（生理学专业论文）南方鲇延髓面叶γ氨基丁酸a受体的特性分析.pdf

中山大学硕士学位论文 南方鲇延髓面叶y 氨基丁酸a 受体的特性分析 专业：生理学 硕士生：陈笑霞 指导教师：龙天澄副教授 摘要 南方鲇是一种具有发达味感觉系统的鱼类，其头部皮肤味蕾接受的味觉信号， 通过传入神经进入中枢，在延髓面叶转换神经元。南方鲇延髓面叶这一神经核团 构成味觉信息处理的基本神经中枢，通过神经递质与神经网络的突触联系，面叶 神经中枢对味觉传入信号进行了初级的信息编码与处理，并与味觉的高级中枢和 摄食行为相关联。本论文首先利用高效液相色谱法对南方鲇延髓面叶神经核团中 的多种氨基酸类中枢神经递质的含量进行了检测分析，结果表明，与南方鲇含有 大量结构蛋白质氨基酸的肌肉组织相比较，面叶神经细胞中含有较多的y 一氨基丁 酸( g a b a ) 和谷氨酸( g i u ) ，因此认为南方鲇面叶主要的氨基酸类神经递质应为 g a b a 和g l u 。 本论文进一步利用二种免疫组织化学方法对南方鲇面叶神经细胞y 氨基丁酸 a 受体( g a b a a 受体) 的分布情况进行了检测和分析，研究结果表明南方鲇面叶 中约9 0 的圆形神经细胞和7 0 的椭圆形神经细胞具有g a b a a 受体ol 亚基的免 疫反应性，提示它们可能存在g a b a 一受体。根据实验结果，本论文对脊椎动物 g a b a 。受体的氨基酸序列进行了生物信息学分析，发现鱼类与其他脊椎动物的 g a b a a 受体氨基酸序列有较高的相似性，但鱼类q 、b ，y 亚基的跨膜区域中少 数氨基酸残基与哺乳动物存在差异推测其通道结构可能与哺乳动物有些差异。 本论文的研究工作为进一步探讨南方鲇面叶神经元g a b a 和g a b a a 受体在 味觉信息处理中的功能奠定了基础，并为研究鱼类味觉中枢信息编码的机理，揭 示了新的方向。 中山大学硕士学位论文 关踺词：南方鲇，面叶，氨基酸神经递质，v 一氨基丁酸a 受体 i i 中山大学硕士学位论文 t h ec h a r a c t e r i s t i ca n a l y s eo f a t y p eo fg a m m a a m i n o b u t y r i c - a c i dr e c e p t o r so ft h ef a c i a ll o b ei nm e d u l l ao fs o u t h e r nc a t f i s h ( s i l u r u sm e r i d i o n a l i sc h e n ) m a j o r ：p h y s i o l o g y n a m e ：c h e nx i a o x i a s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o cl o n gt i a n c h e n g a b s t r a c t s o u t h e r nc a t f i s h ( s u r u sm e r i d i o n a l i sc h e n ) h a sh i g hg u s t a t o r ys e n s e i t s t a s t eb u d sf r o mt h es k i no fh e a da c c e p tt h eg u s t a t o r ys e n s e ，a n dt r a n s d u c ti n t o n e r v ec e n t e rt h r o u g ha f f e r e n tn e r v ea n dt r a n s f o r mn e u r o ni nf a c i a ll o b eo f t h e m e d u l l a t h ef a c i a l l o b eo ft h em e d u l l ai us o u t h e mc a t f i s hf o t i l l st h eb a s i sn e r v e c e n t e ri nc o d i n ga n dm a n a g e m e n to f g u s t a t o r yi n f o r m a t i o n t h r o u g ht h es y n a p s e c o n n e c t i n go fn e u r o t r a n s m i t t e ra n d n e r v en e t w o r k n e r v ec e n t e ri nf a c i a i i o b e c o d e sa n dm a n a g e st h eb a s i sg u s t a t o r yi n f o r m a t i o n ，a n dr e l a t e sw i t ht h eh i g h t a s t en e r v ec e n t e ra n df e e d i n gb e h a v i o r i nt h i sa r t i c l e ，t h ec o n t e n t so f a m i n oa c i d