（动物学专业论文）林麝（moschus+berezovskii）微卫星分子标记筛选及其应用研究.pdf

阴。l l 大学颐t 论文- 林麝( m o s c h u sb e r e z o v s k i i ) 微卫星分子标记筛选及其应用研究 动物学专业 硕士研究生：夏珊指导教师：岳碧松教授 中文摘要 麝是我国极其重要的资源动物，由于乱捕乱猎和生境破坏麝的数量急剧 减少，濒临灭绝，现为国家一级重点保护野生动物。目前对于麝的研究多为形 态学、分类学、组织学研究，但是少有用分子生物学方法对于麝进行研究，尤 其是对于麝的遗传学方面的研究。 微卫星d n a 属于共显性的遗传标记，广泛的存在于基因组内，含有丰富 的多态性，能够忠实反映个体特征，个体间的亲缘关系，在人类、家畜中已经 得到广泛应用，目前看来它是最适合于研究林麝遗传多样性问题的工具。因此， 我们选择了构建林麝的微卫星文库，筛选多态性好的座位对于林麝的遗传多样 性进行初步的分析。 在本次研究中，我们利用了链亲和素和生物素之间有强亲和的原理，构建 了林麝的三个碱基重复的微卫星富集文库( c a a ) s 和( a g c ) 8 文库备一个。每个 文库含有几百个转化子，用p c r 的方法从2 个文库中筛选阳性克隆。发现所建 微卫星富集文库( c a a ) 8 和( a g c ) 8 中的阳性克隆率大致为1 0 ，而测序结果表 明，用该方法筛选的阳性克隆中含有( c a a h 和( a g c ) 。重复比率不高，各找到 含有( c a a ) 。和( a g c ) 。重复序列一个。又在以前建立的( a c ) 1 2 文库中选取2 4 个阳性克隆进行测序，并对其进行多态性筛选，找到较好多态性座位6 个。 用这6 个座位对于都江堰金风山和马尔康养殖场的圈养林麝做遗传多样性 阴川大学硕卜论文 分析。这六个座位等位基因数量为4 7 个，平均每个座位在金风山屠群中为5 5 个，马尔康居群中为5 9 个；6 ! 微卫星座位在金风山居群中有效等位基因数在 3 0 7 6 5 6 2 8 之间，而马尔康居群有效等位基因数在3 0 3 2 4 6 5 4 之间，而有效 等位基因的平均值在两个居群中的平均值分别为：4 2 3 5 和3 8 3 4 ；金凤山居群 表观杂合度( h o ) 和期望杂合度( h e ) 分别为0 3 4 7 8 1 0 0 0 和0 6 7 4 8 0 8 2 2 3 ， 马尔康居群表观杂合度( h o ) 和期望杂合度( h e ) 分别为0 2 0 8 3 0 9 6 6 5 和 0 6 7 0 1 0 7 7 0 1 ；6 5 微卫星座位的多态信息含量( p i c ) 最低为0 6 2 1 4 ，最高 为o 7 9 8 4 ，根据b o t s t e i n 等提出的衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标， 当p i c 0 5 时，该座位为高度多态座位，说明这6 个林麝微卫星座位具有高度 多态性，是很好的分子遗传标记。 通过这些分子遗传标记，我们希望能利用它们为圈养麝构建清晰的家族谱 系，能为麝的亲子鉴定、麝野外个体的辨别及鉴定、以及对于麝的保护措施的 实旌提供分子生物学依据做出贡献。 关键词：林麝微卫星文库 朋川大学硕十论文- c o n s t r u et h em i c r o s a t e l l i t el i b r a r i e sf r o mf o r e s tm u s kd e e r ( m o s c h u sb e r e z o v s k i i ) a n di d e n t i f i e dt h el o c iu s e df o ra n a l y s i s e m a j o r ：z o o l o g y m a s t e rs t u d e n t ：x i as h a nt u t o r ：p r o f e s s o rb i s o n gy u e a b s t r a c t ： m u s kd e e r ( 1 v l o s c h u ss l o p ) i st h em o s ti m p o r t a n tr e s o l a l r e ga n i m a lo f c h i n a ， a n dt h e f i r s tc l a s so f “k e y ”s p e c i e so fw i l d l i f ep r o t e c t e db yc h i n e s e d u et o p o a c h i n gf o rm u s kp o d sa n dt h ed i s t u r b a n c eo f h a b i t a t ，m u s k d e e rp o p u l a t i o n sa r c r e d u e ds h a r p l y , a n da r eb e c o m i n gs e r i o u s l ye n d a n g e r o u s n o wt h e r ea r em a n y r e s e a r c h e si nt a x o l o g y ，h i s t o l o g y 。