（食品科学专业论文）食品中三唑类杀菌剂残留分析技术研究.pdf

；1 - - i i ；科技大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方 式标明。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发 表或撰写过的作品或成果。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文储躲谰笱 沙p 年r 月弓口日 指导教师虢南五豇 枷| c 芏r 。r ；1 - i 1 ：科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权河北科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数扼库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 口保密，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 d 不保密。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名： 胡稀 j 指导教帅签名： y f o 年f 月) on7 o l 口年j - 月岁9 同 0 南支易 摘 要 摘要 本文应用分子印迹技术( m i t ) ，分别以三唑醇、烯唑醇为模板分子，采用本体聚 合法制备了对待测物具有特异性识别作用的分子印迹聚合物( m 口) ，然后将其作为 固相萃取吸附剂制成固相萃取柱，用于食品中三唑类杀菌剂残留的检测过程中。它 能够克服传统固相萃取的缺点，使痕量被分析物在复杂样品中得到分离富集，且稳 定性好，可重复利用。全文分为四章进行叙述： 第1 章：介绍三唑类杀菌剂的性质、分子印迹技术的发展现状、原理、应用及展 望。 第2 章：本章以三唑醇为模板分子，a 甲基丙烯酸( m a a ) 为功能单体，乙二 醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 为交联剂，采用本体聚合法合成分子印迹聚合物。考 察了模板分子与功能单体在不同比例下合成的聚合物对三唑醇的吸附量，通过静态 吸附试验研究了三唑醇分子印迹聚合物对三唑醇吸附性能的影响，并进行s c a t c h a r d 分析。由s c m c h a r d 分析得模板分子三唑醇与功能单体m a a 形成了2 类不同的结合 位点，高亲和力结合位点的离解常数k 0 1 = 0 0 7 5 m m o l l ，最大表观结合量 q m a x l = 2 5 1 8 m o l g ；低亲和力的结合位点的离解常数k i n = 3 2 m m o l l ，最大表观结合 量q m a 】【2 = 1 3 3 9 3 肛m o l g 。 将制得的三唑醇分子印迹聚合物制成固相萃取柱用于样品的前处理。并采用高 效液相色谱对样品中三唑醇残留进行测定。结果表明三唑醇线性范围为0 1 肛咖l 2 0 0 # m l ，线性相关系数为o 9 9 9 8 ，在2 m g k g 和1 0 m g l ( g 两个添加水平下，回收率在 7 9 3 8 6 之间，相对标准偏差( r s d ) 3 0 ( n = 5 ) 。说明该方法灵敏度高，重现 性好，是检测食品中三唑醇杀菌剂残留的有效方法。 第3 章：本章以烯唑醇为模板分子，m a a 为功能单体，e d m a 为交联剂，采用 本体聚合法合成分子印迹聚合物。考察了采用不同比例的模板分子与功能单体合成 的聚合物对烯唑醇的吸附量，通过静态吸附试验研究了烯唑醇分子印迹聚合物对烯 唑醇吸附性能的影响，并进行s c a t c h a r d 分析。由s c a t c h a r d 分析可知模板分子烯唑 醇与功能单体m a a 形成了1 类结合位点，结合位点的离解常数k o = 0 1 1 7 m m o l l ， 最大表观结合量q m 强= 3 8 6 6 肛m o l g 。 将制得的烯唑醇分子印迹聚合物制成固相萃取柱用于样品的前处理。结果表明 烯唑醇线性范围为0 0 1 m l 1 0 0 蚓m l ，线性相关系数为0 9 9 9 5 ，在0 2 m # k g 和 1 0 m g k g 两个添加水平下，回收率在9 1 7 4 9 2 9 4 之间，相对标准偏差( r s d ) 在1 7 2 3 9 之间( n = 5 ) 。说明该方法灵敏度高，精密度良好，重现性好，可以作 为检测食品中烯哗醇残留的有效方法。 摘要 将制得的三唑醇、烯唑醇聚合物按质量l g l ：l 混合，制成固相萃取柱用于胡萝卜 样品的前处理。结果表明在l m g k g 和2 0 m g k g 两个添加水平下，平均回收率在 7 8 7 - - 9 4 9 8 之间，相对标准偏差( r s d ) 在1 7 3 - - - - 2 4 之间( n = 5 1 。说明该方法 灵敏度高，精密度良好，重现性好，可以作为同时检测食品中两种三哗类杀菌剂残 留的有效方法。 第4 章：本章应用分子印迹技术，以三聚氰胺为模板分子，m a a 为功能单体， e d m a 为交联剂，采用本体聚合的方式合成分子印迹聚合物。考察模板分子与功能 单体在不同比例下合成的聚合物对三聚氰胺的吸附量，通过静态吸附试验研究了聚 合体对烯唑醇分子印迹聚合物吸附性能的影响。试验最终确定，模板分子与功能单 体摩尔比为1 ：4 。 将制得的三聚氰胺分子印迹聚合物制成固相萃取柱用于样品的前处理。