（遗传学专业论文）黑曲霉产单宁酶的研究和有机相中固定化黑曲霉细胞生物合成没食子酸丙酯的初探.pdf

兰兰查兰竺圭兰竺兰查：! ! ：兰 摘要 本研究以产单宁酶黑曲霉菌株为出发菌，通过诱变选育和产酶发酵工艺优化 来提高菌种产酶能力，然后对其进行细胞固定化，应用于有机相生物合成抗氧化 剂没食子酸丙酯( p r o p y lg a l l a t e ，p g ) 的研究。( 固定化细胞有机相生物合成p g 的 研究在国内外尚属首次，故本研究在学术上和实际应用中均具有重要意义。广， 在前人研究的基础上，构建出单宁酶酶活力测定方法：以p g 为底物，紫外 光区2 7 0 n m 为测定波长，通过没食子酸丙酯的浓度与吸光值之间的线性关系计 算出底物的减少量，从而测得单宁酶酶活力。咳方法快速简便、灵敏可靠，重复 性好、可信度高，适用于胞内单宁酶酶活力的测定。厂一“ 通过微波诱变与化学诱变相结合的复合选育，最终获得高产单宁酶的黑曲霉 l 2 l 菌株，产酶可达1 3 0 6 u m l 。旌摇瓶发酵条件下对该菌株的产酶工艺参数包括 单宁酸浓度、碳源、氮源、碳氮比、初始p h 值、转速和培养温度等因素进行研 究，而后采用l 2 7 ( 3 ”) 正交试验对上述7 个主要因素进行优化。在最优发酵条件 下，黑曲霉l 2 l 菌株可获得单宁酶酶活力2 2 5 8u m l 。t 通过6 种黑曲霉细胞固定化方法的综合对比，最终选用海藻酸钙包埋法。隧 于固定化细胞在菌丝生长和产酶方面均表现出滞后效应，因此对黑曲霉l 2 l 固定 化细胞产酶发酵条件中海藻酸钠浓度、c a c l 2 浓度、凝胶中孢予浓度、胶珠接种 量、单宁酸浓度和装液量这6 个因素进行研究，并采用l 1 8 ( 37 ) 正交试验进行优 化。优化后，黑曲霉l 2 1 固定化细胞不仅具有与游离细胞相似的前期产酶过程和 产酶峰值，而且还表现出比游离细胞更长的平衡期。广1 一 最后，将固定化黑曲霉l 2 l 细胞应用于有机相生物催化合成p g 。通过对反 应体系的选择以及合成工艺参数的初步优化，可获得2 0 左右的p g 产率。 关键词t 黑曲霉有机相海藻酸钙固定化黑曲霉细胞 单宁酶复合诱变生物合成没食子酸丙酯 童兰查兰! 圭兰竺丝查垒星! 竖垒! 墨 a b s t r a c t t h i sr e s e a r c ht h e s i sr e p o r t e dt h a tap r o d u c i n gt a n n a s es t r a i n ，a s p e r g i l l u sn i g e r t aw a s i m p r o v e db y m u t a t i o n s c r e e n i n g a n do p t i m i z a t i o no fi t sf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ；t h e na f t e rc e l li m m o b i l i z a t i o n ，a s p e r g i l l u sn i g e rc e l l sw e r ea p p l i e dt o b i o s y n t h e s i z ea n t i o x i d a n tp r o p y lg a l l a t e ( p g ) i no r g a n i cm e d i a s i n c es t u d yo np g b i o s y n t h e s i sb y i m m o b i l i z e dc e l li no r g a n i cm e d i aw a sf i r s tr e p o r t e dh o m ea n da b r o a d ， t h i sr e s e a r c hw o r kw a s m e a n i n g f u lb o t h i ns c i e n c ea n d a p p l i c a t i o n an e wm e t h o dt od e t e r m i n et a n n a s ea c t i v i t yw a se s t a b l i s h e d ，i nw h i c hp gw a s s e l e c t e da ss u b s t r a t ea n d2 7 0 h ma sm e a s u r ew a v e l e n g t h a c c o r d i n gt ot h el i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h ec o n c e n t r a t i o no f p ga n dt h ec o r r e s p o n d i n ga b s o r p t i o n v a l u e s ， t a m 、a s ea c t i v i t yw a sd e t e r m i n e df r o mt h ed e c r e a s i n ga m o u n to fs u b s t r a t e 。