（分析化学专业论文）有机染料分子和dna相互作用的电化学研究及分析应用.pdf

有机染料分子和d n a 相互作用的电化学研究及分析应用 摘要 d n a 作为遗传信息的载体，是生命活动中一类重要的生物大分子，研究各 种小分子如抗癌药物、金属配合物和染料分子与d n a 的相互作用在致癌机理、 药物筛选和疾病诊断方而有着重要意义。本文筛选了具有电活性的染料分子吡哕 红b 、酚藏花红、灿烂甲酚蓝、结晶紫和中性红作为电化学探针，采用电化学法 在汞电极上系统研究了它们的电化学行为以及和d n a 的相互作用。 论文由6 章组成，第1 章综述了小分子和d n a 的相互作用；第2 至6 章分 别筛选了吡哕红b 、酚藏花红、灿烂甲酚蓝、结晶紫和中性红等小分子染料，以 汞电极如静汞电极、滴汞电极作为工作电极，采用循环伏安法、线扫极谱法等电 化学手段，结合紫外可见分光光度法，研究了它们的电化学行为以及和d n a 的 相互作用。通过对加入d n a 前后峰电流、峰电位以及一些电化学参数如电子转 移系数n 、标准速率常数k 和扩散系数d 0 的研究发现，这些小分子均可以与d n a 发生结合反应导致染料分子的峰电流降低。利用峰电流的变化对结合反应的条件 和电化学检测条件进行了优化，考察了常见的金属离子、氨基酸等物质的存在对 结合反应的影响。在最佳条件下，峰电流的降低值同d n a 浓度在一定范围内成 良好的线性关系，进而可用于d n a 的分析，建立了测定d n a 的工作曲线，应 用于混合样品的测定，获得了令人满意的结果。利用电化学法求解了反应的结合 比和结合常数，对结合反应的模式进行了推导。 关键词：电化学；d n a ；毗哕红b ；酚藏花红；灿烂甲酚蓝；中性红；结晶紫 相互作用 e l e c t r o c h e m i c a ls t u d i e so nt h e i n t e r a c t i o no fo r g a n i cd y e sw i t h d n a a n da n a iy t i c a l a p p l i c a t i o n a b s t r a c t d n ai so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tb i o m a c r o m o l e c u l e si nl i f ep r o c e s s e sa st h e c a r r i e ro fg e n e t i ci n f o r m a t i o n 皿es t u d i e so fs o m el o wm o l e c u l a rw e i g h tc o m p o u n d s s u c ha sa n t i c a n c e rd r u g s ，m e t a lc o m p l e x e sa n do r g a n i cd y e sw i t hd n a a t ec r u c i a l f i e l d si nm u t a t i o nd e t e c t i o na n dc l i n i c a ld i a g n o s t i c s i nt h i sp a p e r , t h ee l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o r so fs o m ee l e c t r o a c t i v ed y e ss u c ha sp y r o n i n eb ，p h e n o s a f r a n i n e ，b r i l l i a n t o r e s y lb l u e ，c r y s t a lv i o l e t ，n e u t r a lt e de t c a n dt h e i ri n t e r a c t i o nw i t hd n a o nt h e m e r c u r ye l e c t r o d ew e r ec a r e f u l l ys t u d i e d t h i sp a p e ri sm a d eu po f6c h a p t e r s ；c h a p t e r1s u m m a r i z e st h ei n t e r a c t i o no fl o w m o l e c u l a rw e i g h tc o m p o u n d sw i t hd n a ；c h a p t e r2t o6f o c u so nt h ee l e c t r o c h e m i c a l s t u d i e so fs o m eo r g a n i cd y e ss u c ha sp y r o n i n eb ，p h e n o s a f r a n i n e ，b r i l l i a n tc r e s y lb l u e ， c r y s t a lv i o l e t ，n e u t r a lr e de t c a n dt h e i ri n t e r a c t i o nw i t hd n