对奶粉 样品进行检测，结果表明在0 0 0 5 9 9 m l - 2 0 0 # g m l 之间具有良好的线性关系，线性 方程为y = 5 9 1 1 6 8 1 x 2 5 0 1 5 8 ，线性相关系数为0 9 9 9 6 ，样品添加的平均回收率在 8 1 1 - - 9 0 8 之间，相对标准偏差 4 4 6 ( n = 5 ) ，检测限为5 n g g 。 关键词三唑类杀菌剂；分子印迹聚合物；吸附性能；固相萃取；高效液相色谱； 三聚氰胺 a b s t r a c t a b s t r a c t i n t h i s p a p e r ，u s i n g m o l e c u l a r i m p r i n t i n gt e c h n i q u e ( m i t ) ，t r i a d i m e n o l a n d d i n i c o n a z o l ea st h et e m p l a t em o l e c u l er e s p e c t i v e l y ，m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) w i t has p e c i f i cr e c o g n i t i o nw a s p r e p a r e db yt h ew a yo fb u l kp o l y m e r i z a t i o n a n du s i n ga s t a t i ca s s a yt os t u d yt h e i ra d s o r p t i o np r o p e r t i e s a n dt h e na sas o l i d p h a s ee x t r a c t i o n a d s o r b e n t s ，i tw a sm a d et h es o l i d p h a s ee x t r a c t i o nc o l u m nw h i c hw a su s e df o rd e t e c t i n g t h et r i a z o l e f u n g i c i d er e s i d u e s i nf o o d p r e t r e a t m e n tp r o c e s s ，i t c a l lo v e r c o m et h e s h o r t c o m i n g so ft h et r a d i t i o n a ls o l i d - p h a s ee x t r a c t i o n ，s ot h a tt r a c ea n a l y t e si nc o m p l e x s a m p l e sw e r es e p a r a t e da n de n r i c h e d i ta l s oh a sg o o ds t a b i l i t y ，a n dc a i lb er e u s e d t h e f u l lt e x ti sd i v i d e di n t of o u rc h a p t e r st od e s c r i b e c h a p t e r 1 ：t h en a t u r eo ft r i a z o l ef u n g i c i d e s ，t h es t a t u so ft h ed e v e l o p m e n to f m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，p r i n c i p l e ，a p p l i c a t i o na n do u t l o o kw e r ei n t r o d u c e d 。 c h a p t e r2 ：m i pw a sp r e p a r e db yt h ew a yo fb u l kp o l y m e r i z a t i o nu n d e rd i f f e r e n t r a t i o sb e t w e e nt e m p l a t em o l e c u l a r a n df u n c t i o n a lm o n o m e r ，u s i n gt r i a d i m e n o la s t e m p l a t em o l e c u l e ，m e t h a c r y l a t ea c i d ( m a a ) a sf u n c t i o n a lm o n o m e r ，e t h y l e n eg l y c o l d i m e t h a c r y l a t e ( e d m a ) a sc r o s s l i n k e r a d s o r p t i o no ft r i a d i m e n o lw a se x a m i n e db ys t a t i c a d s o r p t i o nt e s ta n dc o n d u c t e db ys c a t c h a r da n a l y s i s b ys c a t c h a r da n a l y s i s ，t r i a d i m e n o l t e m p l a t em o l e c u l ea n df u n c t i o n a lm o n o m e rm a a f o r m e dt w od