t h em e t h o d e x h i b i t e dn o to n l ys i m p l i c i t ya n ds e n s i t i v i t y , b u ta l s or e p e a t a b i l i t ya n da c c u r a c y i t w a s o n l yu s e d t od e t e r m i n et h ea c t i v i t yo fi n t r a c e l l u l a rt a n n a s e a h i g h y i e l d i n gt a n n a s em u t a n ts t r a i n ，a s p e r g i l l u sn i g e rl 2 1w a ss c r e e n e df r o m i t sp a r e n ts t r a i nb yc o m b i n i n gm i c r o w a v ei r r a d i a t i o nw i t hc h e m i c a li n d u c i n g ，a n di t s f i n a lt a n n a s ea c t i v i t yw a s13 0 6u m 1 i t sf e r m e n t a t i o np a r a m e t e r si ns h a k i n gf l a s k s w e r es t u d i e d ，i n c l u d i n gc o n c e n t r a t i o no ft a n n i c a c i d ，c a r b o ns o u r c ea n dn i t r o g e n s o u r c ew i t ht h e i r p r o p o r t i o n ，i n i t i a lp hv a l u e ，a g i t a t i o ns p e e da n di n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e ，e t c a b o v e s e v e nf a c t o r sw e r e o p t i m i z e dw i t hl 2 7 ( 3 ”) o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t u n d e r t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ea c t i v i t yo ft a r m a s ef r o m a s p e r g i l l u s n i g e rl z tw a s 2 2 5 8u m 1 a f t e rc o m p a r ew i t hf i v ek i n d so fc e l li m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s ，c a l c i u ma l g i n a t e e n t r a p m e n tw a sa d o p t e dt oi m m o b i l i z ea s p e r g i e u sn i g e rl 2 tc e l l s f o ri m p r o v i n g h y s t e r e s i s e f f e c ti n m y c e l i u mg r o w t ha n dt a n n a s ep r o d u c i n g ，t h ef e r m e n t a t i o n p a r a m e t e r sa b o u ta s p e r g i l l u sn i g e rl 2 ti m m o b i l i z a t i o nc e l l sw e r es t u d i e d ，i n c l u d i n g c o n c e n t r a t i o no fs o d i u ma l g i n a t e ，c a c l 2a n d s p o r e s ，i n o c u l a t i o na m o u n to f g e lb e a d s ， c o n c e n t r a t i o no ft a n n i ca c i da n dm e d i u mv o l u m ei n s h a k i n gf l a s k s ，e t c a b o v es i x f a c t o r sw e r ef u r t h e r o p t i m i z e db yl 1 8 ( 37 ) o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t