p h y s i o l o g yo f m u s kd e e r ，h o w e v e r ，l i t t l e r e s e a r c ha b o u tm o l e c u l a rg e n e t i c so fm u s kd e e r o u rl i b e r t a r yd os o m er e s e a r c h e s i ng e n e t i c so f m u s kd e e r 。 m i e r o s a t e l l i t ed n ai sc o - d o m i n a t eg e n e t i cm a r k e r ti tc a nf e a l t yr e f l e c tp e r s o n a l f e a t u r e ，t h ep a r e n t a g er e l a t i o n s h i p ，i th a v eb e e nw i l d l yu s e di nh u m a na n d l i v e s t o c k i nt h i st i m e ，m o r em i e r o s a t e l l i t e s1 0 c ii nm u s kd e e rw e r ef o u n da n dt h e c h a r a c t e r i z e so f t h e s el o c ia l s oa n a l y z e d n l eg e n e t i cd i v e r s i t yo f t h et w oc a p t i v e m u s kd e e rp o p u l a t i o n sw e r ea n a l y z e da l s o i n t h i sr e s e a r c h w e u s e d t h e m e t h o d o f b l o o r e t a l ( 2 0 0 1 ) a n d m a k es o m ec h a n g e s w ec h o s et w oo l i g o n u c l e o t i d e ( c a a ) na n d ( a g c ) nw h i c hh a v eh i g h e rf r e q u e n c y t h a no t h e r si nm a m m a l 【g a b o rt oe tn 2 0 0 0 1a c c o r d i n gt ot h es t r o n ga f f i n i t y b e t w e e ns t r e p t a v i d i na n db i o t i n ，t l l i st w oo l i g o n u c l e o t i d el a b e l e dw i t hb i o t i n ， r e s p e c t i v e l y t h i st w op r o b e sw e l - et h e nr e a c t e dw i t i ls t r e p t a v i d i n - c o a t e dm a g n e t i c b e a d s t h eg e n o m i ed n ao ff o r e s tm u s kd e e rw e r ed i g e s t e dw i t hr e s t r i c t i o n e n z y m es a u 3 a 1 t h e4 0 0 - 9 0 0 b pd n af r a g m e n t sw e r ei s o l a t e d ，l i g a t e dw i t h l i n k e r so l i g oaa n do l i g ob ，t h e na n n e a l e dw i ms t r e p t a v i d i n b i o t i n - p r o b e 四川大学硕士论文- c o m p l e x e s p c ra m p l i f i c a t e dt h es t r e p t a v i d i n - r i c h e dd n a ，t h ef l a g m e n t sw i t h 4 0 0 9 0 0 b pw g t er e c l a i m e da n di i g a t e dw i t hp m d l 8 一tv e c t o r ， a f t e rt r a i l s f o r m a t e d t h el i g a t e dd n at oe s c h e r i c h i ac o l ij m l 0 9 ，i n d u c e db yx - g a la n d p t g ，w h i t e b a c t e r i u mw e r ep i c k e do u t t h e nw ec o n s t r u c t e d2e n r i c h e dl i b r a r i e s ( c a a ) t la n d ( a g e ) n e a c ho f t h el i b r a r yh a v ea f e wt h o u s a n do f c