（分析化学专业论文）新型电化学生物传感器的研究.pdf

硕f j 学位论文 摘要 环境中的重金属离子难以被微生物降解，可通过各种途径进入人体并在体内 长期积累，对身体造成伤害，严重的将会危及生命。此外，蛋白质和核酸是生命 体中最重要的两类生物大分子，核酸碱基的突变是诱导许多遗传病的原因，而各 种蛋白质在人体内含量的变化直接反映了人体新陈代谢情况，已成为疾病诊断的 主要依据。因此建立简单、灵敏、高效的蛋白质、核酸分析方法对临床诊断、药 物筛选等医学研究具有重要的意义。生物传感器作为一种新的检测手段，具有选 择性高、灵敏度高、稳定性强、成本低廉、能在复杂的体系中快速检测等特点。 其中电化学检测方法因其灵敏度高、所需仪器简单、检测成本低、易于实现微型 化等优点，使得以电化学检测为基础的生物分析技术具有极其广阔的应用前景。 因此，在本研究论文中，我们发展了以下几种新型电化学检测方法t ( 1 ) 基于汞离子与双链d n a 中特定碱基对t t 在一定条件下相结合的原理，建 立了一种高灵敏的电化学d n a 传感器，并实现了对汞离子的高灵敏检测。实验考 察与优化了反应温度，盐离子浓度，干扰离子等对传感器性能有显著影响的分析 条件，结果表明该传感器的电流响应与汞离子浓度对数在1 0 n m 5 0 9 m 浓度范围 内成线性关系，检测限可达1 0n m 。 ( 2 ) 建立了一种基于缺1 ：3 连接反应原理以及表面杂交技术的电化学基因分型 方法，并实现了p 一地中海贫血基因中2 8 位点s n p 的检测。在该方法中，两条与 目标检测链互补的引物探针与目标d n a 杂交后，形成了一个在突变位点处有一个 单碱基缺口的杂交体，该杂交体在有与突变点碱基配对的碱基存在下，能在聚合 酶和连接酶的作用下发生缺口填充和连接，使两条分离的引物探针连接起来。连 接产物可通过分子内杂交形成具有茎环的发夹状二级结构。该发夹结构产物能被 固定在金电极表面的捕获探针捕获到电极表面，使得电活性标记物二茂铁被吸附 到电极表面且能极大程度地靠近电极表面，从而产生氧化还原电流，达到高灵敏、 高选择性基因分型的目的。 ( 3 ) 建立了一种以微间距插指电极阵列( m g i d e a ) 为基础电极，结合酶的生 物催化银沉积反应来放大分析信号的高灵敏检测前列腺特异性抗原( p r o s t a t e s p e c i f i ca n t i g e n ，p s a ) 的电化学免疫传感器。实验根据用线性扫描方法得到的伏 安曲线可计算出微间距电极的电导率并用于p s a 的定量分析。结果表明当p s a 浓度 在1 0 龟m l 1 0n g m l 范围内变化时，检测到的导电率与p s a 浓度成线性关系。 关键词：汞离子：电化学d n a 传感器；单核苷酸多态性；微间距插指电极阵列； 酶催化金属沉积 i i 新型电化学乍物传感器的研究 a b s t r a c t h e a v ym e t a l si no u re n v i r o n m e n tc a nh a r d l yb ed e g r a d a t e d ，a c c u m u l a t i n gi n h u m a n sb o d yv i av a r i o u sa p p r o a c h e s ，d o i n gh a r mt oh u m a n ，e v e ne n d a n g e r i n gw h e n s e r i o u s l y a d d i t i o n a l l y , p r o t e i n a n dn u c l e i ca c i da r et h em o s tt w o i m p o r t a n t m a c r o - b i o m o l e c u l e s ，m u t a t i o n so fb a s e sr e s u l ti nal o to fi n h e r i t a n td i s e a s e s ， n e v e r t h e l e s s ，q u a n t i t yv a r i a t i o n so fd i f f e r e n tp r o t e i ni nb o d i e si m a g em e t a b o l i s m d i r e c t l y ，s e r v i n ga sl e a d i n g f o u n d a t i o no fd i s e a s e s d i a g n o s i s a sar e s u l t ，i t i s s i g n i f i c a n tt h a tc o n s t r u c t i n gak i n do fs i m p l e ，s e n s i t i v ea n de f f i c i e n ta n a l y t i c a l m e a s u r e m e n tf o rp r o t e i na n dn u c l e i ca c i dt oc l i n i c a l d i a g n o s i sa n dd r u