u n d e rt h e s e o p t i m u mc o n d i t i o n s ，i m m o b i l i z e da s p e r g i l l u sn i g e rl 2 1c e l l se x h i b i t e dn o t o n l y e n z y m e - p r o d u c i n g e a r l i e ra n d e n z y m ep e a kv a l u es i m i l a rt ot h a to ff r e ec e l l s b u ta l s o s t a t i o n a r yp h a s el o n g e rt h a nt h a to f f r e ec e l l s a tl a s t ，i m m o b i l i z e d a s p e r g i l l u sn i g e rl 2 lc e l l sw e r ea p p l i e dt ob i o s y n t h e s i z ep g i n o r g a n i cp h a s e a f t e rr e a c t i o ns y s t e mw a ss e l e c t e da n d s y n t h e s i sp a r a m e t e r s p r e l i m i n a r yw a so p t i m i z e d ，a b o u t2 0 p r o d u c t i o np e r c e n to fp gw a so b t a i n e di nt h e o r g a n i cm e d i a i i 浙江大掌硕士掌位论文a b s t r a c t k e y w o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e r ，o r g a n i cm e d i a ，c a l c i u ma l g i n a t e ，b i o s y n t h e s i s i m m o b i l i z e d a s p e r g i l l u sn i g e rc e l l s ，t a r m a s e ，c o m p l e xm u t a t i o n p r o p y lg a l l a t e i i i 堂兰查兰垩圭兰竺篁查 一：! ! ：兰 第一章绪论 单宁是一类称为鞣料植物的特定植物类群中所富含的天然多酚类物质，其提 取物商业上称为拷胶“。由于具有与蛋白质、生物碱、重金属、碱土金属等结合 生成不溶性化合物的独特理化性质，单宁已成为国民经济中不可缺少的林化产 品。医药工业中，单宁是制造抗菌增效剂( t m p ) 的主要原料，还可作为止泻剂； 石油工业中，单宁用于石油钻井的泥浆处理剂和水泥凝结的缓冲剂；食品工业中， 单宁作为酒类澄清剂；印染工业中，单宁是合成纤维的优良固色剂和媒染剂；轻 化工业中，单宁是制造兰黑墨水、照相显影药品、鞣革、塑料制品、环氧树脂等 的重要原料；国防工业中，单宁与铅盐配制可作为火箭和喷气式飞机燃料的稳定 剂 2 l 。此外，单宁还可用作锅炉用水的软化剂，对锅炉除垢、提高热效率和延长 使用寿命有显著效果。但其最显著的用途莫过于在制革工业中用作鞣皮的药剂， 其鞣革性能极其优越，迄今仍未有一种物质能够超越。 植物界除藻类、菌类、地衣以及苔藓不含或极少含有单宁外，大多数植物均 含有单宁。据初步统计，我国的鞣料植物就达3 0 0 余种，涵盖蕨类、裸子植物和 被子植物中的各个纲目科属。按其水溶性质，单宁可划分为： 水解性单宁此类单宁水解后大部分生成没食子酸，它是由没食子酸及 没食子酸衍生物的糖酯或甙组成。这种水解性单宁在植物的虫瘿中含量最高，如 五倍子单宁( c h i n e s eg a l l o t a n n i n ) 。通常所说的单宁酸( t a n n i ca c i d ) 就是指五倍 子单宁。 凝缩类单宁又称儿茶单宁类，此类单宁不具有酯的结构，而是由碳与 碳直接相连，故不能水解，如儿茶单宁。 混合类单宁此类单宁既含有水解类成分，又含有凝缩类成分，如榔栎 皮中的单宁。 单宁酸没食子酸 r 和r 代表没食子酸根 或二聚没食子酸根 h 尽管单宁能使大多数的蛋白质凝固沉淀，是一种常用的蛋白质凝固去除剂， 但单宁酶( t a r m a s e ) 却是一个例外。单宁酶全称为单宁酰基水解酶( t a n n i na w l h y d r o l a s e ，e c3 1 1 2 0 ) ，是一种细胞膜结合酶，可分泌到胞外，能水解水解性 单宁和没食子酸酯类中的酯键和缩酚酸键，从而生成没食子酸和葡萄糖及相应的 塑兰查兰! 圭兰竺丝查2 1 = 兰 醇类化合物 3 ， q o 早在1 7 8 6 年，s c h e e l e 等首次发现单宁酶的存在p i 。直至2 0 世纪6 0 年代， 单宁酶的研究才开始围绕其在茶饮料工业中的应用而迅速展开。