n e u r o t r a n s m i t t e r so ff a c i a i l o b eo f s o u t h e r nc a t f i s hw e r ef i r s td e t e c t e da n d a n a l y z e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) t h er e s u l t s h o w e dt h a tc o m p a r e dw i t ht h em u s c l eo f s o u t h e r nc a t f i s hw i t ha b u n d a n c ea m i n o a c i d sc o n s t i t u t e ds t r u c t u r a ip r o t e i n t h en e u r o n si nf a c i a l i o b eh a dm o r e g a m m a - a m i n o b u t y r i c a c i d ( g a b a ) a n dg l u t a m i ca c i d ( g l u ) s ow ec o n c l u d e d t h a tt h ep r i m a r ya m i n oa c i dn e u r o t r a n s m i t t e r si nf a c i a ll o b eo f s o u t h e r nc a t f i s h w e r eg a b aa n dg l u i nt h i sa r t i c l e ，t h ed i s t r i b u t i n go fg a b a a r e c e p t o r si nn e u r o n si nt h ef a c i a l l o b eo fs o u t h e r nc a t f i s hw a sf u r t h e re x a m i n e da n da n a l y z e db yt w ok i n d so f h 中山大学硕士学位论文 m m u n o c y t o c h e m i s t r ym e t h o d s t h e r e s u l ts h o w e dt h a ta b o u t9 0 c i r c u l a r n e u r o n sa n d7 0 o v a ln e u r o n se x i s t e dol s u b u n i to fg a b a a r e c e p t o ri n t h e f a c i a ll o b eo f s o u t h e r nc a t f i s h 。a n dw ec o n c l u d e dt h a ta b o u t9 0 c i r c u l a rn e u r o n s a n d7 0 o v a ln e u r o n sm a y b eh a v eg a b a ar e c e p t o r s a c c o r d i n gt ot h i sr e s u l t ， t h ea m i n oa c i ds e q u e n c e so fg a b a ar e c e p t o ri nm a n yv e r t e b r a t ew e r ea n a l y z e d b yi n f o r m a t i c sm e t h o d si nt h i sa r t i c l e w eo b t a i n e dt h a tt h ea m i n oa c i ds e q u e n c e s o fe a c hs u b u n i to fg a b a ar e c e p t o ri n v e r t e b r a t ew e r eh i g h l ys i m i l a ra n d h o m o l o g o u s b u tt h et r a n s m e m b r a n ed o m a i n so fq ，1 3a n d vs u b u n i t si nf i s h w e r es o m e t h i n gd i f f e r e n tw i t hm a m m a l i a ni ns o m ea m i n oa c i d s ，s u g g e s t e dt h a t t h es t r u c t u r eo fc h l o r i n ec h a n n e lm a yb es o m e t h i n gd i f f e r e n tb e t w e e nf i s ha n d m a m m a l i a n t h i sr e s e a r c hp r o v i d e db a s i sf o rf u r t h e rs t u d yo ft h er o l eo fg a b