a , r e s p e c t i v e l y d i f f e r e n t e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d ss u c ha sl i n e a rs w e e pv o l t a m m e t r y ，c y c l i cv o l t a m m e t r ya n d u v v i ss p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o da l ea p p l i e dt ot h ei n v e s t i g a t i o n b a s e do nt h e c h a n g e so f t h e i rp e a kc u r r e n t s ，p o t e n t i a l sa n ds o m ee l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r ss u c h a st h ec h a r g et r a n s f e rc o e f f i c i e n tu ，t h ee l e c t r o d er e a c t i o ns t a n d a r dr a t ec o n s t a n tl ( sa n d t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n td ob e f o r ea n da f t e rt h ea d d i t i o no fd n a , i ti sf o u n dt h a tt h e s e d y e sc a nb i n dt od n a a n dl e a dt ot h ed e c r e a s eo fr e d u c t i o np e a kc u r r e n t t h e s t o i c h i o m e t r yo ft h e s es u p r a m o l e c u l a rc o m p l e x c ss u c ha st h eb i n d i n gn u m b e ra n dt h e b i n d i n gc o n s t a n ta r ec a l c u l a t e db ye l e c t r o c h e m i c a ld a t a t h ec o n d i t i o n so f t h eb i n d i n g r e a c t i o na n dt h ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e r m i n a t i o na r eo p t i m i z e d t h ei n f l u e n c e so f c o e x i s t i n gs u b s t a n c e ss u c ha sm e t a li o n sa n da m i n oa c i d sa r et e s t e d u n d e rt h e o p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ed e c r e a s eo fr e d u c t i o np e a kc u r r e n t i sp r o p o r t i o n a lt ot h e c o n c e n t r a t i o no fd n aa n dt h ew o r k i n gc u r v e sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd n aw e r e e s t a b l i s h e d t h e s em e t h o d sw e i ef u r t h e ra p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fs y n t h e t i c s a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i s t r y ；d n a ；p y r o n i n eb ；p h e n o s a f r a n i n e ；b r i l l i a n t c r e s y lb l u e ；c r y s t a lv i o l e t ；n e u t r a lr e d ；i n t e r a c t i o n 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 1 1d n a 的结构、功能和研究意义 脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 是核酸的一种，它的基本构成 是脱氧核糖核苷酸，脱氧核糖核昔酸又由磷酸、d 一2 脱氧核糖和碱基构成。