gf i l t r a t i o n b i o s e n s o ri sak i n do fn e wd e t e c t i o nt e c h n i q u e ，w i t hh i g hs e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t y ， p e r f e c ts t a b i l i t y ，l o wc o s ta n df a s td e t e c t i o ni nc o m p l i c a t e ds y s t e m ，a n ds oo n w h e r e i n ， e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n - b a s e db i o a n a l y s i sh a sag r e a tp r o s p e c tf o ri t sh i g hs e n s i t i v i t y , s t a b i l i t y ，l o w c o s ta n da p t - t o m i c r o m a t i o n i nt h i s p a p e r ，w ep r e s e n ts e v e r a l e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nt e c h n i q u e sa sf o l l o w s ： ( 1 ) b a s e d o n t - h g tc o n f i g u r a t i o n f o r d e t e c t i n gm e r c u r y ( i i ) ，a s e n s i t i v e e l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o ri s d e v e l o p e d ，r e a l i z i n gt h ed e t e c t i o no fm e r c u r y ( i i ) w eo b s e r v e da n do p t i m i z e de x p e r i m e n t a lv a r i a b l e si n c l u d i n gt h e t e m p e r a t u r eo f h y b r i d i z a t i o n ，c o n c e n t r a t i o n so fs a l ti o n s ( n a + ) a sw e l la si n t e r f e r e n c ei o n s ，w h i c h h a v eag r e a ti n f l u e n c eo nt h es e n s o rc a p a b i l i t y t h er e s u l t ss h o w e dl i n e a rd e p e n d e n c y o nm e r c u r y ( i i ) c o n c e n t r a t i o no v e rar a n g ef r o m1n mt o5l x mw i t har e a d i l y a c h i e v a b l ed e t e c t i o nl i m i to f1n m ( 2 ) w ec o n s t r u c t e da ne l e c t r o c h e m i c a lg e n o t y p i n gt e c h n i q u eb a s e do ng a pl i g a t i o n r e a c t i o na n ds u r f a c eh y b r i d i z a t i o nd e t e c t i o n ，a c t u a l i z i n gt h ed e t e c t i o no fh u m a ng l o b i n g e n ea r o u n d - 2 8p o s i t i o n ，ak n o w nb i a l l e l i c ( a g ) s n ph i g h l ya s s o c i a t e dw i t h t h a l a s s e m i a i nt h i sm e t h o d ，a f t e rt w op r o b es t r a n d sc o m p l e m e n t a r yt ot h et a r g e tp r o b e h y b r i dt ot h et a r g e td n a ，ah y b r i d sw i t hag a pb a s ew a sf o r m e do nt h em u t a t i o ns i t e w h e nt h eb a s ec o m p l e m e n t a r yt ot h em u t a t i o no n ee x i s t ，t w os e p a r a t ep r o b e sl i g a t e d a f t e rg a pf i l l i n ga n dc o m b i n i n gb yp o l y m e r a s ea n dl i g a s e t h el i g a t i o ng e n e r a t e dt oa s t e m - l o o ph a i r p i nt h r o u g hi n t e r m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n ，w h i c hw a sc a p t u r e do n t ot h e e l e c t r o d es u r f a c eb yt h ei m m o b i l i z e d p r o b e ，c o n t r i b u t i n g t ot h e a d s o r p t i o n o f e l e c t r o a c t i v ef co n t oe l e c t r o d es u r f a c eu t m o s t l y , l e a d i n gt ot h er e d o xc u r r e n t ，a n d e v e n t u a l l yw eo b t a i n e dh i g h l ys e n s i t i v ea n ds e l e c t i v eg e n o t y p i n g ( 3 ) w ef o u n d e dah i g h l ys e n s i t i v ee l e c t r i c a li m m u n o s e n s o rb a s e do nm i c r o g a p p e d i n t e r d i g i t a t e de l e c t r o d ea r r a y ( m g i d e a ) c o m b i n i n ge n z y m a t i cs i l v e rd e p o s i t i o n i i i r e a c t i o nt oa m p l i f ya n a l y s i ss i g n a lf o rt h ed e t e c t i o no fp r o s t a t es p e c i f i ca n t i g e n ( p s a ) f r o mt h el i n e a rs w e e pv o l t a m m e t r y ( l s v ) c u r v e s ，t h ec o n d u c t i v i t yo fm g i d e a c o u l d b ec a l c u l a t e de a s i l y , a n dt h i st e c h n i q u ew a sa d o p t e dt oa n a l y s ep s aq u a n t i t a t i v e l y t h e r e s u i t se x h i b i t e dl i n e a r i t yb e t w e e nc o n d u c t i v i t ya n dt h ec o n c e n t r a t i o no fp s a i na r a n g eo fl 。0f g m l - 1 0n g m l k e yw o r d s ：m e r c u r y ( 1 1 ) ；e l e c t r o c h e m i c a l d n ab i o s e n s o r ；s i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) ；m i c r o g a p p e d i n t e r d i g i t a t e d e l e c t r o d e a r r a y ( m g i d e a ) ；e n z y m a t i cm e t a ld e p o s i t i o n i v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：伺短喜色日期： 刎肄占月r 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 保密口，在年解密后适用本授权书。 2 不保密团。 ( 请在以上相应方框内打”) 作者签名：村钮艳 导师签名：蔼使咯一 日期：力哆年钐月角 日期：叫年6 月厂日 硕l j 学位论文 第1 章绪论 生命科学在2 0 世纪取得了巨大的进展，许多科学家预言2 l 世纪是生命科学的 世纪。在现代生命科学研究和医学临床检测中，往往需要对一些生物大分子如蛋 白质、核酸等进行选择性测定。因此，多种学科交叉、融合产生了新一代的装置一 生物传感器( b i o s e n s o r ) ，导致了生命科学和分析化学技术的一场空f j 绝后的革 命。