i f f e r e n tt y p e so fb i n d i n g s i t e s ，h i g h - a f f i n i t yb i n d i n gs i t ed i s s o c i a t i o nc o n s t a n tk m = 0 0 7 5 m m o l l , t h ea p p a r e n t m a x i m u mb i n d i n gc a p a c i t ya m 戤1 = 2 5 18 z m o l g ；l o w a f f i n i t yb i n d i n gs i t ed i s s o c i a t i o n c o n s t a n tk m = 3 2 m m o l l , t h ea p p a r e n tm a x i m u mb i n d i n gc a p a c i t ya m 缸2 = 1 3 3 9 3 肛m o l g s o l i d - p h a s ee x t r a c t i o nc o l u m n sw h i c hw e r em a d eo fm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r w e r eu s e di ns a m p l ep r e - t r e a t m e n t a n dt r i a d i m e n o lr e s i d u e si nt h es a m p l e sw e r ed e t e c t e d b yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i n e a rr a n g eo f t r i a d i m e n o lw a s0 1 m l 一2 0 0 z g m l , l i n e a rc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a s0 9 9 9 8 ，u n d e r t h el m g k g 和10 m g k ga d d e dl e v e l s ，t h ea v e r a g er e c o v e r i e sw e r eb e t w e e n7 9 3 8 6 ， a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s ( r s d ) w e r e 3 0 ( n = 5 ) i ts h o w e dt h a tt h i sm e t h o d h a dh i g hs e n s i t i v i t ya n dg o o dr e p r o d u c i b i l i t y ，w a sa ne f f e c t i v em e t h o do fd e t e c t i n g t r i a d i m e n o lf u g i c i d er e s i d u e si nf o o d c h a p t e r3 ：m i pw a sp r e p a r e db yt h ew a yo fb u l kp o l y m e r i z a t i o n u n d e rd i f f e r e n t r a t i o sb e t w e e nt e m p l a t em o l e c u l a ra n df u n c t i o n a lm o n o m e r ，u s i n gd i n i c o n a z o l ea s t e m p l a t em o l e c u l e ，m a aa sf u n c t i o n a lm o n o m e r ，e d m a a sc r o s s l i n k e r ，a d s o r p t i o n a b s t r a c t o fd i n i c o n a z o l ew a se x a m i n e db ys t a t i ca d s o r p t i o nt e s ta n dc o n d u c t e db ys c a t c h a r d a n a l y s i s b ys c a t c h a r da n a l y s i s ，d i n i c o n a z o l et e m p l a t em o l e c u l ea n df u n c t i o n a lm o n o m e r m a af o r m e do n e t y p e o fb i n d i n g s i t e ，b i n d i n g s i t ed i s s o c i a t i o nc o n s t a n tk o = 0 11 7 m m o l l ，t h ea p p a r e n tm a x i m u mb i n d i n gc a p a c i t yq m a ) c = 3 8 6 础m o l g s o l i d p h a s ee x t r a c t i o nc o l u m n sw h i c hw e r em a d eo fm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r w e r eu s e di n s a