其中 碱基又包括四种，即腺嘌呤( a d e n i n e ) 、鸟嘌呤( g u a n i n e ) 、胞嘧啶( c y t o s i n e ) 和胸腺嘧啶( t h y m i n e ) 。d n a 的基本构成如下所示： r， 厂 。na一脱氧核糖核苷酸t碱罴系 d n a 由多条脱氧核糖核苷酸链构成，每条链均以磷酸基( 磷酸酯键) 为桥， 从一个核昔的3 连接到相邻核糖的5 ，位置上，这就是d n a 的一级结构。1 9 5 3 年， w a t s o n 和c r i c k t l l 提出了d n a 分子的双螺旋结构模型( 即d n a 的二级结构) ，揭 示了遗传信息是如何储存在d n a 分子中，以及遗传性状何以在世代间得以保持 的奥秘。这是生物学发展史上具有里程碑意义的重大事件。其主要内容如下： ( 】) 在d n a 分子中，两股d n a 链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺旋 结构，双螺旋的螺距为3 4n n l ，直径为2 0n l n 。 ( 2 ) 链的骨架( b a c k b o n e ) 由交替出现的、亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成， 位于双螺旋的外侧。 ( 3 ) 碱基位于双螺旋的内侧，两股链中的嘌呤和嘧啶碱基以其疏水的、近 于平面的环形结构彼此密切相近，平面与双螺旋的长轴相垂直。一股链中的嘌呤 碱基与另一股链中位于同一平面的嘧啶碱基之间以氢链相连，称为碱基互补配对 或碱基配对( b a s ep a i r i n g ) ，碱基对层问的距离为o 3 4r l l n 。碱基互补配对总是出 现于腺嘌呤与胸腺嘧啶之问( a = t ) ，形成两个氢键：或者出现于鸟嘌呤与胞嘧啶 之间( g s - - c ) ，形成三个氢键。 ( 4 ) d n a 双螺旋中的两股链走向是反平行的，一股链是5 ，- ，3 。走向，另一 有机染料分子和d n a 相互作用的电化学研究及分析应j | j 股链是3 一5 ，走向。两股链之间在空间上形成一条大沟( m a j o rg r o o v e ) 和一条小 沟( m i n o rg r o o v e ) ，这是蛋白质识别d n a 的碱基序列并与其发生相互作用的基 础。 d n a 双螺旋的稳定由互补碱基对之间的氢键和碱基对层问的堆积力( b a s e s t a c k i n gf o r c e ) 维系。d n a 双螺旋中两股链中碱基互补的特点，逻辑地预示了 d n a 复制过程是先将d n a 分子中的两股链分离开，然后以每一股链为模板f 亲 本) ，通过碱基互补原则合成相应的互补链( 复本) ，形成两个完全相同的d n a 分子。因为复制得到的每对链中只有一条是亲链，即保留了。一半亲链，将这种复 制方式称为d n a 的半保留复制( s e m i c o n s e r v a t i v er e p l i c a t i o n ) 。后来证明，半保 留复制是生物体遗传信息传递的最基本方式。 在：级结构的基础上，d n a 还可扭曲或卷曲形成三级结构。 d n a 是遗传信息的载体。在生物的生长发育、物种延续等正常生命活动中有 着十分重要的意义。它不但与生命的工f 常活动如种族遗传、细胞分化等密切相关， 而且与生命的异常活动如肿瘤、辐射损伤、遗传病和代谢病也息息相关。人类的 许多遗传疾病与其d n a 序列不同程度的变异有关。基因突变、癌变以及老化过程 可能涉及至l d n a 的碱基损伤，因此对d 】她的研究是现代生物学、医学和生命科学 的重要课题之一。2 0 0 3 年4 月1 4 日，美国联邦国家人类基因组研究项目负责人弗 朗西斯柯林斯博士在华盛顿宣布，由中、美、英、日、法、德科学家经过1 3 年努 力共同绘制完成了人类基因组序列图，人类基因组计划所有目标全部实现。被誉 为生命科学的“登月”计划的人类基因组序列图提前完成，这标志着人类在揭示 生命奥秘、认识自我的漫漫长路上又迈出了重要的一步。 1 2d n a 探针的分类 d n a 的研究通常包括：对生物样品中d n a 的含量进行测定，确定d n a 结构 和碱基对序列，研究环境中污染物质对d n a 损伤机理，对p c r 产物进行检测以及 研究各种小分子与d n a 相互作用等许多方面。研究小分子与核酸的相互作用不 仅对阐明抗肿瘤、抗病毒及致癌物的作用机理，而且对进一步指导人工核酸酶的 合成及核酸高级结构的研究等方面具有重要意义。小分子与d n a 相互作用的模 式，特别是嵌插作用诱导d n a 的一些生理和物化性质的改变，在d n a 的识别、分 离及分析中有很大的应用潜力。可以与d n a 发生相互作用的靶向分子包括以下几 种【2 1 ： ( 1 ) 金属配合物 2 青岛科技夫学研究生学位论文 金属离子配合物，尤其是过渡金属配合物是一类重要的核酸探针，这类化合 物的主要作用有两种：设计人工核酸酶从而实现对d n a 链上某些特定位点的剪 切作用；设计成性能优良的抗肿瘤药物或抗病毒药剂。 自从6 0 年代r o s e n b e r 叠【3 j 发现二氯二氨合铂( i i ) 具有优良的抗痛活性以来， 现已有多种具有类似结构的平面四边形铂配合物处于临床实验阶段。