生物传感器由于具有较高的选择性和灵敏度，得到广大分析工作者的关注， 已发展成为现代生物技术的重要领域之一。生物传感器( b i o s e n s o r ) 是以生物学 组件作为主要功能性元件，能够感受到特定的靶分子并按照一定规律将这种感知 转换成可识别信号的器件或装置【l 矗】。生物传感器不仅在分子生物学、医学检验、 食品工业、环境检测以及国防军事方面有着广阔的应用，而且成为了二十一世纪 生命科学和信息科学发展的一个重要方法。近年来，由于新理论、新技术的不断 发展，生物传感器应用范围的不断扩大，特别是电化学生物传感器的研究工作取 得了巨大的进步，其性能和种类也得到了很大的发展。 1 1 电化学生物传感器的工作原理 电化学生物传感器是指由生物材料作为敏感元件，电极( 固体电极、离子选择性 电极、气敏电极等) 作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感器。根据产 生的电信号类别，可将其分为电流型和电位型两大类。电位型传感器将生物识别 反应转换为电信号，该信号与生物识别反应过程中产生或消耗的活性物质浓度对 数成正比，从而与待测物质浓度的对数成正比。电流型传感器主要基于探测生物 识别或化学反应中的电活性物质，通过固定工作电极的电位给电活性的电子转移 反应提供驱动力，探测电流随时间的变化，该电流直接测量了电子转移反应的速 度，反映了生物分子识别的速度，即该电流正比于待测物质的浓度。 1 2 电化学生物传感器的分类 根据固定在电极表面的生物敏感分子的不同，电化学生物传感器可以分为电 化学酶传感器、电化学免疫传感器、电化学d n a 传感器、微生物传感器、组织电 极和细胞器传感器等。根据生物材料的修饰( 或固定) 到电极上的方法不同，现 有的文献报道主要集中在共价键结合法、l b 膜法、自组装膜法、化学免疫法、静 电吸附结合法、表面富集法等。这里着重介绍以下几种电化学生物传感器。 新型电化学生物传感器的研究 1 2 1 电化学酶生物传感器 电化学酶传感器又称酶电极，是最早研发的一种生物传感器。它是在固定化 酶的催化作用下，生物分子发生化学变化后，通过换能器记录变化从而间接测定 出待测物浓度。早在19 6 2 年，c l a r k 3 j 等人就设想了把酶和电极结合起来检测酶的 底物，到19 6 7 年，世界上第一支酶电极由u p d i k e 与h i c k s 4 】研制出来用于血清中葡 萄糖含量的测定。从此，酶传感器引起广大科学工作者的重视，并进行了广泛研 究，得到了迅速发展。到目前为此，酶传感器的研究发展经历了三个阶段：以自 然界存在的氧作为媒介体来沟通酶与电极之间的电子通道，直接检测酶的反应底 物的减少或产物的生成的第一代酶传感器。这种传感器由于是间接测定法，故干 扰因素较多。第二代酶电极传感器是采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活 性中心与电极之间传递电子，通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化 5 - 8 1 。这种酶传感器可不受测定体系的限制，测量浓度线性范围较宽，干扰少。现 在不少研究者又在努力发展第三代酶电极传感器，即酶的氧化还原活性中心直接 和电极表面交换电子的酶电极传感器。这种传感器无需加入其他试剂，酶自身与 电极之间能直接发生电子转移。这是一种非常理想的酶传感器，人们也一直致力 于这方面的研究。目前也有少量报道1 9 - 1 3 】：j t l j p o l s k y 1 2 1 等通过共价交联法在h r p 酶 上修饰上重氮基团后，通过循环伏安法将修饰有重氮基团的h r p 电沉积到玻碳电 极上，实现了对h r p 的直接电化学测定。董绍俊1 1 3 1 等采用自组技术将纳米金组装 到带巯基的溶胶凝胶网状结构上，再将h r p 吸附到纳米金上，借助纳米金的催化 性能实现了h r p 的直接电化学检测。 1 2 2 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是基于抗原抗体反应的，可进行特异性的定量或半定量分 析的自给式的集成器件，抗原抗体是分子识别元件，且与电化学传感元件直接接 触，并通过传感元件把某种或者某类化学物质浓度信号转变为相应的电信号i l 制。 当采用某种电化学检测方法测量时，其信号大小与目标分析物在一定浓度范围内 成线性关系，从而实现对目标检测物的分析测定。电化学免疫传感器具有生物传 感器选择性好，种类多，测试费用低，适合联机化等优点；而且电化学体系可实 现在体检测，不受样品颜色、浊度的影响，所需仪器设备相对简单，具有简便、 快速、体积小等特点【1 5 】。根据检测信号的不同，可分为电位型、电流型、电容型、 电导型【16 1 。 ( 1 ) 电位型免疫传感器电位型免疫传感器兴起于2 0 世纪7 0 年代，它测量的 是敏感膜与目标物发生选择性作用后在膜上产生的膜电位变化，在零电流条件下， 膜电位与目标物浓度存在着对数关系。最早的电位型免疫传感器是j a n a t a i l7 j 在 l9 7 5 年报道的，他利用聚氯乙烯膜把抗体固定在金属电极上，当待测抗原与固定 硕 ：学位论文 在电极表面上的抗体结合后，电极上的膜电位发生相应的变化，而膜电位的变化 值与待测抗原浓度之间存在对数关系。 