m p l ep r e - t r e a t m e n t a n dd i n i c o n a z o l er e s i d u e s i nt h es a m p l e sw e r e d e t e c t e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i n e a r r a n g eo fd i n i c o n a z o l ew a s0 0 1 t g m l 1 0 0 z g m l , l i n e a rc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a s 0 9 9 9 5 ，u n d e rt h e0 2 m g k g 和10 m g k ga d d e dl e v e l s ，t h ea v e r a g er e c o v e r i e sw e r eb e t w e e n 9 1 7 4 9 2 9 4 ，a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s ( r s d ) w e r eb e t w e e n1 7 2 3 9 ( n = 5 ) i ts h o w e dt h a tt h i sm e t h o dh a dh i 【g hs e n s i t i v i t ya n dg o o dr e p r o d u c i b i l i t y ，w a s a l le f f e c t i v em e t h o do fd e t e c t i n gd i n i c o n a z o l ef u g i c i d er e s i d u e si nf o o d t h et r i a d i m e n o lm i pa n dd i n i c o n a z o l em i pw e r em i x e da c c o r d i n gt om a s sr a t i oo f 1 ：1 ，i tw a sm a d et h es o l i d p h a s ee x t r a c t i o nc o l u m n sw h i c hw e r eu s e di nt h ec a r r o ts a m p l e p r e t r e a t m e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，i nt h el m g k g 和2 0 m g k ga d d e dl e v e l s ，t h e a v e r a g er e c o v e r yw a sb e t w e e n7 8 7 - 9 4 9 8 ，a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) w a sb e t w e e n1 7 3 2 4 ( n = 5 ) i ts h o w e dt h a tt h i sm e t h o dh a dh i 曲s e n s i t i v i t ya n d g o o dr e p r o d u c i b i l i t y ，w a sa ne f f e c t i v em e t h o do fs i m u l t a n e o u sd e t e c t i n gt w ot r i a z o l e f u n g i c i d e sr e s i d u e si nf o o d c h a p t e r4 ：t h i sc h a p t e ru s i n gm o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e m i pw a sp r e p a r e db y t h ew a yo fb u l kp o l y m e r i z a t i o nu n d e rd i f f e r e n tr a t i o sb e t w e e nt e m p l a t em o l e c u l a ra n d f u n c t i o n a lm o n o m e r ，u s i n gm e l a m i n ea st h et e m p l a t em o l e c u l e ，m a aa sf u n c t i o n a l m o n o m e r ，e d m aa sc r o s s l i n k e r a d s o r p t i o no fm e l a m i n ew a se x a m i n e db ys t a t i c a d s o r p t i o nt e s t s o l i d p h a s ee x t r a c t i o nc o l u m n sw h i c hw e r em a d eo fm o l e c u l a r lyi m p r i n t e dp o l y m e r w e r eu s e di ns a m p l ep r e t r e a t m e n t a n dm e l a m i n er e s i d u ei nt h es a m p l ew a sd e t e c t e db