日本、美国和印 度等酶制剂工业发达的国家，单宁酶的基础理论和应用研究开展得较早，己取得 了不少的研究成果，并使单宁酶在茶饮业应用中产生巨大的经济效益。我国的单 宁酶研究始于9 0 年代，同样是围绕在茶饮业中应用逐渐开展的。此外，人们还 在皮革业、饲料业、化妆品业等领域中开发单宁酶的多种用途。随着国民经济的 不断发展，人们生活水平的不断提高，单宁酶势必将获得前所未有的广泛应用。 1 1 单宁酶的性质 1 1 1 单宁酶的物理化学性质 纯单宁酶的外观为白色或淡黑色粉末状，可溶于水形成无色澄清的溶液，不 溶于乙醇。单宁酶在紫外光区2 8 0r l l y l 处有一个最大吸收峰，当浓度为1 0 ，比 色皿规格为l c m l c m 规格时，单宁酶的吸光系数q 为1 1 8 ，2 6 0 r i m 处吸光度与 2 8 0 n m 处吸光度之比为0 5 l p j 。 s a d a a k ii i b u c h i 等1 6 ( 1 9 6 8 ) 和c h a es o o k y u 等i7 j ( 1 9 8 3 ) 分别采用凝胶过 滤法测定出他们各自选育的曲霉菌株所产单宁酶的相对分子质量均为2 0 0 ，0 0 0 。 o s a oa d a c h i 等【5 j ( 1 9 6 8 ) 分别采用沉降法和电泳法测定黄曲霉单宁酶的相对分 子质量，分别是1 9 4 ，0 0 0 和1 9 2 ，0 0 0 。k e 蛳a o k i 等徊j ( 1 9 7 6 ) 研究发现来源于酵 母的单宁酶相对分子量为2 5 0 ，0 0 0 。b a r t h o m e u f c 等【9 j ( 1 9 9 4 ) 测出黑曲霉l c f 8 菌株所产单宁酶的相对分子质量为1 8 6 ，0 0 0 ，其等电点为4 3 。b a r t h o m e u f c 等和 c h a es o o k y u 等在对各自提纯的单宁酶进行s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳分析后 发现，单宁酶分子是由2 种亚基组成。但该结果与k e n i ia o k i 等( 1 9 7 6 ) 对酵母 单宁酶结构分析的结果有所不同，后者用同样的方法却只得到一条电泳蛋白带。 b e v e r i n im 等l l o j ( 1 9 9 0 ) 从米曲霉中提取制备出商品化单宁酶粉末，研究发现可 分离为2 个同工酶：单宁酶1 可降解含有酯键的多聚没食子酸衍生物，单宁酶2 可亲和二聚没食子酸并专一地水解多聚没食子酸衍生物。f a r i a s g m 等【l l 】( 1 9 9 4 ) 对c r y p h o n e c t r i a p a r a s i t i c a 所产的单宁酶进行研究，结果发现其单宁酶是一个四 聚体，每个单体的相对分子量为5 8 ，0 0 0 ，总相对分子量为2 4 0 ，0 0 0 。h a t a m o t o0 等i l2 j ( 1 9 9 6 ) 研究发现米曲霉所产的单宁酶是由两个分子量分别为3 0 ，0 0 0 和 3 3 ，0 0 0 的亚基通过二硫键交联而成，而米曲霉天然单宁酶则是一个由4 对大小亚 基所组成的异质八聚体，分子量约为3 0 0 ，0 0 0 。n i e h a u sj u 掣1 3 1 ( 1 9 9 7 ) 从植物 p e d u n c u l a t eo a k ( 橡树) 叶子中提取出单宁酶，经凝胶过滤法测出其分子量分别 为1 5 0 ，0 0 0 和3 0 0 ，0 0 0 ，采用s d s - p a g e 法测出其单一多肽带的分子量为7 5 ，0 0 0 ， 由此得出该天然单宁酶是由相同亚基的二聚体或四聚体组成。郭鲁宏等 1 4 1 ( 1 9 9 9 ) 对黑曲霉所产的单宁酶进行研究，结果发现其相对分子量为5 8 ，0 0 0 ，其 等电点为4 1 ，这与上述的某些研究结果相一致。王征等【1 5 】( 2 0 0 1 ) 对从黑曲霉 中提取的单宁酶用s d s - p a g e 法测得该酶也是由2 种亚基组成，其相对分子量 分别是7 5 。9 0 0 和6 0 。3 0 0 。 一2 - 童兰垒兰翌圭兰竺丝至 一一：! ：篓 0 s a oa d a c h i 等5 ( 1 9 6 8 ) 进一步研究黄曲霉单宁酶的结构特性，测得其分 子中氮含量为1 2 9 。另用二硝基氟苯( d n p ) 法测定单宁酶的n 末端，发现 有2 个d n p 一氨基酸产物，分别为d n p a l a 与d n p a r g ，这进一步表明黄曲霉单 宁酶是由2 种亚基组成。单宁酶另一重要的生化特性就是：它是一种糖蛋白，且 不同来源的单宁酶糖含量有所差异。y a m a d ah 等1 5 ( 1 9 6 8 ) 研究黄曲霉单宁酶 的糖基占总相对分子质量的2 5 ，糖基为甘露糖。b a r t h o m e u f c 等p 1 ( 1 9 9 4 ) 从 黑曲霉中提取的单宁酶，其糖基含量可达4 3 ，而酵母单宁酶的糖基含量更高 达6 2 ，并另含有2 2 的氨基己糖【1 6 j 。