aa n d g a b a ar e c e p t o rp l a yi nt h ec o d i n ga n dm a n a g e m e n to fg u s t a t o r yi n f o r m a t i o ni n s o u t h e r nc a t f i s h ，a n da l s oi m p l i e dan e w d i r e c t i o nf o rt h es t u d yo fm e c h a n i s mo f c o d i n gi n f o r m a t i o ni ng u s t a t o r yc e n t e ro ff i s h k e y w o r d s ：s i l u r u sm e r i d i o n a l 括c h e n 。f a c i a ll o b e 。n e u r o t r a n s m i t t e r , at y p eo f g a m m a a m i n o b u t y r i c a c i dr e c e p t o r s 中山大学硕士学位论文 第1 章前言 1 1南方鲇及鱼类味觉研究现状 南方鲇( s i l u r u sm e r i d i o n a l i sc h e n ) 又名南方大口鲇、大口鲇、河鲇，地方名 鲇巴郎，隶属于鲇形目，鲇科，鲇属。南方鲇是我国特有的大型肉食性名优鱼类， 主要分布于长江、珠江及闽江流域( 李萍，2 0 0 5 ) 。鱼类与水体直接接触，其皮 肤、口腔则是其与环境进行信息交流的主要渠道。鱼类的觅食、摄食行为与其发 达的味化学感觉有关( 林浩然，1 9 9 9 ) 。鲇鱼生活在水体的中下层，视觉系统与其 他感觉系统相对欠发达，主要借助口周对称的触须：鼻须，上颁须，下颁须探究 周围环境，其全身无鳞，在头部、外周皮肤和触须表面布满味蕾( a t c m aj ，1 9 7 1 ； 龙天澄，1 9 9 4 ；杨桂枝，1 9 9 7 ；栾雅文，2 0 0 3 ) 。因此鲇鱼成为味觉研究的模型 动物之一。 1 1 1 鱼类的味觉系统 硬骨鱼类的味觉系统分为体内味觉系统和体外味觉系统两部分( t h o m a se 1 9 7 8 ) 。鲇鱼的味觉初级中枢主要包括迷走叶和面叶2 个主要的延髓膨大区( 见图 1 1 ) ，分别接受迷走神经和面神经的感觉支的传入投射。分布于体表的味觉感受 器( 味蕾) ，通过面神经传入纤维投射到面叶；而口腔和鳃弓上味蕾通过迷走神 经的传入纤维投射到迷走叶。面叶主要调节控制口外的头部、体部等皮肤的味觉 与触觉的感受。迷走叶主要对口内、舌咽腔及内脏的味觉感受进行调控。二者在 味觉感受上是相对独立的。迷走叶、舌咽叶和面叶，统称为味觉叶。味觉叶发出 的二级味觉神经传导束分为下行二级味觉传导束和上行的二级味觉传导束；上行 的二级味觉传导柬一部分终止于脑桥味觉区，一部分终止于延髓叶状核。脑桥味 觉区发出神经纤维终止于丘脑和下叶， 接着向端脑投射。下行的味觉二级神经柬 直接向后发出的径向束，一部分终止于中央索状核，一部分终止于c a j a l l 勾脏连结 核的两侧，背部网状结构以及第一脊神经节背部连合的侧面和背面，下行束的最 后的部分来自于面叶，这些神经纤维分支终止于脊髓近头侧的背角部分。而口外 中山大学硕士学位论文 和口内系统的味觉信号通过面神经、舌咽神经和迷走神经传入中枢系统进行信息 的整合。整合后的信息下行传递到相应的部位从而作出适当的反应。( c h a r l e sf ， 1 9 9 3 1 9 9 6 ，2 0 0 0 ：k i y o h a r a s ，1 9 9 8 ：赵磊，2 0 0 6 ) 。 图1 i南方鲇延髓示意图，f l 为面叶，v l 为迷走叶 f i g i - ls c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f m e d u l l ai ns o u t h e r nc a t f i s h ( s i l u r u s m e r i d i o n a l i sc h e r t ) f l ，f a c i a ll o b e ；v l ，v a g a ll o b e 1 1 2 国外对鱼类味觉的研究 国外对鱼类味觉的研究起步较早。研究主要集中在鲇鱼( c a t f i s h ) 体表味蕾的 形态结构、分布及其功能( b a r d a c hj e ，1 9 6 7 ；a t e m aj ，1 9 7 1 ；f i n g e r t e 1 9 9 1 ； s a nd ，2 0 0 5 ) ，神经系统对味化学刺激的反应及行为( c a p r i oj ，1 9 7 5 ，1 9 7 8 ，1 9 9 3 ： o g a w a k ，2 0 0 0 ) 、昧觉初级中枢的结构、味觉通道及投射野分布( f i n g e r t e 1 9 7 6 ， 1 9 7 8 ：h a y a m a t ，1 9 8 9 ：h a r a r j ，1 9 9 4 ) 、仞级中枢神经元电生理反应( m a r u i t ，1 9 8 2 ) 等方面。