y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t ss h o wt h a t i th a dg o o dl i n e a r r e l a t i o n s h i pw i t hl i n e a rr a n g eo fm e l a m i n eo 0 0 5 z g m l 一2 0 0 9 9 m lt h el i n e a re q u a t i o n w a sy = 5 9 11 6 8 1 x 一2 5 0 1 5 8 ，l i n e a rc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a s0 9 9 9 6 ，t h e a v e r a g e r e c o v e r i e sw e r e8 1 1 - 9 0 8 t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sw e r e 0 9 m g l 空气( 气溶胶) 。对兔皮肤和眼睛无刺激作用，对豚 鼠无任何致敏反应。三唑醇在动物体内( 大鼠) 代谢很快并排出体外，在体内无蓄积 作用。在试验剂量内对动物未见致畸、致突变和致癌作用。 1 3 分子印迹技术 1 3 1分子印迹技术发展简介 分子印迹又称分子烙印，属于超分子化学中主客体化学范畴，是源于高分子化 学、生物化学、材料科学的一门交叉学科。分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g t e c h n i q u e ，m i t ) 是指模拟自然界所有存在的分子识别作用机理( 如酶与底物、抗 体与抗原等特异性识别) ，制备对某特定目标分子具有特异性选择性的印迹聚合 物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ，m i p ) 的过程二“。它可以被形象的描绘为制造识 别“分子钥匙”的“人工锁”的技术。由于这种分二j ：印迹聚合物对印迹分子具有特异的识 别性，而且i = - 匕一= ：i 物实体稳定性好、抗恶劣舅：境能力强、使用寿命长，因而此种技术 崩6 = 撙6 ：畦6 = 她6 二 第1 章绪论 倍受关注。 分子印迹的出现源于免疫学。在2 0 世纪4 0 年代诺贝尔获得者p a u l i n 提出了以抗 原为模板分子来合成抗体的理论，这种基于抗原一抗体的理论为分子印迹的发展奠定 了理论基础。1 9 4 9 ：年d i c k e y 3 首次提出了分子印迹专一性吸附的概念，实现了染料在 硅胶中的印迹。但是直到1 9 7 2 年由w u l f f 哺1 研究小组首次报道了人工合成分子印迹 聚合物后才被人们广泛关注。尤其是在1 9 9 3 年瑞典m o s b a c h 等蛹1 人发表了有关茶碱分 子印迹聚合物的报道以后这项工作成为了国内外的研究热点。 分子印迹技术之所以发展如此迅速，主要是因为它具有结构预定性、特异识别 性及应用广泛性三大特点阳1 ，目前m i t 已应用于药物手性拆分、仿生传感器、固相萃 取、抗体模拟、酶催化模拟以及膜分离技术等领域n 0 1 5 1 。今年来已有很多文献报道 分子印迹技术的应用n 6 矧。 1 3 2 分子印迹技术原理 分子印迹聚合物( m i p ) 制备的基本原理是：首先在适当的溶剂中，模板分子与 功能单体在交联剂作用下形成含有模板分子的可逆性复合物，然后通过物理或化学 方法除去复合物中的模板分子，最终得到m i p 。m i p 在空间上存在着与模板分子相 匹配的、具有多重结合位点的三维空穴，能够特异性地识别模板分子并与之结合， 从而有效地将其从复杂体系中分离出来。该过程如图1 2 所示。 t o m l g a l a 丌0 蛔o u 培 n 、j i a i , r n p rt n 奄岛 i n 专 凶。 b 厂0 k 互 c o r r 口晤i a o ，、 t a i e n lo r n o n c c a 幻n ： l m 影每c i 岣彳、s 竺! ! ! 堕! 塑 一一- 翱n d l l q if 加y r 憎? r 缉c i l v i t h 菁j c e 咚5 i ，然岛丫慵 图1 - 2 分子印迹聚合物制备原理图 f i g 】2d i a g r a mo ft h es y n t h e s i so fm i p s 按照功能单体与模板分子结合方式的不同，分子印迹技术可分为预组织法( 共 价法) 和自组装法( 非共价法) 两种基本方法。 3 河北科技大学硕十学位论文 1 3 2 1 预组织法 预组织法又称共价法，由德国的w u l $ 2 铂小组于2 0 世纪7 0 年代初期创立。此方 法是指模板分子( 印迹分子) 首先通过共价键与单体结合形成单体一模板分子复合 物，然后交联聚合，聚合后再通过化学途径将共价键断裂而去除印迹分子。迄今为 止，人们使用的共价键包括可逆的硼酸酯、席夫碱、缩醛酮以及不可逆的酯等卅。 共价键作用的优点是聚合中能获得在空间精确固定排列的结合基团。由于共价键作 用一般较强，在印迹分子自组装或识别过程中结合和解离速度慢，难以达到热力学 平衡，不适于快速识别，而且识别能力和生物识别差别甚远，因此这种方法发展缓 慢。 1 3 2 2 自组装法 自组装法又称非共价法，由瑞典的m o s b a c h 口2 1 及其同事在2 0 世纪8 0 年代后期 创立。此方法是指模板分子与功能单体以非共价键自发形成具有多种结合位点的复 合物，经过交联聚合后这种作用保存下来。常用的非共价键作用有：氢键、静电引 力、金属螯合作用、电荷转