这类药物的 抗癌活性与其能和d n a 链共价结合并导致d n a 结构变化的能力密切相关。一些具 有八面体结构的过渡金属配合物，尤其是r u 、r h 、c o 配合物与d n a 相互作用的 研究也一直受到人们的重视。许多r u 配合物具有的独特发光性能，使其成为研究 d n a 性质的一种有效的光物理和光化学探针。计亮年1 4 ，5 j 等合成了一系列r u 的平 面配体配合物，研究了这些配合物与小牛胸腺d n a 的光断裂作用，发现是由于激 发态的配合物与溶液中的氧分子发生能量转移生成单线态氧活性氧化物种，将鸟 嘌呤碱基氧化面导致d n a 断裂。杨频【档1 等人选择c 0 3 + 、n i 2 + 作为中心离子，合成 了【c o ( p h e n ) d p p z “、 c o ( b p y ) 2 d p p z “、 n i ( p h e n ) 2 d p p z “、 n i ( p h e n ) 2 d p p z 2 + 等配 合物，采用光度法、荧光法和图二色谱法等手段研究了它们和小牛胸腺d n a 的相 互作用，发现这些配合物与d n a 作用后出现吸收光谱减色、红移和荧光增强等效 应，而且这些配合物在光照下可 f 吏d n a 断裂，从而为设计与d n a 结合力强、以光 切断目标d n a 的新型抗癌剂提供了根据。 ( 2 ) 抗癌药物 研究药物分子和d n a 的相互作用，可以了解药物的药理和毒性，特别是对于 了解药物分子对d n a 特定位点的识别作用以及对d n a 构象产生的影响，在体外筛 选出高效合理的抗癌药物具有重要意义。这些药物分子包括：多肽及蛋白质类； 蒽环类；烯炔类；乙撑亚胺类等。 s c h u s t e r l 9 1 等人以蒽醌类抗癌药物的衍生物作为光学激发剂研究了其对d n a 的断裂作用，发现具有蒽醌结构的功能基团具有较低的激发能级并且可以特异性 剪切d n a 片段，因此可以设计成人工核酸酶而具有较大的研究和应用价值。 庞代文等人在研究抗癌药物和d n a 的相互作用方面作了较多的工作，他们研 究了道诺霉素【1 0 1 ( d n m ) 在石墨粉末微电极和d n a 修饰石墨粉末微电极上的电化 学行为，发现经d n a 修饰的粉末微电极的充电电流和氧化还原峰电流都较未修饰 的电极明显增大，推测出充电电流增大是由于d s d n a 被吸附固定于石墨粉末的表 面后，因其有很强的亲水性，使粉末微粒的浸润表面积大大增加所致，在此基础 上提出了测定微量d n m 的方法并且实现了在人尿样中d n m 的痕量测定；他们还 研究了一种自己合成的f e d s c h i 蹴【1 1 1 和d n a 的相互作用，采用光谱和电化学法 研究后发现d s d n a 和此类s c h i 峨发生较强的相互作用，特别是f e ( i i ) s d l i 鲫或配合 3 有机染料分子和d n a 相互作用的电化学研究及分析应用 物更容易和d s d n a 结合，推测出s c h i f f 碱类配合物的生物作用过程可能涉及到吸 氧、催化以及和d n a 的相吐作用等多方面的协同作用。 李肩隆1 1 2 1 等人采用钴离子注入修饰电极研究了柔红霉素( d n r ) 与d n a 的相 互作用，发现d n r 可以通过嵌插方式与d n a 作用形成了一种非电活性的络合物， 并且加入d n a 后d n r 的电化学行为并没有发生变化，用非线性拟合得至i j d n r 与 d n a 的结合比和结合常数分别为4 和1 0 9 x 1 0 8c m a m o l 。 彭图治【1 3 】等人在活化浸蜡石墨电极上研究了更生霉素( a c t d ) 的电化学行 为以及- 与d n a 的相互作用。发现加入d n a 后a c t d 的峰电流明显降低，推测出 a c t d 和d n a 生成了非电活性络合物，采用电化学法计算出结合反应的结合比和 结合常数分别为8 和5 8 7 x 1 0 9c m 3 m o l 。作者认为极有可能是两个多肽侧链与d n a 小沟中的碱基之问发生氢键作用，增强了药物对d n a 的结合能力，采用x 晶体衍 射法研究后发i g a c t - d 倾向于结合g c 碱基对。 ( 3 ) 有机染料分子 染料分子作为一类重要的d n a 靶向分子，其研究一直受到人们的重视，这对 于了解d n a 分子的理化性质和筛选合适的d n a 杂交指示剂具有重要价值。 一些 有机染料分子，如有平面结构的多环芳烃( 如吖啶类、吩噻嗪类、卟啉类等) ， 可以以嵌插方式作用于d n a 分子碱基对，还可以通过自身所带的电荷与d n a 发生 静电吸附作用，一些三苯甲烷类染料如甲基紫【1 4 1 、结晶紫【1 5 】等也已经被用于研究 与d n a 的相互作用。 由于染料分子中一般存在不饱和基团或大的共轭兀键体系，有的还具有荧光性 能，所以光度法、荧光法、电化学法和共振光散射法等方法已经应用于研究染料 分子和d n a 的相瓦作用。