y o s h i r ol s h i m a r u 等人( 2 0 0 5 ) 对鱼类味觉受体( t a s t er e c e p t o r ) 的研究发现，鱼类其中的2 个味觉受体家族t 1 r 5 和t 2 r s 与哺乳动物的t i r s 和 t 2 r s 有一定程度的同一性。鱼类t l r s 有3 种类型，其中的t i r i 和t i r 3 与哺乳 动物的t l r l 和t l r 3 的同一性程度最高。其t i r 2 跟哺乳动物的t l r l 和t l r 2 同一性程度相当。而鱼类2 种t 2 r s 显示出与哺乳动物的t 2 r s 较低的同一性。原 位杂交实验揭示鱼类t i r 和t 2 r 基因只表达味蕾细胞，而嗅觉感受细胞中没有表 达。且鱼类t i r l 和t 1 r 2 基因在不同类型的味蕾细胞表达。与哺乳动物一样，鱼 类t l r 3 基因与t l r l 或t l r 2 共表达。鱼类t 2 r s 在与表达t i r 基因的细胞不同 的细胞中表达。这些结果暗示脊椎动物具有两种味觉信号通路。 中山大学硕士学位论文 1 1 3 国内对鱼类味觉的研究 国内对鲇鱼味觉的研究起步较晚，主要集中在外周感受器在皮肤、唇瓣，须 的分布及味蕾结构的研究( 杨桂枝，1 9 9 7 ，1 9 9 8 ) ，触须味蕾结构及味觉反应( 龙 天澄，1 9 9 4 ，1 9 9 5 ；栾雅文，2 0 0 3 ；魏玉侠，2 0 0 5 ) ，污染物对味觉功能的影响( 龙 天澄，1 9 9 4 ) ，延脑初级味觉中枢的结构( 赵磊，2 0 0 5 ) 。赵磊( 2 0 0 6 ) 也对南方 鲇延髓面叶的神经构筑与信息编码作了初步的研究与探索。她的研究表明，南方 鲇的面神经主要感觉支：上颌须神经和下颌须神经，分别传导上颌须和下颌须表 面皮肤味蕾的味觉感受。它们各自支配的味蕾类型不同。作为味觉初级中枢的面 叶位于延髓，且面神经的感觉支在面叶上的投射具有躯体分布特异性。南方鲇面 叶分成大( 外侧) 小( 中间) 2 叶，所占体积分别为7 3 士3 和5 8 士4 。上颌须神 经投射到外侧叶的背中位置，下颌须神经投射到中间叶的背中位置。对神经放电 反应而言，最有效的刺激物是l 丙氨酸和l 精氨酸，上颌须的神经反应更为敏感， 在其皮肤感受区域中所含味蕾数量也比较多。l 精氨酸和l 丙氨酸存在交叉反应 和脱敏现象，须部的味蕾具有快适应和饱和特征。面叶投射区域中，有味觉诱发 放电反应的细胞存在于对机械刺激反应细胞区域的背面。且在上颌须神经投射区 域中，l 精氨酸和l 丙氨酸引起的反应较强，下颌须神经投射区域中，l 组氨酸 和奎宁引起的反应较强。显示出南方鲇面叶神经细胞的诱发放电也具有一定的躯 体投射的分野。而且在面叶的神经元存在特定的味觉单元对特定的味觉刺激物产 生反应。南方鲇面叶的圆形与椭圆形神经细胞电生理特性比较说明两者存在差异。 目前对鱼类味觉的研究已达到分子水平但现有的资料还不能具体阐明鱼类 的味觉编码以及多种味觉行为的关系。因此，研究工作必须深入到神经中枢对味 觉传入信息的编码整合与输出、味知觉的产生以及感知觉如何介导行为的领域。 i 2 氨基酸类神经递质及其受体与味觉相关的研究 氨基酸类神经递质广泛分布于中枢神经系统( c n s ) 内，在c n s 感觉信息传 导和完成运动指令等突触传递过程中发挥重要作用。以其对突触后神经元的兴奋 性或抑制性作用可分为两类：兴奋性氨基酸类神经递质以谷氨酸( g l u t a m a t e ，g l u ) 、 天门冬氨酸( a s p a r a g i n e ，a s p ) 为代表；抑制性氨基酸类神经递质以y 氨基丁酸 中山大学硕士学位论文 ( y a m i n o b u t y f i ca c i d ，g a b a ) 和甘氨酸( g l y c i n e ，g l y ) 为代表( n a k a n i s h i s 1 9 9 2 ：d a wn w ，1 9 9 3 ；魏东升，1 9 9 4 ：l u d d e n sh ，1 9 9 5 ) 。 g a b a 主要分布在脑内，在外周神经和其他组织中很少。谷氨酸在髓内含量 很高，在人类大脑皮层中达9 l am o l g ( m o n a g h a nd t ，1 9 8 9 ) 。甘氨酸广泛分 布于中枢神经系统，主要是脊髓中间神经元的抑制性递质，在脊髓含量最高，特 别是前角，可高达7 0 3 “m o l g 。生化测定结果显示，人类脑内谷氨酸、天门冬氨 酸和y 氨基丁酸的含量超过体内蛋白质代谢最旺盛的器官肝脏中的含量。其中猫 的全脑中谷氨酸，天门冬氨酸和v 氨基丁酸的含量分别是8 7 0 、2 2 3 、2 2 7um o l g 湿重，而其肝脏中的含量分别是4 4 8 ，o 8 7 、0 1 0 m o l g 湿重( 韩济生，1 9 9 9 ) 。 1 2 1 兴奋性氨基酸类神经递质及其受体的研究 运用电镜和免疫反应手段，证实在中枢神经系统内绝大多数兴奋性突触都以 谷氨酸为递质。不同脑区谷氨酸的含量差别不大，很少超过2 倍， 兑明利用谷氨酸 为神经递质的神经元在脑内的分布十分广泛。