电位型免疫传感器结合了酶免疫分析的高灵敏度和离子选择电极、气敏电极 等的高选择性，可以直接或间接检测各种抗原、抗体，具有可实时检测、响应时 间较快等特点。但是存在的问题是信号与干扰的比例低，因为大多数生物分子上 的电荷密度相对于背景干扰( 如离子) 来说较低；另外，信号反应对p h 值和离 子强度等条件有明显依赖性，被测电位只与离子活性有关。 ( 2 ) 电流型免疫传感器这种传感器是在恒定电压的条件下，通过测量信号分 子在传感器表面发生的氧化还原反应过程中所产生的电流的大小，来达到对目标 分析物的检测。电流型信号转换器的优势在于：高灵敏，浓度与电流之间是线性 关系，可通过改变工作电极的电位而不改变样品溶液的缓冲容量来实现高选择性 分析。自从a i z a w a d 、组于1 9 7 9 年首次报道了用电流型免疫传感器来检测血清中 h c g 含量以来1 8 l ，肿瘤标志物的电化学检测已经得到了关注【19 1 。酶作为一种生物 催化剂，其催化产生的各种产物大多具有氧化还原性，能产生明显的氧化还原电 流。而且，酶能很容易地与各种蛋白质分子结合并能很好的保持其催化活性。因 此，以酶为标记物的电流型免疫传感器已得到广泛的应用。此外，除了酶作为标 记物外，研究人员还将一些具有电活性的物质用于电流型免疫传感器的构建，这 些电活性物质主要包括一些药物、染料小分子、金属复合物以及纳米颗粒等。目 前，电流型免疫传感器在生物传感器中的应用已经得到了很好的发展，不少已成 功地实现了商业化。 ( 3 ) 电容型免疫传感器电容型免疫传感器是一种高灵敏非标记型免疫传感技 术。当金属电极与电解质溶液接触，在电极溶液的界面存在双电层，它可以用类 似于电容器的物理方程来描述： c = a e o e d 8 其中c 为界面电容，为o 真空介电常数，为电极溶液界面物理介电常数，a 是电极与溶液的接触面积，d 为界面层厚度。电极溶液的界面电容能灵敏反应界面 物理化学性质的变化，当极性低的物质吸附到电极表面上时，d 就会增大，就会 减少，从而使界面电容降低。众所周知，蛋白质分子是一类分子量大，极性小的 生物大分子，当它吸附到电极表面时，会显著地降低电极溶液界面电容。电容型 免疫传感器就是基于将抗体固定在电极表面，当抗原抗体在电极表面复合时，界 面电容相应地降低，据此检测抗原的量。 从理论上讲，一个理想的电容型传感器应具备以下几个特点：l 、传感器表面 必须高度绝缘，任何泄漏电流都将影响传感器对被分析物的识别；2 、绝缘层必须 是具有较高介电常数的电介质，这样绝缘层电容较大，对与其串联的识别层或其 吸附层电容( 待测电容) 的影响较小；3 、绝缘层表面必须存在化学活性基团，以 新型i u 化学生物传感器的研究 便固定识别物质如抗体、抗原以及单链d n a 等；4 、识别物质的固定方法必须高度 可控，即识别物质的覆盖度、致密性及取向具有良好的重现性。因此，在电容型 传感器的制作过程中，绝缘界面的构建和生物识别分子( 抗体) 的固定是影响其 性能的重要因素。关于绝缘层的构建和抗体分子的固定目前也已有不少报道，如 通过共价键合的作用把抗体固定在s i 0 2 和t i 0 2 等半导体氧化物薄膜上，实现对相 应抗原的测定。但所得到的传感界面一般较厚，且易导致抗体生物活性的降低。 j i a n g l 2 0 】等把抗体包埋在丫a 1 2 0 3 溶胶凝胶中制备电容型免疫传感器，由于这种 y a 1 2 ：0 3 超薄且渗透性好，有着较高的时间常数，因而具有很高的灵敏度，可以测 出1n gm l 一的人i g g 。采用硫金体系的自组装单分子膜绝缘性能好【2 ，室温时在 水、有机溶剂中很稳定，而且制作简单，也已成为制备电容型免疫传感器的常用 方法 2 2 , 2 3 j 。 ( 4 ) 电导型免疫传感器电导型免疫传感器是基于利用化学反应过程中产生或消耗 的离子来使溶液的导电能力发生改变的一种电化学检测技术。y a g i u d a 2 4 1 用电导法 测定了尿中的吗啡，解决了原来吗啡测量设备昂贵、费时、麻烦的问题。由于待 测样品中的离子强度与缓冲液电容的变化会对这类传感器造成影响，加之溶液的 电阻是由全部离子移动决定的，使得它们还存在非特异性问题，因此电导型免疫 传感器发展比较缓慢。 1 2 3 电化学d n a 传感器 随着分子生物学研究的深入，对脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 的检测手段变得越来越重要。d n a 分子特定的碱基序列与其互补链杂交形成 w a s t s o n c r i s k 双链d n a ，是各种测定d n a 技术的基础。目前已经有许多方法如表 面分析技术、凝胶电泳技术、毛细管电泳、电化学分析和化学发光分析技术等用 于d n a 的测定。电化学d n a 生物传感器【2 5 也7 】是近年来发展起来的一种新型的生物 传感器，它能将目的d n a 的存在转换为电信号，因为本身具有灵敏度高、成本低、 易操作、简单化、并能与其它仪器兼容的特点【2 6 , 2 7 】，因而发展非常迅速。除了d n a 检测外，d n a 传感器还在环境监测、药物研究、法医鉴定及食品检验等多方面显 示了诱人的应用前景。 