l 培养基进行了优化，k e f i r a n 最终产量达到 2