l o n e s ，p o s i t i v ec l o n e sw e r e s c r e e n e dw i t hp c ra m p l i f i c a t i o nf r o mt h e ( c a a ha n d ( a g c ) nl i b r a r i e s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a te a c hl i b r a r yh a v e1 0 p o s i t i v ec l o n e s , s e q u e n c i n gf o u n dt h e p o s i t i v ec l o n e si sl o wi nt h e s et w ol i b r a r i e s o n l yo n es e q u e n c ew a sf o u n dh a s ( c a a ) na n d ( a g c ) ni nt h el i b m r i e s 1 r i l e n2 0p o s i t i v ec l o n e sw e r es e l e c t e df r o m ( a c ) nl i b r a r yw h i c hw a sc o n s t r u c t e db e f o r e ， i nt h e2 0p o s i t i v ec l o n e s ，6l o c i w e r ef o u n d t h e s el o c ia l lh a v eh i g h p o l y m o r p h i s m s ，a n da r eg o o df o rf u t u r e a n a l y z e d s o ，t h e yw g r eu s e dt oa n a l y s i st h et w op o p u l a t i o i l so fj i n f e n gb r e e d i n g f i e l da n dm a e r k a n gb r e e d i nf i e l do f s i c h u a np r o v i n c e n 圮n u m b e ro fa l l e l e sp e rl o c u sr a n g e df r o m4t o7 w i t ha n a v e r a g eo f5 5i n j i n f e n gb r e e d i n gf i e l da n d5 9i nm a e r k a n gb r e e d i nf i e l do f s i c h u a np r o v i n c e 1 1 1 e n u m b e ro fe f f e c ta l l e l e so fe a c hl o c u sb e t w e e n3 0 7 6 5 6 2 8 ，3 0 3 2 4 6 5 4 ， r e s p e c t i v e l y n l ea v e r a g en u m b e r so fe f f e c ta l l e l e sp e rl o c u sw e r e4 2 3 5a n d3 8 3 4 t h eo b s e r v e da n de x p e c t e dh e t e r o z y g o s i t i e sr a n g e df r o m0 3 4 7 8t o1 0 0 0a n d 0 6 7 4 8t oo 8 2 2 3i nj i n f e n g ，f r o mo 2 0 8 3t oo 9 6 6 5a n do 6 7 0 1 t o0 7 7 0 1 ， r e p e c t i v e l y t h ep o l y m o r p h i ci n f o r m a t i o nc o n t e n t ( p i f ) v a l u e sf o rt h e s el o c iw a s f r o mo 6 2 1 4t oo 7 9 8 4 a c o r r d i n gt ob o t s t e i n ，w h e nt h ep i cw a sa b v e0 5 ，t h e l o c u ss h o u l db eah i g hp o l y m o r p h i cm a r k e r ，t h e s es i xl o c ia l lh a v eh i 曲 p o l y m o r p h i s m s ，a n d a r eg o o dd n am a e k e r sf o rf u t u r ea n a l y z e d w eh o p et h a tt h e s eg e n e t i cm a r k e r ss h o u l db eu s e df o ra n a l y s i st h eg e n e t i c s t r u c t u r eo f m u s kd e e rp o p u l a t i o n ，i d e n t i f yp a r e n t a g e ， i d e n t i f yi n d i