在药理上根据选择性激动剂不同， 将谷氨酸受体分成五种类型：n m d a 受体、a m p a 受体、海人藻酸受体、代谢型 谷氨酸受体和l a p 4 受体。前三种受体都是由谷氨酸门控的阳离子通道( 离子型受 体) ，a m p a 受体、海人藻酸受体合称为非n m d a 受体。后两种受体部是与g 蛋白 揭联的谷氨酸受体，激活后通过胞内信号转导系统产生生理效应( p i nj p ，1 9 9 5 ) 。 中枢神经元之间的兴奋性突触传递主要由a m p a 受体和n m d a 受体所介导。这两 种受体共存于同一突触内，激活时开放其偶联的阳离子通道，产生兴旮眭突触后 电流( e p s c ) ，使突触后神经元去极化，后者达到一定阂值时即引起发放( m c b a i n c j ，1 9 9 4 ；b e t t l e r b ，1 9 9 5 ；l e r m aj ，1 9 9 7 ；韩济生，1 9 9 9 ) 。天门冬氨酸在早 年文献中曾与谷氨酸相提并论，后束发现它并非贮存于兴奋性神经末稍的囊泡中， 而且它对n m d a 受体的亲和性比谷氨酸低得多，不可能介导突触反应中缓慢的 n m d a 成分。因此，近年来逐渐趋于否定天门冬氨酸在脑内充当兴奋性递质的可 能性( 韩济生，1 9 9 9 ) 。 t 2 2 抑制性氨基酸类神经递质及其受体的研究 1 9 6 6 年k r n j e c v i c ：g f f g a b a 微电泳到猫的大脑皮层，可引起神经元的超极化，其 4 中山大学硕士学位论文 平衡电位与抑制性突触后电位( i p s p ) 相同，证明g a b a 确是神经组织释放起抑制 作用的氨基酸。根据受体对激动济及拮抗剂的敏感性的不同，将o a b a 受体分为a 、 b 和c - - 种类型。g a b a a 受体被o a b a 激活，通过开启氯离子通道产生突触后抑制， 其效应可被特异性拮抗剂荷包牡丹碱( b i e u c u u i n e ) 阻断( s t e p h e n s o n ，1 9 8 8 ：s e i g l m a w ，1 9 9 5 ) ；而g a b a b 受体被g a b a 激动，通过与g 蛋白和钾离子、钙离子通道 耦合，产生突触前和突触后抑制，对b i c u e u l l i n e 不敏感，但可被氯苯氨基丁酸 ( b a c l o f e n ) 激动( l a n z a m ，1 9 9 3 ；d o z ev a ，1 9 9 5 ：w u ，1 9 9 5 ) 。o a b a c 受体 对b i e u c u l l i n e 和b a e l o f e n 都不敏感，它在结构上与g a b a a 受体相似，也是通过开启 氯离子通道产生抑制效应，其效应可被直接关闭氯离子通道的印防己毒素 ( p i c r o t o x i n ，p t x ) 阻断( z h a n g ，1 9 9 5 ) 。免疫光镜和电镜研究资料表明，g a b a 能神经元广泛存在于整个孤束核吻端( r n s t ) ( w e t h e r t o nb m ，1 9 9 8 , l a s i t e rp s 1 9 9 8 ：l e o n a r d n l ，1 9 9 9 ) 。r n s t 作为味觉传入的第一级中枢换元站，一方面接 受来自面神经、舌咽神经及迷走神经的味觉传入，并发出纤维投射到臂旁核 ( p a r a b r a c h i a ln u c l e u s p b n ) 复合体，从而上传味觉信息：另一方面与脑干网状 结构形成局部纤维联系，并与味觉系统某些前脑结构存在往返纤维联系( c h oy k 2 0 0 2 ) 。 甘氨酸受体广泛分布于中枢神经系统，但可与甘氨酸特异拮抗剂士的宁结合 的受体则主要分布于脊髓、脑干及后脑，在前脑很少。甘氨酸与受体结合主要起 抑制作用。微电极导入甘氨酸可引起脊髓运动神经元的抑制效应，打开氯离子通 道引起突触后膜超极化，产生i p s p ，对运动神经元产生抑制性调控。在延脑、皮层 等脑区的抑制作用则较弱( b e t zh ，1 9 8 8 ：韩济生，1 9 9 9 ) 。另外，甘氨酸可与 n m d a 受体结合，加强谷氨酸的活性。所以，甘氨酸被看作是一种增强n m d a 效 应的调质( t h o m s o na m 1 9 8 9 ，1 9 9 0 ) 。 1 2 3 谷氨酸和g a b a 及其受体与味觉相关的研究 谷氨酸和g a b a 是脊椎动物c n s 中有效的神经递质，在味觉系统信息传递中 也发挥重要作用。通过对泥螈味蕾神经活性物质进行免疫组化实验，结果显示在 支配味蕾的神经纤维中存在着谷氨酸和g a b a ( j a i ns ，1 9 9 1 ) 。利用摄入同位素 标记的谷氨酸和g a b a 的方法，得到泥螈l i n g u a l 上皮的大多数细胞运输这些氨基 中山大学硕士学位论文 酸( n a g a it ，1 9 9 8 ) 。s m e r a s k ic a 等人( 1 9 9 8 ) 进行了金鱼初级味觉核团( 迷走 叶) 的电生理实验，加入谷氨酸受体拮抗剂k y n u r e n i ea c i d 将大大减小由迷走神经 受刺激引起的突触后场电位，由此推断兴奋性氨基酸是中枢神经系统味觉通路的 神经递质。