1 2 3 1 电化学d n a 传感器的工作原理 电化学d n a 传感器是由一个支持d n a 片段( 探针) 的电极和检测电化学活性 识元素( e l e c t r o c h e m i c a lr e c o g n i t i o ne l e m e n t ) 构成。在适当的温度、p h 、离子强 度下，电极表面的d n a 探针分子能与靶序列选择性地杂交，形成双链d n a ( d s d n a ) ，从而导致电极表面结构的改变，这种杂交前后的结构差异，可以通过 具有电活性的杂交指示剂来识别，从而达到了检测靶序列( 或特定基因) 的目的。 硕 ：学位论文 1 2 3 2d n a 探针及其固定方法 在d n a 生物传感器的制备中，d n a 探针在电极上的固定是关键步骤，探针 的有效固定不仅能够提高传感器的灵敏度和选择性，还能避免非特异性的吸附。 有效的控制探针在电极表面的覆盖度、固定方向及其稳定性，并保持其与待测分 子结合的活性和特异性，使固定的d n a 有较高的密度，这对杂交的成功检测十分 重要。d n a 在传感器表面的固定方法主要有： ( 1 ) 吸附法：吸附法是最简单的固定方法因为它不需要进行任何核酸链的修 饰。它可通过物理吸附、化学吸附和恒电位吸附来实现。p a n g 等【2 8 】将单链d n a 或 双链d n a 溶液直接滴至新抛光的玻碳电极表面，涂匀，空气中自然晾干，无菌二 次水冲洗，充分浸泡，即得到几乎为单分子层的d n a 修饰电极。w a n g 2 9 】等利用恒 电位富集方法将d n a 探针修饰到碳糊电极上，他们先将电极在+ 1 7 v 下活化1 分钟， 然后将电极浸入含有d n a 的电解质溶液中在+ o 5 v 吸附富集2 分钟即可。b r e t t 3 0 】等 在较正电位+ 1 3 v 下，利用恒电位富集方法将变性的d n a 修饰到玻碳电极上。吸附 法还可以通过静电吸附来实现p ，利用带正电荷的聚毗咯、阳离子聚合物壳聚糖 和聚赖氨酸将单链d n a 固定在电极上，大大提高了d n a 的固定效率。 吸附法是一种最简单的固定d n a 的方法，速度快，不需要特殊的试剂，无需 对固定的d n a 进行修饰衍生化，费用低廉，而且电极表面易于更新。但是它不是 共价键合，很难消除非特异性吸附，且在杂交过程中可能脱附，而且d n a 结构会 发生扭曲，使固定的d n a 无法进行杂交，因而杂交效率很低，甚至使正确杂交变 的困难。 ( 2 ) 共价键合法：共价键合法是通过形成共价键，如酰胺键、酯键、醚键等 使d n a 固定到支持电极表面。首先活化预处理支持电极表面，引入各种所需活性 基团，如羧基、羟基、氨基等，或衍生核苷酸，使其带上合适的功能团，随后用 双官能试剂或偶联活化剂联结支持电极与衍生d n a 。目前通过巯基( s h ) 在金 表面自组装制备d n a 修饰电极的方法被广泛采用，但该修饰方法存在着一些问 题，诸如一s h 修饰的d n a 难以合成，且需要分离提纯，操作繁琐，巯基化合物结 合d n a 后，其体积大幅度增加，在金表面自组装比较困难。碳质电极表面易于处 理形成活性键合中心，所以共价键合法多用碳质电极做基底电极。将玻碳、石墨 电极氧化处理，使电极表面产生羧基等含氧基团，以水溶性已基一( 3 一二甲基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c ) 和n 一羟基磺基琥珀酰亚胺( n h s ) 作为偶联活化剂【3 2 1 ， 是最常使用的活化方法。玻碳、石墨电极氧化后产生的羧基等含氧基团经还原剂 还原，在电极表面形成羟基，再与硅烷基化试剂反应，得到含有氨基或羧基的活 性表面，使活性中心有更大的运动自由度，有利于d n a 的固定。硅烷基化也是一 种相对成熟、应用较多的d n a 共价固定方法。铂、锡掺杂的氧化锢等电极也被用 来共价固定d n a 。 共价键合法制备的d n a 修饰电极，修饰层稳定有序，d n a 分子与电极单点 连接，运动灵活度较高，易于分子杂交，而且固定的探针往往可通过热解再生。 但是由于电极表面活性位点较少，表面合成又是异相反应，因而固定的d n a 量较 少，响应信号较小。而且经化学修饰的碳质电极表面易被玷污，电极表面的更新 处理步骤繁琐。 ( 3 ) 生物素亲和素法：生物素( b i o t i n ) 是生物体内分布广泛的一种羧化酶的 辅酶，一端的羧基通过单一、温和的生化反应能与酶、蛋白质、抗体、d n a 等通 过化学键连接，但不影响它的闭合环脲基与亲和素的结合，也不影响这类物质的 生物活性。亲和素( a v i d i n ) 又称抗生物素蛋白或抗生物素，由四个相同的含12 8 个氨基酸的亚基组成，亚基之间通过二硫键连接，它的每一个亚基含有一个可与 生物素结合的位点，能与生物素及其衍生物形成高度稳定的化合物。亲和常数为 10 1 5 l m o l ，这种极强的专一性亲和力，在生物分子的固定化中意义重大。一般是 将亲和素共价偶联3 3 圳1 或通过静电作用 3 5 - 3 6 】吸附到支持物上，随后将生物素连接 的d n a 通过生物素与亲和素之间的专一性亲和作用而固定。