牛淑妍【”】等人采用循环伏安法以及紫外，可见光谱法对 菲啶类染料溴化乙锭( e b ) 与d n a 的相互作用进行了研究后发现e b 能与d n a 分 子发生嵌插作用；方禹之1 1 7 瞎人以乙基一( 3 一二甲基丙基) 碳化二亚胺盐酸盐( e d c ) 为偶联活化剂，将e b 成功地标记在人工合成的含有2 1 个碱基的寡聚d n a 片段上， 制各成e b 标记d n a 探针并用电化学方法将待测样品d n a 片段固定在石墨电极表 面，在一定的温度、p h 值和离子强度条件下与e b 标k 2 d n a 探针进行杂交反应， 从而对靶序y j j d n a 片段进行识别和测定。 何锡文1 1 8 j 等人采用紫外可见光谱法研究吩嗪类染料中性红( n r ) 与d n a 的相互作用后发现小分子物质与d n a 分子的非共价键力作用将改变d n a 分子构 型，破坏其模板作用。姜慧君【| 9 1 等人采用光谱电化学法研究了n r 和d n a 的相 互作用并发现随着溶液p h 值的改变，出于n r 分子存在方式不同，n r 与c t - d n a 之间相互作用的方式也随之不同。在p h = 7 0 时，二者的作用方式主要为嵌插作 4 青岛科技大学研究生学位论文 用，当p h = 6 0 时，二者主要的作用方式改变为静电作用。 刘绍璞【2 0 】等人在t r i s 缓冲溶液中系统研究了碱性三苯甲烷类染料的光谱特 性，发现鲱鱼精d n a 可以和三苯甲烷类染料结合而使其共振光散射信号显著增强 并产生新的共振光散射光谱，体系的散射强度与d n a 的浓度在一定范围内呈线性 关系。 ( 4 ) 纳米粒子标记物 最近，纳米粒子也被用于d n a 的分析检测中【2 ”。当微粒尺寸降低到纳米尺 寸时具有小尺寸效应、量子隧道效应等与宏观粒子不同的物理化学性质，将其应 用于d n a 的分析中，尤其是作为d n a 的标记分子可以提高检测灵敏度，降低检 测限等。 m i r k i n 2 1 j 等人利用纳米金标记寡核昔酸探针建立了光度分析检测d n a 的新 方法。他们利用巯基修饰的寡核苷酸在纳米金上进行自组装形成纳米金标记物， 当与其配对的靶基因序列发生杂交配对后，就会形成网状的纳米金聚集物，从而 导致溶液颜色的变化，从杂交前的红色变成杂交后的蓝色，使得d n a 杂交的结 果可以通过简单的颜色变化来识别，而且灵敏度很高，检测限可达1 0f m o l 级。 该方法也可以基因检测芯片的形式在平板阵列上进行。 j o s e p h 矧等人利用电化学方法检测纳米会标记的d n a ，他们将抗生蛋白链霉 素固定于磁珠上用来固定生物素修饰的d n a 探针。当其与生物素修饰的靶基因互 补配对后，再利用生物素与固定着抗生蛋白链霉素的纳米金相结合，洗涤处理后， 形成“抗生素一生物素d n a 生物素抗生素纳米金”这样的生物复合物，对复合 物上的纳米金进行溶解后用计时电位法进行分析，进而可以对待测d n a 的量进行 检测。 方禹之1 2 4 1 课题组合成了一种新的c u a u 核壳型纳米粒子，并将其应用于大肠 杆菌毒素基因分析。他们利用低温法制备了一种以c u 为核，a u 薄层为壳的核壳型 纳米粒子，使之易与和寡聚核苷酸进行功能性聚合，这种核壳型c u a u 纳米粒子 通过5 一烷基硫醇标记到核苷酸上制备成纳米标记的寡核苷酸探针，而目标基因片 段通过静电吸附作用吸附在聚吡咯修饰的玻碳电极表面，当它与相对应的纳米 c u a u 核壳型纳米粒子标记d n a 探针互补杂交后形成含有纳米标记物的d n a 杂 交分子，将标记物中的纳米粒子溶解后用高灵敏的阳极溶出伏安法进行测定，可 以达到对目标基因测定的目的，检测大肠肝菌毒素目标基因的下限为5 0 p m o l l 。 1 3d n a 与小分子的作用模式 有机染料分子和d n a 相互作用的电化学研究及分析应用 小分子与核酸结合的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖环。核酸由平行堆 积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条由核苷酸链形成的大沟、小沟组成了 小分子识别的位点。通过对d n ae 大沟、小沟等小分子识别位点的研究，科学家 们发现金属配合物、药物和染料分子等d n a 靶向分子与d n a 的相互作用模式主要 有共价结合、非共价结合和剪切作用等三种形式陋j 。 ( 1 ) 共价结合 共价结合中包括d n a 与亲核试剂及亲电试剂的作用，小分子化合物与d n a 中的碱基、糖或磷酸形成共价键。临床上使用的烷化剂类抗癌药物1 2 q 主要是使 d n a 碱基烷基化，干扰d n a 的复制或r n a 的合成。如苯并二吡咯类抗癌药物 d u o c a y m y c i n 及其衍生物只能在d n a 小沟巾对a t 富集区识别，分子中活泼的 环丙烷基与小沟区内特定碱基序列中a 的n 3 共价结合后导致在该位点脱去嘌呤 2 7 - 2 8 。 ( 2 ) 非共价结合 小分子化合物与d n a 的非共价结合主要有静电作用( e l e c t r o s t a t i cb m d m g ) 、 沟槽结合( g m o v eb i n d i n g ) 和嵌插结合( i n t e r c a l a t i v eb i n d i n g ) 。 静电作用。由于d n a 的磷酸酯键带负电荷，可以与带正电的小分子发生 静电吸附作用，这种作用沿着d n a 双螺旋结构的外部进行，无选择性。