m o j g a ne r a m 等人( 2 0 0 5 ，2 0 0 6 ) 分别对河鲶( c t a l u r u s p u n c l a l u s ) 面 神经和迷走神经支配的味蕾及味细胞进行g a b a 、谷氨酸，天门冬氨酸，丙氨酸， 牛璜酸和谷胱甘肽的免疫组化实验。结果显示，这些物质在面神经和迷走神经支 配的味蕾中的分布都不同，而且g a b a 更多地存在于迷走神经支配的味蕾细胞中。 在大鼠实验中，为研究g a b a 受体在大鼠面口部本体感觉信息传递和调控中的作 用提供形态学依据，李金莲等( 2 0 0 3 ) 应用免疫组织化学方法对大鼠三叉神经中 脑核( v m e ) 内g a b a a 受体( g a b a a r ) 和g a b a b 受体( g a b a b r ) 进行定 位分布。结果显示g a b a a 受体和g a b a b 受体的不同亚单位在v m e 内的定位分 布有一定差异，提示g a b a 能神经终末对面口部本体感觉信息的传递发挥抑制性 调控作用，可能主要是由位于v m e 神经元胞体内的g a b a a r oi 和g a b a a r o3 亚单位所介导。赵磊( 2 0 0 6 ) 对南方鲇面叶神经细胞的电生理实验结果发现，在 其所测试的面叶小型和中型神经元可能都含有g a b a a 受体。g a b a 通过激活面叶 冲经元的氯离子通道蛋白受体，调控味觉信息编码有关的兴奋性活动。从而推测 在面叶中可能通过突触前兴奋产生g a b a 来控制神经元的活动，从而达到整合味 觉传入信息的作用。 这些氨基酸类神经递质以及它们的受体在不同的动物脑内各个脑区的分布存 在差异。确定鱼脑中氨基酸类神经递质的成分与含量将为进一步研究鱼类味觉中 枢的信息编码与投射机制奠定基础。国内外对哺乳动物特别是大鼠、小鼠脑内的 氨基酸类递质的定量分析研究较多，一股采用高效液相色谱( h p l c ) 结合荧光检 测器的检测方法，方法也比较成熟。但国内外对鱼类初级味觉中枢神经递质的研 究不多。因此本论文利用高效液相色谱结合荧光检测器的方法( h p l c f l ) ，着眼 于检测南方鲇延髓面叶氨基酸类神经递质的成分与含量。 i 3免疫组织化学技术在味觉研究中的应用 1 3 1 免疫组织化学技术 6 中山大学硕士学位论文 免疫组织化学( i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ) ，又称免疫细胞化学( i m m u n o e y t o c h e m i s t r y ) ，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织、细胞原位通过抗原抗体反 应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。 它把免疫反应的特异性、组织细胞化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜( 包 括荧光显微镜、电子显微镜) 的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种 抗原物质( 如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等) 。肽类与蛋白质种 类繁多，均具有抗原性，当将人或动物的某种肽或蛋白质作为抗原注入另一种动 物体内，则产生与该抗原相应的特异性抗体( 免疫球蛋白) ；将抗体从血清中提出 后，结合上某种标记物，即成为标记抗体。用标记抗体与组织切片标本孵育，抗 体则与细胞中相应抗原发生特异性结合，结合部位被标记物显示，则在显微镜下 观察到该肽或蛋白质的分布。用荧光素( 常用异硫氰酸) 标记抗体，并于荧光显 微镜下观察，称免疫荧光术。若抗体与辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ， h r p ) 等结合，进行酶显示后，可在光镜或电镜观察，用于电镜者则称为免疫电 镜术( m m u n o e l e e t r o n m i e r o s e o p y ) 。 标记抗体与抗原结合方式主要有两种：直接法：用标记抗体与样品中相应 抗原直接结合，操作方法简便，特异性高，但敏感性较差，此法可用于检定未知 抗原；间接法：先用未标记的具有特异性的第一抗体与样品中的相应抗原结合， 然后再以标记的第二抗体与特异性的第一抗体结合；第二抗体是用第一抗体作为 抗原注入另一动物体内诱导产生的抗体，然后再结合以标记物。通过这样的放大 作用，使抗原分子上的标记物大大增多，故间接法较直接法的敏感性大为增高 约高5 1 0 倍，故应用更为广泛。间接法中较常用的，如过氧化物酶抗过氧化物酶 复合物法( 标记p a p 法) ，该法除需一抗和二抗外，还需要制备h r p 标记的抗酶抗 体即以h r p 作为抗原免疫动物，制成抗h r p 抗体，再以h r p 对标记该抗体，制成 稳定的环形p a p 复合物。标本先后经一抗、二抗和p a p 复合物处理后再以d a b 显色 抗原存在部位可见棕黄色产物。 