王征等 1 5 j ( 2 0 0 1 ) 研究中黑曲霉单宁酶 的糖基含量只有1 2 3 。p a r t h a s a r a t h y n 等【1 7 】( 1 9 7 6 ) 研究发现其选育的黑曲霉 所产单宁酶的糖基为葡萄糖和甘露糖，肽链通过丝氨酸和苏氨酸与糖基相连接。 目前，有关糖基与酶的功能关系研究尚未见报道。 1 1 2 单宁酶的酶学性质 p h 稳定温度稳定 研究者产酶的菌种最适p h 值最适反应温度 范围范围 y a m a d ah 等1 3 】 a s p e r g i l l u s 5 0 5 550 h 5 56 0 5 0 6 0 ( 1 9 6 8 )加v w s a d a a k il i b u c h i 等 6 】 a s p e r g i l l u s 4 5 6 05 53 0 3 0 4 0 ( 1 9 6 8 ) o r v z a e k e n j i a o k i 等【8 】 c a n d i d as p3 5 756 04 0 5 0 ( 1 9 7 6 ) r a j a k u m a rg s 等 p e n 衄i l l i u m 4 o 6 55 0 6 03 0 3 0 4 0 0 8 1 ( 1 9 8 3 )c h r y s o g e n u m f a r i a sg m 等【1 9 1 c r y p h o n e c t r i a 5 53 0 ( 1 9 9 2 )p a r a s i t i c a b a n h o m e u f c 等【9 】 a s p e r g i l l u s 35 8 06 05 0 3 5 ( 1 9 9 4 ) n i g e r n i e h a u sj u 等p e d u n c u l a e 3 8 7 84 、3 5 、05 5 3 5 4 0 ( 1 9 9 7 ) o a c 郭鲁宏等【14 】( 1 9 9 9 ) a s p e r g i l l u s 4 o 6 055l o 3 0 3 0 m g e r s h a r m as h w e t a 等【2 0 】 a s p e r g i l l u s 6 06 0 ( 1 9 9 9 ) m g e r 刘如石等 2 1 1 ( 2 0 0 0 ) a s p e r g i l l u s 3 5 6 55 o 5 53 0 4 0 m g e r m o n d a lk c 等【2 2 1b i l l u s ( 2 0 0 0 )l i c h e n i f o r m i s 5 7 56 0 m o n d a lk c 等【2 3 】 a s p e r g i l l u s ， 3 5 6 0 4 5 ( 2 0 0 1 )p e n c i l l i m m5 0 3 0 6 0 4 0 王征等【15 1 ( 2 0 0 1 ) a s p e r g i l l u s 4 0 7 05 0 2 5 2 6 4 0 m g e r 塑兰查兰堡圭兰竺丝查! ! ：兰 e 表中，y a m a d ah 等( 1 9 6 8 ) 报道的黄曲霉单宁酶活性的p h 稳定范围最 窄，为5 0 5 5 。c h a es o o - k y u 等2 4 i ( 1 9 8 3 ) 报道的曲霉a n 一1 1 菌株所产单宁 酶活性的p h 稳定范围为5 0 6 5 。总而言之，多数菌株的单宁酶活性p h 稳定 范围大都是在3 0 8 0 之间，最适p h 值为4 o 6 0 ，热稳定范围在6 0 7 0 。c 以 下，最适反应温度为3 0 6 0 。 来源于不同菌株的单宁酶动力学性质稍有区别。y a m a d ah 等p 1 ( 1 9 6 8 ) 就 底物浓度对黄曲霉单宁酶的影响进行研究，测出k 。( 以单宁酸为底物) 为0 5 1 0 - 4 m o l l ：k 。( 以葡萄糖一1 一没食子酸为底物) 为1 4 1 0 - 4 m o l l ；k 。( 以 没食子酸甲酯为底物) 为8 6 1 0 4 m o l l 。r a j a k u m a rg s 等 1 8 】( 1 9 8 3 ) 测得产 黄青霉所产的单宁酶以单宁酸为底物时，其k 。为o 4 8 1 0 - 4 m o l l 。f a r i a sg m 等【“1 ( 1 9 9 4 ) 测得c r y p h o n e c t r i a p a r a s i t i c a 所产的单宁酶以单宁酸为底物时，其 k 。为0 9 5 1 0 一m o l l ；以栗木单宁为底物时，其k 。为5 0 7 1 0 。m o l l ；而以 没食子酸为底物时，其k 。高达1 1 o 1 3 1 1 0 m o l l ，故没食子酸是单宁酶底 物中最具竞争性抑制的底物之一。由此他们得出结论，单宁酶对特定的单宁底物 的相对酶活可能是与该底物中酯键和缩酚酸键的数量有关。s h a r m as h w e t a 等睇o j ( 1 9 9 9 ) 测得黑曲霉所产的单宁酶的k 。为o 2 1 0 m o i l 。 