通常认 为单纯的静电结合模式在作为药物的应用上价值不大，但是有些分子与d n a 的 静电作用对于其与d n a 的嵌插和沟槽作用起重要的稳定作用。 沟槽结合。即d n a 通过冗电子与碱基对芳香杂环发生堆积作用或者通过 氢键或范德华力沿d n a 双螺旋的沟槽与其官能团相互作用。d n a 双螺旋的大沟 和小沟在电场、氢键、空间效应、水化作用等方面有很大不同。很多蛋白质与 d n a 的特异性结合是通过d n a 大沟区作用，而有机小分子则多数在小沟区特异 性地识别d n a 双螺旋链并与之作用。典型的与d n a 小沟区结合的小分子含多个 简单的芳香环，这些环通过可自由扭转的键连接，随键的合适扭曲，取代水分子 进入小沟区，与双螺旋中沟区的碱基边缘通过范德华力形成接触。常见的以这种 作用与d n a 作用的分子有h o e c h s t3 3 2 5 8 、纺锤霉素等。实验发现，它们大都选 择性地结合在d n a 的a = t 富集区的小沟区。 嵌插作用。即小分子以平面或几乎平面的芳环嵌入d n a 双螺旋结构中， 这是芳环离域霄体系与碱基对的冗体系间的哥7 r 相瓦作用及疏水作用的结果。药 物分子多与d n a 发生嵌插作用。常见的抗癌药物如阿霉素、柔红霉素以及很多 6 青岛科技人学研究生学位论文 巾草药的有效成分都可以以嵌插方式与d n a 结合【2 9 1 。当d n a 靶向分子嵌入d n a 碱基对之间后，有的可以直接抑制d n a 复制与转录的功能：有的则在经过进 步活化后使d n a 断裂受损而影响其功能。 ( 3 ) 剪切作用 d n a 断裂在d n a 修复、转录及突变中是很重要的一个生物学过程。具 有剪切作用的分子特异性选择结合位点，并最终使d n a 链断裂。这类d n a 切割剂 中药物和金属配合物占了相当大的比例1 3 0 l 。博莱霉素【3 1 】( b l e o m y c i n ) 是一种典 型的d n a 切割化合物，其分子结构的特殊性使其能够识别并结合在d n a 中 5 - g c 3 序列的鸟嘌呤上，然后经一系列化学反应最终导致d n a 断链。b a r t o n 等【3 2 1 合成的r h z n 双核配合物，左边的蹦i ) 的配体插入d n a 大沟区【3 3 】，右边的锌肽起 水解酶的作用p 4 】，使超螺旋的p b r3 2 2d n a 断裂变成切口和线状两种形式；铜( i i ) 的邻菲咯啉类配合物1 3 5 】在巯基化合物和过氧化氢存在下可使d n a 于小沟槽区断 裂。这种双功能性对于设计人工核酸酶及发展有效的抗肿瘤药物具有非常重要的 指导意义。根据这“原理现在已有大量的研究把对d n a 具有剪切功能的分子与能 对d n a 序列进行特异性识别的分子连接起来，以合成序列特异性更高的人工核酸 酶或抗肿瘤药物。 很多小分子与d n a 的作用方式是是非单的，有时是几种作用方式共同起 作用的结果。小分子的结构，整个分子的形状、大小、柔性以及实验时温度、缓 冲溶液p h 、溶液离子强度等都会导致小分子与d n a 结合的方式不同f 3 6 1 。 1 4d n a 与小分子作用的研究方法 在研究小分子和d n a 相互作用的过程中，表征手段和研究方法是获得可靠 信息的关键。常用的分析方法主要有电化学法、光谱法、电泳和足印迹分析技术 及粘度法等。 ( 1 ) 电化学法 由于生物体系是一个充满电解质溶液的体系，绝大多数反应都发生在膜系统 的界面上，因而尽管存在许多物理和化学上的差异，电化学体系仍然是一个非常 好的生物体系模拟，是了解d n a 的理化性质的有效手段之一。对d n a 的电化学 行为的研究是实现d n a 电化学检测、d n a 传感器设计及研究d n a 与靶向分子 作用的基础。常用的电化学技术包括：循环伏安法和线性扫描伏安法 3 q ； 方波伏安法p 9 】；微分脉冲伏安法 4 0 l ：溶出伏安法【4 1 】；电致发光法1 4 2 l 等。 早在5 0 年代末，p a l e c e k 4 3 j 就研究了d n a 的交流示波极谱行为，发现变性的 7 有机染料分子和d n a 相互作用的电化学研究及分析应用 d n a 由于a 、c 的还原和g 的氧化分别产生一个阳极凹陷和个阴极凹陷，而 天然的d n a 由于在电极表面上结构的变化，经过多次扫描，也会产生一个凹陷。 b a r d l 4 4 - 4 6 1 等人系统研究了o s ( b p y ) 3 “、c o ( b p y ) 3 3 + 、f e ( b p y ) 3 3 + 、c o ( p h e n ) 3 3 + 、 f e ( p h e n ) 3 3 + 等会属配合物和d n a 的相互作用后发现，若e o 向负方向移动，则小 分子与d n a 发生静电作用；若e 0 向正方向移动，则小分子与d n a 发生嵌插作 用，这也成为电化学法研究小分子和d n a 相互作用时的重要依据。 李南强1 4 7 钠】等人在氨一氯化铵缓冲溶液中研究了卟啉与d n a 的相互作用，结 果发现加入d n a 前后电化学参数如标准速率常数k s ，扩散系数d 以及电荷转移 系数a 均无明显变化，因此推测卟啉与d n a 生成非电活性的配合物；并推导了 d n a 与卟啉结合常数结合比的公式，计算出在不同条件下d n a 可以和卟啉结合 生成i ：i 和1 ：2 的两种配合物。