近l o 年来，免疫组织化学技术有了很大进展，各种新方法相继建立。单克隆 抗体( m o n o e l o n a la n t i b o d y ) 制备技术极大地提高抗体的特异性与免疫组化染色的 精确性。继p a p 法之后由于生物素亲合素等试剂的应用，为检测微量抗原，受体， 抗体提供了更精确的技术。目前常用的生物素一亲和素方法有：标记亲和素一生 中山大学硕士学位论文 物素法( l a b 法) 、桥连亲和素一生物素法( b a b 法) 及亲和素一生物素一过氧化 物酶复合物法( a b c 法) ；现市上有配制成的a b c 试剂盒供应，使用简便，是目前 广泛应用的一种方法。 a b c 法中，亲和素与生物素有特殊的亲和力，比不同抗原与抗体之间的亲和 力高出百万倍以上，而且二者的结合是不可逆的，但不会影响彼此的生物学活性。 由于亲和素分子有4 个相同的亚基，是生物素结合的位点，这也可以与带有生物素 分子的大多数蛋白质( 包括抗体和酶) 相结合，因而就能使亲和素和生物素标记 的酶之间形成大分子复合物，如亲和素一生物素一过氧化物酶复合物( a v i d i n b l o w n p e r o x i d a s ec o m p l e x ，a b c ) ，在这种复合物中过氧化物酶活性并不受影响。 无论生物素还是亲和素与过氧化物酶结合后都不能影响酶的活性，这就使生物素 亲和素亲和组织化学与免疫组织化学结合起来，并成为广泛使用而且是最敏感的 免疫组织化学技术方法之一。 i 3 2 免疫组织化学技术在味觉研究上的应用 在味觉系统的研究中，免疫组织化学技术的运用十分广泛，包括应用于外周 砷经系统有关的味觉感受器、味觉神经纤维和中枢神经系统的神经元，神经胶质 细胞中。利用免疫组织化学技术可鉴定味蕾细胞及神经纤维的特异蛋白的表达。 g i n am n e l s o n 利用光镜、电镜结合免疫组织化学技术，证实了味蕾中神经细胞粘 连分子( n c a m ) 与能被抗体1 3 5 0 标已的生长相关蛋白( g a p ) 的存在，而h 血型 抗原和2 8 8 抗原决定簇则出现在味蕾中细胞与细胞的交界处及暗细胞上。相当多的 研究者利用免疫组织化学手段已对g a b a a 受体多种亚单位如nl - 6 、0i - 3 、vi 3 ， 6 在大鼠脑中的分布进行较深入的研究，并发现大脑各部分都呈现a 、0 【，b2 、 1 33 、r2 的免疫反应性( m o r e n o 儿，1 9 9 4 ；m i r a l l e s c p ，1 9 9 9 ；p i r k e r s ，2 0 0 0 ) 。 李正莉等人( 2 0 0 2 ) 也在大鼠舌下神经核神经元内证实白细胞介素2 受体、孕激素 受体和谷氨酸受体共存。2 0 0 5 年，m a s a k o 等人也在小鼠味蕾细胞检测到n e u r o t r o p h i n a s n e u r o t r o p h i n 4 。在鱼类实验中，s o f i a 等人( 2 0 0 5 ) 对粗唇龟鲻味蕾和传入神 经作了钙结合蛋i ! i c a l r e t i n i n 的免疫组化测定，证实租唇龟鲻( c h e f o 肠6 ，d s 淞) 味 蕾及支配味蕾并投射到迷走叶的神经纤维都显示c a l r e t i n i n 免疫反应性，首次显示 硬骨鱼中味蕾及味觉传入系统中c a l r e t i n i n 的存在。 中山大学硕士学位论文 因此，免疫组织化学技术广泛应用于味觉相关研究中，在对与味觉相关的神 经递质及其受体，神经营养因子及各种神经细胞蛋白等物质的定性和定位分布研 究上起到很重要的作用。 1 4 g a b a a 受体的结构特性研究 g a b “受体是一种快速作用的配体门控氯离子通道，与烟碱型乙酰胆碱受体 ( n a c h r ) 、甘氨酸受体( g i y r ) 及5 羟色胺3 型受体( 5 h t 3 r ) 同属配体门控离 子通道超家族，在分子的结构上有着相似的内在联系( m a c d o n a l dr l ，1 9 9 4 ：m a r g o t e ，2 0 0 5 ) 。g a b a a 受体是由g a b a 识别位点、苯并二氮卓( b e n z o d i a z e p i n e ，b z ) 识别位点和氯离子通道三部分组成的大分子蛋白质复合物( d a v i d r ，1 9 9 1 ；邓诣 群等，2 0 0 2 ：m a r g o te ，2 0 0 6 ) 。 通过e d n a 克隆技术已鉴定了哺乳动物大脑中的2 1 个g a b a a 受体亚基，依据 其氨基酸序列的相似程度，将亚基系列分为8 个亚基族，包括：ot 6 、i 4 、yi 4 、 6 、e 、e 、p1 3 和亚单位。g a b a a 受体为5 个亚基构成的五聚体大分子，这 些亚基可以有不同的组合方式。g a b a a 受体亚基的多样性和相关研究结果表明， g a b a 。受体在其五聚体构成上存在异质性。通过亚基特异性抗体作为生物学探针 的研究结果表明，哺乳动物大脑中存在的天然g a b a a 受体主要由u ，b 、y 亚基 组成，至少有1 2 2 4 个亚型具有重要的生理功能。