有关各种金属离子以及e d t a 对单宁酶活性影响的报道结论不一。k e a o k i 等【8 ( 1 9 7 6 ) 研究表明z n c l 2 、c u s 0 4 、c o c l 2 和n i s 0 4 等不同的金属离子对 单宁酶酶活力无影响，而e d t a 对酶活力影响不明显。相反，r a j a k u m a rg s 等( 1 9 8 3 ) 研究表明c u 2 + 、z n 2 + 、f e 2 + 甚至是m 9 2 + 等不同的金属离子均对单 宁酶酶活力有着显著的抑制效应。同样，s a d a a k ii i b u c h i 等【6 j ( 1 9 6 8 ) 研究表明 任何金属盐均不能激活单宁酶，z n c l 2 和c u c l 2 则会抑制酶活力或使酶失活。此 外，e d t a 溶液也会使单宁酶完全失活。郭鲁宏掣1 4 】( 1 9 9 9 ) 研究发现除了m n 2 + 和f e 2 + 抑制单宁酶酶活之外，其它金属离子则对酶活均无明显的激活作用或抑制 作用。 1 1 3 单宁酶的分子生物学研究 目前，有关单宁酶分子生物学的研究还尚不多见。1 9 9 6 年，h a t a m o t oo s a m u 等【l2 】从单宁酶高产的米曲霉t h 菌株中提取到纯化的单宁酶蛋白，根据其n 端 和中间若干肽链段的氨基酸序列合成了三个不同的寡脱氧核糖核苷酸 ( 0 1 i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e ) 探针。经过反转录、c d n a 体外扩增后，他们最终 克隆出单宁酶的完整基因序列。研究发现，单宁酶基因中没有内含子，它可编码 一个含有5 8 8 个氨基酸残基、分子量约为6 4 ，0 0 0 的蛋白质( 包括一个含有1 8 个 氨基酸残基的信号肽) 。同时，他们将含有单宁酶基因的p t 质粒转入到单宁酶 低产的米曲霉a 0 1 菌株中，结果发现其所产单宁酶酶活力与转入的拷贝数量成 正比。研究还发现单宁酶是由两个分子量分别为3 0 ，0 0 0 和3 3 ，0 0 0 的亚基通过二 硫键交联形成，这两个大小亚基正是由单宁酶基因的前后两部分分别编码而成， 其转录后再经过翻译后修饰( p o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n ) 最终形成单宁酶。 进一步研究表明具有活性的米曲霉天然单宁酶是一个由4 对大小亚基所组成的 异质八聚体，分子量约为3 0 0 ，0 0 0 。单宁酶基因的表达模型如下f 1 2 1 ： - 4 一 兰兰查兰竺圭兰竺丝查= = 丝 另外，d o is e n i j i 等口5 1 ( 1 9 7 3 ) 从基因表达调控方面对米曲霉产单宁酶进行 研究，结果表明指导单宁酶生物合成的m r n a 极不稳定，放线菌酮( a c t i n o n e ) 等可迅速阻止单宁酶的合成。 1 1 4 单宁酶的催化作用机理 1 9 7 2 年，s a d d a k ii i b u c h i 等【2 6 】对米曲霉单宁酶的催化途径、底物的专一性和 阻遏作用进行详细研究。结果表明，单宁酶可催化单宁酸中的梧酸葡萄糖酯，水 解生成没食子酸与葡萄糖。中间水解产物为l ，2 ，3 ，4 ，6 一黄桔酰单宁和2 ，3 ，4 ，6 一四桔酰单宁以及两种单体没食子酸葡萄糖。其反应途径如下页所示： 单宁酶只能水解没食子酸酯类化合物，而对底物类似物如甲基间二羟甲酸盐 不起作用。单宁酶对底物是否具有催化作用是取决于其e s 复合物是否形成。单 宁酶e s 复合物形成条件【2 6 】：底物必须是没食子酸所形成的酯类，而对醇没 有限制；底物中苯环上酚羟基的相对位置不同，将影响到底物与酶的结合作 用；e s 复合物中酚羟基形成的酯键可被水解，而其他酯键或羧基由于没有直 接与酶结合，故不能发生水解反应。因此，单宁酶酶促反应受到含有酚羟基的底 物类似物的竞争性抑制，但2 ，6 一二羟基苯甲酸例外，它产生非竞争性抑制。综 上所述，尽管与单宁酶结合的底物都是没食子酸酯类化合物，但由于酶与底物结 合位点的不同，单宁酶会对某些酚羟基底物起作用，而对另些底物类似物不起 作用。 塑兰查兰丝兰兰竺兰圭! 丝 j 一7 h c l h c i h c o r 2 c h o h c 一0 o c h h c o h c o h h 。c - - o i v r 1 ：一0 c r 1 h c o r 1 i i r 1 一 h o o c hr 2 ：一o c c h o h c o r 1 0 c h h c o r 1 h c o h h c o r 1 i i i c h o h c o h h 0 一c h o h+h 亡o h h c o h h c o h h i 单宁；1 ，2 ，3 ，4 ，6 一黄桔酰单宁；2 ，3 ，4 ，6 一四桔酰单宁；没食子酸葡萄糖 1 2 单宁酶酶活力测定方法 尽管单宁酶的研究至今已近半个世纪，其酶活力的测定方法却始终没有统 一，造成不同来源的酶活力值之间难以相互比较。