由于卟啉还原峰电流的下降与加入的d n a 在一定 的浓度范围内旱线性关系从而建立了以卟啉为电化学探针测定d n a 的方法。他 们还分别在悬汞电极和化学修饰的玻碳电极上研究了9 ，1 0 氨基蒽醌与d n a 的相 互作用，在悬汞电极上的研究表明中性和酸性环境中，9 ，1 0 氨基蒽醌与d n a 作 用后生成非电活性的的配合物导致的电流减小，但在碱性环境中，由于d n a 催 化了9 ，1 0 一氨基蒽醌的还原引起电流增人。峰电流的下降和增加值在一定范围内 部与d n a 的浓度在一定范围内呈线性关系。在9 ，1 0 氨基蒽醌修饰的玻碳电极上， d n a 与9 ，1 0 - 氨基蒽醌在中性和酸性环境作用后导致化学修饰电极的氧化峰和还 原峰的电流均减小，峰电位不变并且还原峰电流的下降值在一定范围内都与d n a 在一定的浓度范围内呈线性关系。在碱性环境中，化学修饰电极的峰电位负移了 2 0 0m v 且氧化峰和还原峰电流均增大，说明d n a 对9 ，1 0 氨基蒽醌有显著的双 相催化活性。 彭图治 s o - 5 2 1 等人采用循环伏安法和计时库仑法等电化学手段研究了更生霉 素、h o e s t3 3 2 5 8 、米托蒽醌等小分子和d n a 的相互作用并推导出不可逆电活性 分子与d n a 相互作用的电化学公式，可以便捷准确的计算d n a 与配体结合常数 和结合位点信息。 焦奎【”4 5 】等人筛选了大量的小分子探针如有机染料类的甲苯胺蓝、孔雀石绿 以及金属配合物c o ( b b t ) 2 c 1 2 等，研究了其与特定d n a 片段的识别作用，并进一 步用作d n a 传感器的杂交指示剂来检测转基因植物产品。 最近，d n a 生物传感器成为研究的热点【5 8 】，这是一种能将目标d n a 的存 在转变为可以测定的电、光等信号的传感装置。按照换能器的不同，可将d n a 生物传感器分为d n a 压电传感器、d n a 光学传感器和d n a 电化学传感器三大 类。d n a 电化学传感器工作原理是固定在电极上的单链d n a ( s s - d n a ) 与样品 8 青岛科技大学研究生学位论文 中与之互补配对的单链d n a 相遇时会发生特异性的分子杂交反应，通过研究杂 交前后反应体系的电流、电压等电化学信号的变化，可以对样品中d n a 的含量 和结构等信息加以测定。利用d n a 电化学传感器测定d n a 的整个过程包括以下 四个步骤：( d d n a 探针的固定，即将单链d n a 固定在电极表面，形成d n a 探 针：杂交反应，即将d n a 探针浸入含有目标d n a 溶液中，d n a 探针与目标 单链d n a 发生特异性的杂交反应形成d s d n a ；杂交的指示，即将杂交信号转 化为可以测定的电化学信号；电化学信号的检测。其中，d n a 探针的筛选、固 定以及杂交的指示是这类传感器的关键技术，研究小分子和d n a 的相互作用对 于筛选合适的杂交指示剂具有重要的意义。 h a s h i m o t o 5 9 ，删等人以h o e c h s t 3 3 2 5 8 作为杂交指示剂来检测金电极上利用化 学吸附法固定的d n a 片断。h o e c h s t3 3 2 5 8 能专一的作用于d n a 双螺旋的小沟 槽的a - t 碱基对，在线扫伏安法中，h o e c h s t3 3 2 5 8 的峰电流与d n a 浓度呈统线 性关系，其线性检出范围1 0 一1 0 ”g m l ，并已经成功用于乙肝病毒( h b v ) 临 床样品的检测。 k c r m a n i “ 等人在金电极上采用共价键合法固定上s s d n a 片段，以亚甲蓝为 指示剂，采用微分脉冲伏安法测定了非互补序列、单碱基错配的互补序列及互补 序列与探针s s 。d n a 杂交，发现杂交后电信号依次变小。 z h o u 6 2 , 6 3 】等人在氧化热解石墨电极上吸附d s d n a ，用r u ( b p y ) 3 3 + 和c o ( b p y ) 3 3 + ( b p y = 2 ，2 一b i p y r i d i n e ) 作为d n a 的氧化催化剂，采用方波极谱法测定受苯乙烯氧 化损伤的d n a ，可检测到0 1 的受损碱基； n a k a y a m a 6 4 1 等人在会电极上将具有氧化还原活性的二茂铁作为共价修饰 信号固定在在d n a 的57 磷酸端，采用夹心式杂交测定d n a 序列单碱基变异。 通过微分脉冲伏安法测定二茂铁氧化峰电流的变化，可成功区分完全匹配的d n a 序列和有个碱基变异的d n a 序列。可以检测到1 0 1 5 m o l 的靶d n a 。 ( 2 ) 光谱法 光谱法是研究小分子和d n a 相互作用的重要方法，主要包括紫外一可见吸收 光谱法、荧光光谱法、共振光散射法、圆二色谱和线二色谱法、核磁共振光谱质 谱法、x 射线晶体衍射法、红外光谱法等。 紫外可见吸收光谱法。紫外可见吸收光谱是研究小分子与核酸相互作用 的一种最方便、最常用的技术。d n a 中的碱基具有光学活性，在2 6 0 1 1 1 1 1 附近有特 征吸收峰，通常可以作为d n a 的定量方法，但与小分子作用后由于其吸收峰变化 较小而不作为重点研究对象。