g a b a a 受体亚基的分布研究表 明，在大鼠脑中ui1 32y2 受体亚型表达最丰富，占总表达量的4 3 ( r u t hm ，1 9 9 6 ) ， 其次是d363y3 和o2 b3y2 受体亚型( 见图1 - 2 ) 。 图1 2 大鼠g a b a a 受体各亚型的比例图 f i g 1 2p r o p o r t i o nc l l a l to f g a b a ar e c e p t o rs u b t y p e so fr a t ( f r o mk e i t ha 2 0 0 5 ) 9 中山大学硕士学位论文 g a b a a 受体各个亚基的分子结构具有共同的特征，每一亚基大约由4 0 0 5 5 0 个氨基酸残基组成，亚基末端均带有由约2 2 0 个氨基酸残基组成的n 端亲水域，位 于细胞膜外侧面：都具有4 个疏水的跨膜区域( m l m 4 ) ，每一序列长度约为2 3 个氨基酸残基，跨膜序列之间通过亲水性氨基酸相连接( s m i t hg b 1 9 9 5 ) ；m i 共同序列中心有一保守的脯氨酸存在，在受体通道形成、门控和巴比妥类作用等 方面发挥重要作用。m 2 形成氯离子通道，能选择性地通过带负电荷的氯离子。d 亚基细胞膜外域外侧面有由2 个半胱氨酸残基的硫桥键( 1 3 9 1 5 3 ) 形成的b 袢 结构。1 3 亚基的该袢内尚含有1 个n 糖基化部位。就a 亚基和b 亚基而言，两者的 细胞膜内侧面的顺序则无相同之处，长度各异，p 亚基膜内面( 4 0 5 - 4 0 9 个氨基 酸残基位置) 有一独特的依赖于c a m p 的蛋白激酶作用下的丝氨酸磷酸化顺序， b o a r g a r g a r g a l a - s e r 。定点突变研究和药理学分析已经证实g a b a a 受体上有一 些氨基酸残基在g a b a 和b d z 类药物与受体的结合过程中起重要作用( w e s t hs e ， 1 9 9 7 ) 。文献报道，1 3 亚基上的t y r l 5 7 、t h r ，t i l r 2 0 2 - 与t y r 2 0 5 和亚基f 的p h e “ 是g a b a 与g a b a a 受体结合所必需的氨基酸。n 亚基上的h i s l 0 1 ( 人y g h i s l 0 2 ) 和 g i v 2 0 0 ( 人为g i y 2 0 ) 与y 亚基上的p h e ”，m e t 和t h r 2 是大n g a b a a 受体b z 结 合位点形成的关键氨基酸( r e b e c c a d 2 0 0 5 ) ：al 亚基j 2 t y r l 6 0 r t t h r 2 m 的苯基环， s e r l 8 6 的羟_ 基和a 唱1 8 7 影响b z 的结合，t y r 怕，s e r l 8 6 、a r 9 1 8 7 9 l s e r 埘、接：i 丘_ b d z 的结合位点( x u ，2 0 0 5 ) 。 1 5 本研究的目的和意义 本论文以我国特有鱼种南方鲇( s i l u r 础 m e r i a i o n a l i sc h e r t ) 为实验对象。南方鲇 的面神经传导口外皮肤味蕾的味觉感受，其味觉初级中枢是位于延髓的面叶。氨 基酸类神经递质( 如谷氨酸、g a b a 、甘氨酸等) 及其受体在味觉系统信息传递中 也发挥重要作用。这些神经递质以及它们的受体在不同的动物脑内各个脑区的分 布存在差异。目前国内外对鱼类味觉仞级中枢氨基酸类神经递质的成分与含量研 究不多。确定南方鲇延髓面叶中氨基酸类神经递质的成分与含量将为进一步研究 鱼类味觉中枢的信息编码与投射机制奠定基础。 为了确定南方鲇延髓面叶神经细胞g a b a a 受体的分布存在情况，本论文利用 1 0 中山大学硕士学位论文 2 种免疫组织化学方法对g a b a 受体oi 亚单位进行了检测，并对脊椎动物 g a b a a 受体进行生物信息学分析，探讨鱼类与哺乳动物g a b a a 受体在结构上是 否存在一些差异，为进一步研究与分析鱼类g a b a a 受体的特性奠定基础。 本论文的研究工作为进一步探讨南方鲇面叶神经元g a b a 和g a b a a 在味觉 信息处理中的功能奠定了基础，并为研究鱼类味觉中枢信息编码的机理，揭示了 新的方向。 中山大学硕士学位论文 第2 章南方鲇延髓面叶氨基酸类神经递质的含量检测 哺乳动物中枢神经系统内大部分神经递质是氨基酸类神经递质，主要包括兴 奋性氨基酸谷氨酸( g l u ) 、天冬氨酸( a s p ) 和抑制性氨基酸r 氨基丁酸( g a b a ) 和甘氨酸( g l y ) 两大类。据文献报道，氨基酸类神经递质在高等生物味觉信息编 码与处理中起到很重要作用。南方鲇延髓面叶氨基酸类神经递质的研究目前国内 外尚少有报道。南方鲇的味觉发达，了解其味觉初级中枢延髓面叶中氨基酸 类神经递质的主要成分及其含量情况，为日后对鱼类味觉信息编码与处理的研究 起到奠基作用，也对神经系统生理研究有重要意义。 反相高效液相色谱荧光法( h p l c f l ) 广泛利用于测定动物脑组织氨基酸类 神经递质。利用邻苯二甲醛( 0 p h t