在众多的单宁酶研究文献中， 研究人员为了满足各自研究的需要，选用不同的底物、不同的测定参数，以底物 的减少或产物的增加甚至是p h 值改变等作为测定对象，构建出各具特色的单宁 酶酶活力测定方法。这些测定方法大致归类为滴定法、分光光度法、比色法和高 效液相色谱法等，以下是上述测定方法基本原理的简述： 1 2 1 滴定法 由于单宁酸在单宁酶作用下可分解生成游离的没食子酸，故可用碱( n a o h ) 进行滴定，以测定底物单宁酸的减少量来测得酶活力，但测定体系中缓冲液对碱 的缓冲作用以及单宁酸自身的棕褐色均会干扰滴定终点的确定：另外，随着体系 中p h 值的增高，单宁酸将逐渐水解。上述原因直接影响测定结果的稳定性和准 确性【2 7 l 。 - 6 - i ，毋 一 1 2 2 紫外分光光度法 1 9 6 7 年，s a d a a k il i b u c h i 等 2 7 】首创了紫外分光光度法，其基本原理是根据紫 外光区3 1 0n m 下底物单宁酸在酶促反应前后的光密度变化，计算单宁酶酶活力。 该方法已成为单宁酶酶活力测定的经典方法，简便快捷，误差在l 3 之间， 但对底物单宁酸纯度的要求非常高。 王征等 2 8 1 ( 1 9 9 5 ) 在s a d a a k ii i b u c h i 建立的紫外分光光度法基础上，改用食 品抗氧化剂没食子酸丙酯( p r o p y lg a l l a t e ，p g ) 代替单宁酸，作为单宁酶酶促反 应的底物，在2 7 0n m 下测定底物p g 反应前后的光密度变化，计算单宁酶酶活 力。该方法较前者而言，保持原有操作简便快捷、结果重复性好的优点，且其反 应底物p g 非常容易获取。g i l l e si a c a z i o 等1 2 9 j ( 2 0 0 0 ) 采用自己合成的原儿茶酸 对硝基苯酯( p r o t o c a t e c h u i ca c i d p n i t r o p h e n y le s t e r ) 代替单宁酸，作为单宁酶酶 促反应的底物。在3 5 0n m 、p h 口o；d】o口 仰蚰 童兰查竺堡圭竺竺丝查 一! ! i ! 兰 根据上述直线回归方程，对照管没食子酸丙酯浓度应为1 0 0 3 2a n + 1 3 1 1 1 ，测定管没食子酸丙酯浓度则为1 0 0 3 2 a _ + l _ 3 1 l l 。按照2 1 5 5 中单宁酶活力的定义，其计算公式如下： ， u m l = ( f 1 0 0 3 2 aq 4 - 1 3 1 1 1 - ( 1 0 0 3 2 a 目+ 1 3 1 1 1 ) 】1 0 。1 0 3 x 1 0 1 0 8 6 - - 1 = 1 0 0 3 2 ( ah - - a ) 6 = 6 0 1 9 2 ( a 目一a _ ) 6 0 2 ( ah a 日) 6 0 2 a * 一 2 2 4 单宁酶活力测定方法的比较 该酶活力测定方法构建过程中得到湖南农业大学理学院王征老师的 指导和帮助。采用王征老师的的黑曲霉1 和本实验室的黑曲霉t a ，按 照所构建的方法进行单宁酶活力测定，并与王老师所提供的原始数据( 胞 内酶酶活) 进行比较，以考察构建的方法的可信性和准确性。王征老师的 原始数据是以a 。一。直接作为酶活力单位来定义的，故本章以下的酶活力 数据均取值于a 。- 捌，以便数据比较。 t i m e ( h o u r ) f i g 2 3 t a n n a s e k i n e t i c c o u r s e so f a s pn i g e r la n d t a 图2 3 黑曲霉i 1 和1 a 产酶过程曲线 图2 3 中可见，黑曲霉1 产酶过程的5 个时间点中，就有3 个时间 点上的原始数据值与当前测定值非常吻合，分别是4 8 h ( 0 2 1 3 ，o 2 0 4 ) 、 7 2 h ( o 3 1 6 ，0 3 2 4 ) 和9 6 h ( 0 1 8 1 ，0 1 8 4 ) ，差异均在0 0 1 以内不到测定 值的5 ，且较高酶活力时间点均位于7 2 小时。而其余2 个时间点上均存 在着一定的差异，但鉴于这两个点分别位于产酶过程的始末两端，且两条 产酶曲线非常相似，故不作考虑。此外，以当前所构建方法测定的黑曲霉 t a 的产酶过程中，也表现出与上述两个产酶过程相似的产酶曲线，并出 现较高的酶活7 2 小时( o 2 5 2 ) 。由此，表明本课题组所构建的单宁酶 活力测定方法可信、准确。 2 0 兰兰查兰丝圭兰竺丝查! 三! 兰 2 2 5 单宁酶活力测定方法的适用范围 表2 1 胞外与胞内单宁酶活力的比较 t a b l e2 1c o m p a r i s o no f e x t r a c e l l u l a ra n di n t r a c e l l u l a rt a n n a s ea c t i v i t y e x t r a c e l l u l a rt a n n a s e ( od ) i n t r a c e l l u l a rt a n n a s e ( 0d ) 0 9 7 2 0i m l 一1 0 r a l0 9 1 4 0 9 8 7 0 8 7 6 0 8 1 0 0 8 8 7 0 0 9 6 0 1 0 4 0 1 0 0 0 3 0 0 0 3 0 3 0 2 9 3 0 2 6 9 0 2 6 1 0 2 5 4 o 0 3 1 0 0 4 2 0 0 3 9 单宁酶活力测定步骤中最后步，反应液稀释1 0 倍( 1 m l 一1 0 m 1 ) ， 旨在将待测溶液的p g 浓度控制在0 1 0 0 “m 范围内，使其对应的吸光 值位于o 1 之间。