小分子与d n a 的相互作用会引起小分子吸收带的红 移( 蓝移) 现象或增色( 减色) 效应，根据b a r t o n l 6 5 的理论，若该体系吸光度减 9 有机染料分子和d n a 相互作用的电化学研究及分析应用 小、吸收带红移以及产生等吸收点是小分子与d n a 发生嵌插作用的标志，而单纯 的减色效应是由丁二小分子和d n a 之问产生静电作用的结果。 荧光光谱法。荧光光谱法由于具有高灵敏度而成为研究小分子与核酸相互 作用的主要手段。通常小分子自身的荧光性质在加入d n a 后发生猝灭或者增强效 应，说明其与d n a 发生了明显的相互作用，根据其荧光的变化可以获得反应的热 力学和动力学的数据。溴化乙锭( 】巳b ) 是应用最早，也是应用最广的荧光探针【1 7 删， 由于它可以插入到双链d n a 的碱基对之间，凼此当加入一定量的d n a 时，在 e b - d n a 复合物的荧光强度比游离e b 的荧光强度强得多。然而当有其它也能与 d n a 发生插入作用的配合物存在时，会与e b 竞争与d n a 的作用位点，e b d n a 的荧光强度将显著降低，因而e b 可作为配合物与d n a 作用的荧光探针。用e b 作 荧光探针，还可研究b e n d r i m e r s 的特异性结合位点【鲫，另外根据s c a t c h a r d 方程 可判定小分子与d n a 结合方式【6 扪。 共振光散射法。瑞利共振光散射技术是近几年来发展起来的具有高灵敏度 的测定d n a 的新方法。它的原理是基于冗堆积功能染料在d n a 表面组装产生强 烈的共振光增强效应并以此建立的d n a 分析方法。黄承志等人曾经以金属配合 物c o ( r i d 5 一p a d a b l 6 9 1 和有机染料分子如酚藏花红f 7 0 j 、天青a 7 1 】、天青b 1 7 2 1 等作 为共振光散射探针测定d n a ，检测限可达1 4n g m l 。 圆二色谱( c d ) 和线= 色谱( l d ) 法。圆二色谱是以高频变换的左旋或 右旋圆偏振光作为入射光，当光通过某一于性样品时，该样品对左、右旋圆偏振 光的吸收不同而建立起来的测定有机物构形、构象以及反应机理的方法。利用圆 二色谱可以利用d n a 在2 6 0n m 处的吸收来提供d n a 二级结构方面的有关信息， 确定d n a 的构象：而且对一些本身没有c d 信号，但在与d n a 结合后能产牛诱 导c d 的分子可以获取有关其结构的间接信息。将圆二色谱与电化学技术相结合 而建立的圆二色谱电化学法对于从分子层面上了解d n a 和小分子的相互作用的 机理以及d n a 构象的变化具有重要意义f 硎。线二色谱是采用与固定轴方向平行 或垂直的平面偏振光作为入射光来测定样品对平行和垂直方向偏振光的吸收曲 线，它可以快速区分经典的嵌插结合、沟槽结合和静电作用，并还可以获得小分 子结合在d n a 螺旋结构上时准确的方向信息及动力学数据【7 4 】。 核磁共振( n m r ) 和质谱法( m s ) 。n m r 能直接提供小分子与d n a 键 合的详细结构信息，并能够定量确定结合位点的化学变化，因此近年来用n m r 研究小分子与d n a 作用的报道也逐渐增多【7 5 1 。n m r 能表征药物与d n a 作用时 药物的构型和动力学性质变化，如它能揭示药物与d n a 作用时，d n a 分子是否 发生扭曲，并以此判断该药物是沟槽型键合药物还是插入型的药物。z h o u 7 6 1 等以 光度法和n m r 研究结果证明抗癌药物放射菌素d 以嵌插方式与寡聚核苷酸 1 0 青岛科技人学研究生学位论文 r d ( a t c g a t ) 2 作用。由于d n a 分子的n m r 光谱十分复杂，所以，目前一般仅 限于小片段d n a 与药物相互作用的n m r 研究，此方法的最大问题是谱图解析困 难，因此受到一定限制。 随着软电离技术的发展，质谱法以及液质联用技术在小分子与d n a 复合物 的结构分析中发挥着独特的作用1 7 7 1 ，该方法能灵敏快速地获得小分子与d n a 作 用的结合区域、结合位点数、亲和力以及非共价键结合方式等信息。 x 射线晶体衍射法。x 射线晶体衍射法结合分子动力学模拟计算可获得非 常详细的小分子与d n a 结合位点及结构变化的信息，以及相关的动力学数据， 因此它也是研究小分子与d n a 相互作用的有利工具。在测定小分子与d n a 相互 作用的光谱法中x r a y 晶体衍射晶体数据最为准确可靠，但存在培养药物d n a 复合物晶体的巨大困难而受到限制。 红外光谱法。红外光谱法在药物小分子与d n a 相互作用的研究中得到了 广泛应用，为从分子水平上了解药物一d n a 复合物的结构信息提供了有利t 具。 小分子与d n a 的共价结合比较容易从振动光谱加以区别，不同的d n a 组分在不 同的波数范围内有不同的红外吸收峰，因此通过d n a 指纹区的红外光谱可以判 断d n a 的构象，确定d n a 与小分子作用而引起的构象的变化。 ( 3 ) 电泳和足印迹分析技术 电泳及足印迹分析技术是生物学中用来研究小分子与d n a 相互作用最基本 的两种手段f 7 8 - 7 9 1 。凝