用共价偶联的方法固 定亲和素比直接吸附亲和素有更好的稳定性及重现性。基于亲和素一生物素反应系 统固定生物分子的方法简便、温和、高效，在生物传感器领域中越来越受到重视。 ( 4 ) 自组装膜法：自组装法就是基于分子的自组作用，在固体表面自然形成高 度有序单分子层的方法。在核酸技术中，一般是利用一端带巯基的d n a 片段，在 金电极表面上形成自组装单分子膜来固定核酸。h a s h i m o t o 等首次在含2 0 个碱基 s s d n a 的5 端修饰h s ( c h 2 ) 2 一【3 7 】，将预处理过的金电极浸入连有毓乙基的d n a 探 针溶液中，4o c 连续搅拌1 2h ，将探针d n a 固定到金电极表面，对目标d n a 的 检出限高达10 1 6g l 。自组装膜法得到的s s d n a c m e 表面高度有序，稳定性好， 在适当的固定密度下，对互补d n a 有很好的杂交效率；但它对毓基修饰的d n a 纯度要求较高，分离提纯操作繁琐，由于大的亲水性核酸基团，也较难产生一个 紧密堆积表面，并且有一定非特异性吸附结合。 ( 5 ) 组合法：组合法即将上述两种或两种以上的固定方法结合起来固定d n a ， 如自组装法与吸附法、吸附法与共价键合法相结合等。利用组合法在电极表面固 定d n a ，结合了各固定方法的优点，制备的d n a 化学修饰电极有较好的稳定性， 分子杂交效率高，是当前较常用的d n a 固定方法之一。m i l l a n 3 8 1 等将1 8 一烷基胺或 1 8 - 烷基酸混入碳糊中，得到化学修饰的碳糊电极，然后在e d c 的存在下，通过 1 8 - 烷基胺的氨基与s s d n a 的5 末端的磷酸基形成磷酞氨键，将d n a 固定到电极 上，或者在e d c 和n h s 存在下，通过1 8 - 烷基酸与s s n h s 的d g 残基结合，从而将 d n a 修饰到电极上。缓冲溶液、固定温度、固定时间、链的长短等因素对探针的 有效固定均有影响。l u c a r e l l i 曾证明在乙酸缓冲溶液中固定探针f 39 1 ，能获得很好 硕十：学位论文 电信号，一般固定温度选择在2 0 2 5 。c 为宜，固定时间根据具体条件而定，探针长 度般为1 4 3 5 个碱基。 1 3 电化学生物传感器的检测技术 电化学传感器的另一关键技术是所产生的信号的检测技术，其作用是感知生 物分子与待测物质特异性结合产物的微小变化，并把这种变化转变为记录的信号。 根据电化学检测方式的不同主要可分为伏安法、计时电位法、电化学阻抗法和电 致化学发光法等。 1 3 1 伏安法 循环伏安法是是在固定面积的工作电极和参比电极之间加上对称的三角波扫 电压，记录工作电极上得到的电流与施加电位的关系曲线，即循环伏安图。从伏 安图的波形、氧化还原电流的数值及其比值、峰电位等可以判断电极反应机理m 。 作为最重要的电化学分析研究方法之一，它能提供关于氧化还原过程的大量信息， 且操作方便，l 訇谱解析直观，在电化学，无机有机化学及生物化学等许多研究领 域被广泛应用。 循环伏安法的检测限一般只有10 一m o l l ，这对于通常的分析应用来说是不够 的。改变加载电位的波形是解决这一问题最有效的方法。这种被称为脉冲伏安法 的方法可以有效地降低充电电流，从而提高了检测灵敏度。常用的有交流循环伏 安法( a c v ) 【4 、示差脉冲伏安法( d p v ) t 4 2 1 、方波伏安法( s w v ) 【4 3 1 和线性扫描伏 安法( l s v ) t 4 4 1 。d p v 灵敏度很高，可达到1 0 8m o l l 的检测限，因此d p v 在样品 量少的情况下是很有用的，对于生物样品检测尤为实用。s w v 是新发展起来的一 项技术，与d p v 相比，s w v 允许使用较快的扫描速率，这也是它的主要优点。 1 3 2 计时电位法 计时电位法是一种主要用来研究电极表面吸附现象，并定量地测定电活性物 质( 或称去极剂) 或表面活性物质在电极表面吸附量的电化学分析法。它的基本 原理与极谱法相同，但所测的是在电解池线路中流过的电荷，而不是电流与电解 时问的关系，故称计时电量法。计时电量法能更清楚地观察电活性物质有无特性 吸附，也是证实电极过程中有无吸附和测出吸附量的较新的电化学分析法。 电位法不同于伏安分析，对固定在电极上的d n a 力h 上一恒定电流，根据电位 随时间的变化来进行检测。w a n g 等利用电化学方法活化的碳糊电极，用电位溶出 方法来检测人体t 细胞白血病毒( h t l v 1 ) 的d n a 的长链末端序列【4 列。计时电位溶 出法检测d n a 杂交，与c v 和方波伏安法相比能获得很高的灵敏度和有效的背景补 偿。 新型【乜化学生物传感器的剐f 究 1 3 3 电化学阻抗法( e i s ) 电化学阻抗谱( e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ，e i s ) 分析方法是近年 快速发展起来的，用来检测修饰有生物分子的电极界面的生物学反应特性的电化 学技术，具有良好的界面表征作用 4 6 , 4 7 】。