表2 1 数据表明，当稀释倍数为1 0 倍和2 0 倍时，胞 外单宁酶的对照管a c 值和测定管a m 值均表现出 1 ，已处于2 3 之间， 由此而得的酶活力a c m 值的可信度大大降低。随着稀释倍数增加至2 0 倍( 0 5 m l 一1 0 m 1 ) 后，a c m 值、a c 值和a m 值均出现大幅度的降低， 尤其酶活力a c m 值下降幅度极显著( 8 0 9 0 ) ，这与其稀释倍数相应 增大密切相关，也与稀释倍数增加而引起的误差增大有关。稀释倍数为 1 0 0 倍时，a c 值和a m 值降至o 1 之间，但由于稀释倍数过大造成的误 差值增大，因此a c m 值的可信度也不高。因此，将反应液稀释控制在1 0 倍( 1 m l 一1 0 m 1 ) ，使a c m 值、a c 值和a m 值的误差均不超过2 ，这表 明该方法在测定胞内单宁酶酶活力时具有很高的精确度。 咎其原因，由于胞外单宁酶的提取，无法象胞内单宁酶提取那样几乎 完全除去单宁酸等干扰物质，胞外单宁酶提取液中往往含有比p g 浓度高、 具有与p g 相似吸收波长的物质如培养基中的单宁酸和水解产物没食子酸 及杂蛋白等干扰物质，干扰p g 吸收光谱( 额外增加对特征光谱的吸收) 。 尽管s a d a a k ii i b u c h i 等 2 7 1 研究中单宁酸的特征吸收波长是3l o n m ，但其所 用的单宁酸是经过多次提取的纯品。而事实上多数研究中的单宁酸均为粗 品，其特征吸收波长介于2 7 0 2 9 0 n m 之间，就会不可避免地干扰p g 的 吸光值。综上所述，该测定方法适用于测定胞内单宁酶酶活力，而不适用 于测定胞外单宁酶酶活力。因此，本论文的单宁酶酶活力均是指胞内单宁 酶酶活力。 2 2 6 黑曲霉1 和t a 菌株产酶活力的比较 图2 4 中可见，黑曲霉t a _ 乖1 1 n 0 1 菌株在基本培养基中产酶过程的变 化趋势大致相似：2 4 h 酶活力较低，经过4 8 h 的过渡后，酶活力在7 2 h 升 至最大值，而后9 6 h ，1 2 0 h 酶活力缓慢降低。两者在优化的h n a u 培养 基中也表现出相似的产酶变化曲线( 图2 3 ) 。此外，t a 菌株( 0 1 0 3 ) 酶 - 2 1 兰兰奎兰堡圭兰竺兰至；二矍三兰 活力明显低于1 菌株( o 1 5 4 ) ；t a 菌株在基本培养基中最大酶活( o 1 0 3 ) 力，远低于在h n a u 培养基中的酶活力( o 2 5 2 ) 。正因为如此，有必要通 过菌株诱变选育和发酵条件优化大幅度提高黑曲霉t a 菌株生产单宁酶的 t i m e ( h o u r ) f i g 2 4t a n n a s ec u l t u r ec o u r s e so f a s p n i g e rt aa n dn o 1i nb a s a lm e d i u m 图2 4 黑曲霉t a 和1 菌株在基本培养基中产酶过程 2 3 小结 ( 1 ) 在本文中所构建的单宁酶活力测定方法中，底物为没食子酸丙酯，其 特征吸收波长为2 7 0 n t o ，当底物浓度在o 1 0 0 um 范围内，其对应的 吸光值介于o 1 之间，两者具有显著的线性相关。 ( 2 ) 单宁酶酶活力的计算公式为u m l = 6 0 2 a # 一。 ( 3 ) 该测定方法不仅具有快速简便、灵敏可靠和重复性好等优点，而且对 底物p g 的纯度以及实验仪器的要求不高。同时，设置对照平行管可 消除来自培养基的单宁酸等干扰物质对测定的影响。因此，该方法测 得的酶活力数据可信、准确，且适用于测定胞内单宁酶酶活力，但不 适用于胞外单宁酶酶活力的测定。 一2 2 兰兰查兰竺耋兰篓丝查 一兰三兰 第三章微波诱变与化学诱变相结合 选育单宁酶高产菌株 单宁酶主要是由曲霉属真菌产生，其中以黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 研究和 应用得最为广泛9 ，2 0 ，2 8 , 3 4 3 6 ，5 3 , 5 ”。黑曲霉作为单宁酶的生产菌，国内外学者对其 理化特性、菌种选育、菌株生长条件等诸多方面进行了长期大量的研究，但其产 酶性能均不甚理想，直接从自然界筛选获得的野生黑曲霉产酶能力无法满足实际 生产的需要。另外，通过基因克隆菌株大量生产微生物单宁酶的技术也尚未完善 【1 2 。因此，在产单宁酶的野生黑曲霉菌株的基础上，采用诱变育种的方法来提 高单宁酶活性和产量，不失为一种简单、快捷、经济的可行方法。我们借鉴李永 泉副教授有关微波诱变结合化学诱变选育酸性蛋白酶高产菌的经验咿“，通过设 计出特殊