实验时一般采用三电极系统，即电化学检 测池中有工作电极( 即生物分子所修饰的电极) 、对电极、参比电极( 一般为饱和甘 汞电极) ，通过记录导体或半导体表面因固定生物分子或发生生物学反应而引起的 载体表面的电容和界面电子传递电阻等电化学性质的变化，绘制阻抗谱，进而分 析生物分子在载体表面的固定情况和生化反应的动力学过程【4 引。 出于e i s 具有良好的界面表征作用，微小振幅正弦电压或电流不会对生物大 分子造成干扰，敏感性高，使其有可能成为一种良好的生物传感技术或与其他传 感技术互补，具有广阔的应用前景。目前，阻抗谱分析方法己在各种传感器中有所 应用，如免疫传感器、d n a 传感器及酶传感器等。 1 3 4 电致化学发光法( e c l ) e c l 现象很早就被发现【49 1 ，但运用e c l 进行检测分析的文献报道直至8 0 年 代初才出现【50 1 ，将e c l 物质进行标记和检测是近年来发展起来的新技术。e c l 是 通过对电极施加一定电压以促使反应产物之间或体系中某组分进行化学发光反 应，测量发光光谱及其强度来测定物质的量。电化学发光被认为是最有潜力的芯 片检测模式之一。 目前，在实际应用中的e c l 体系比较重视联吡啶钌r u ( b p y ) 3 2 十体系。r u ( b p y ) 3 2 + 用作核酸标记物首先是通过与n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 或亚磷酰胺化合物反应， 生成能与核酸探针结合的r u ( b p y ) 3 2 + n h s 酯或r u ( b p y ) 3 2 + 亚磷酸酰胺化合物。 r u ( b p y ) 3 2 + 酯与核酸的氨基反应可生成r u ( b p y ) 3 2 + 标记的核酸探针，标记结合率可 达8 0 以上f 5 1 1 。采用r u ( b p y ) 3 2 + 亚磷酰胺标记还能在d n a 合成仪上合成探针的同 时自动进行标记，标记有效率 9 0 ，无需分离提纯 5 2 1 。 1 4 电化学生物传感器的前景与展望 电化学生物传感器开辟了电化学与分子生物学的新领域，为生命科学的研究 提供了一种全新的方法，已成为生物电化学的一个非常有生命力的科学前沿。并 且在近年来的发展中，电化学传感器也已经取得了一定的成就。今后，电化学传 感器的研究工作将会围绕着以下几个方面继续向前发展： ( 1 ) 采用纳米材料及纳米技术用于传感器的构建近年来，随着纳米技术的发 展，各种纳米材料在传感器领域的应用也日趋广泛。由于纳米材料具有一些独特 的性质如比表面积大，表面反应活性高等，可广泛用于敏感分子的固定，信号的 检测和放大等。因此，利用纳米材料来构建各种生物传感器是电化学生物传感器 顾f ：学位论文 发展的一个重要趋势。目前，国内外大量的研究工作者对各种纳米材料如( 碳纳 米材料、金属纳米材料以及半导体纳米材料) 在生物传感器方面的应用进行了大 量的理论和实验研究，并取得了突破性的进展，为纳米材料在生物传感器方面的 应用开创了新的局面。相信新型纳米材料的出现及现有纳米材料结构与性能的不 断完善，将为生物传感器的发展开创更广阔的前景。 ( 2 ) 多系统优化组合利用电化学生物传感器与其他技术如液相色谱、流动注 射、毛细管电泳以及微流控技术等联用，能有效提高分析灵敏度，减少样品和试 剂的用量。 ( 3 ) 人工智能化、微型化、集成化在生命科学研究和医学临床检测中，需要 对大量的各种各样的生物大分子进行选择性测定。常规的电化学传感分析方法通 常需要数小时甚至1 天以上，操作过程复杂，需消耗大量昂贵的免疫试剂，而且检 测设备较大，难以满足现场检验要求。建立高选择性、灵敏、简单、快速的分析 方法和廉价的小型化分析装置，一直是一个重要的研究课题。生物芯片因其具有 体积小、重量轻、便于携带、无污染、分析自动化、分析速度快、所需样品和试 剂微量化等诸多优点，表现出迷人的应用前景。 生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单 元和系统，使这些分析过程连续化、微型化、集成化和信息化，以实现对细胞、 蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测，其基本特征和 最大优势是多种单元技术在微小平台上的灵活组合和大规模集成，高通量是大规 模集成的一种形式。生物芯片主要分为两大类：一类是生物电子芯片，用于生物 计算机等生物电子产品的制造。另一类是生物分析芯片，用于各种生物大分子、 细胞、组织的操作以及生物化学反应检测。 1 5 本研究工作的构思 重金属对环境以及我们的生活构成了严重的危害，而癌症等疾病更是威胁着 人类的生病，实现对重金属以及蛋白质的快速、灵敏检测对人类具有积极的意义。 本论文旨在通过基于固相表面杂交技术使电活性探针靠近电极表面的分析方 法来提高传感器的分析灵敏度以及采取信号放大方法，构建一系列成本低、操作 简便、精确性高的电化学传感器。为此，本论文的研究工作主要从以下几个方面 展开： ( 1 ) 基于汞离子与特定碱基在一定条件下相结合的原理，固定于电极上的巯基 d n a 与标记有二茂铁的错配的d n a 在汞离子的作用下相结合，使得探针靠近电极 表面，缩短电子传递的距离，从而产生电化学信号。建