v i d u a l si n f i e l d sa n da d v i s em a n a g e m e n tm e a s u r ef o rp r o t e c t i n gc a p t i v ef o r e s tm u s k d e e r p o p u l a t i o n k e yw o r d s ： f o r e s tm u s kd e e r m i e r o s a t i l i t e ，l i b r a r y 4 四川大学硕士- 论文- 第一章： 林麝( m o s c h u sb e r e z o v s “i ) 基因组微卫星富集文库的构建 摘要： 本研究选定在哺乳动物中出现频率比较高的( c a a ) s 和( a c , c ) s 合成寡核苷 酸链，并用生物素标记，然后与链亲和素磁珠迸行反应，形成相应的寡核苷 酸探针混合物；用s a “3 a i 酶切林麝基因组d n a ，回收4 0 0 - 9 0 0 b p 的酶切片段 后，连接上人工接头o l i g o a 和o l i g o b ，然后分别与两种链亲和素磁珠生物 素寡核苷酸探针退火，磁珠吸附含有( c a a ) 3 和( a c , - c ) 8 的d n a 片段；p c r 扩 增后回收4 0 0 9 0 0 b p 的d n a 片段，然后与p m d l 8 - t 载体连接后转化到e c o l i j m l 0 9 ，在x g a l 和i p t g 的诱导下，挑选白斑到l b 培养基培养，构建好( c a a ) s 和( a g c ) s 文库2 个。用p c r 的方法从2 个文库中筛选阳性克隆，发现所建微 卫星富集文库( c a a ) b 和( a o c ) 8 中的阳性克隆率大致为1 0 ，测序结果表明， 用该方法筛选的阳性克隆中含有( c a a ) 。和( a g c ) 。重复比率不高，含有c a a 和a g c 重复的序列各一个。这两个文库将对于进一步筛选打下基础。 关键词：林麝， 微卫星，富集文库 i 、引言； 微卫星d n a ( m i c r o s a t e u i t em s1 ，又称短串联重复序歹l l ( s h o r t t a n d e mr e p e a t s t r ) ，是一类广泛存在于原核、真核生物基因组的d n a 串联重复序列( e d w a r d s ae t a l 1 9 9 1 ) 。s t r 核心序列( 重复单位) 2 6 b p , 多位于编码区附近，也可位于内 含子、启动子、a l u 序列中，其重复单位相同，以( c a ) n 、( g t ) n 、( c a g ) n 较常 见，其重复长度在1 0 0 b p 以下，( s c h l o t t e r e rce t a 1 9 9 2 ，g r o v e scpe t a 1 9 9 5 ) 。 它们广泛存在于各类真核生物基因组中( g a t v a ore t a l2 0 0 1 ) ，含有极其丰富的 多态性，是一类很好的分子遗传标记( g r o v e scpe t a 1 9 9 5 ) 。每个特定位点的 微卫星d n a 均由两部分构成：中间的核心区和外围的侧翼区。人群中微卫星 位点的等位基因差异，主要来自核心区重复单位的数目的变化，由此构成了 s t r 的遗传多杏性。自从微卫星发现以来，它被广泛应用于遗传多样性的检测、 明川大学顾士论文- 物种或品系鉴别、个体识别、谱系关系分析、动植物育种、遗传病及肿瘤的研 究等许多领域。v a n z e v e r e n 等1 9 9 5 年利用7 个微卫星座位标记对四个比利时猪 种进行了研究，通过等位基因频率、多态信息含量( p i c ) 、遗传杂合度以及有 效等位基因数及品种内个体形似概率等指标做比较，得出种内遗传差异和遗传 关系 微卫星d n a 结合p c r ( s t r p c r ) 检测技术因s t r 等位基因片段短( 4 0 0 b p ) 且相互之间差异小，能用于陈旧及降解材料的分析和多位点复合扩增；运用 p c r 技术可减少检材使用量( 约l n g 次) ，提高灵敏度，加快检测速度。由此， 微卫星d n a 成为第二代d n a 遗传标记的核心，s t r - p c r 也迅速成为目前应用 最广泛、研究最深入的d n a 分析技术。1 9 9 6 年，r o y ，r ，等就用血迹中提取 出的微量d n a ，扩增出微卫星座位，用于法庭鉴定罪犯( r o yr e t a 1 9 9 6 ) 。 微卫星d n a 以其较高的多态性和稳定性、可多基因座位复合扩增、检材使用 少、检测效率高、检测迅速以及成熟的检测技术、低廉的检测费用等优点广泛 应用于d n a 检测的各个领域。人们已经利用微卫星分子标记对于人、老鼠、 牛、蚊子等生物进行了大规模的遗传作图( b a r e n d e s ee t a l 1 9 9 4 ，d i e t r i c h w e t a l 1 9 9 9 ，w e i s s e n b a c hje t a l 1 9 9 3 ) ；同时还可以利用微卫星的分析对于一些基因 进行定位( a t m o nge t a l 2 0 0 2 ) 。 利用微卫星对野生及人工饲养动物进行个体识别和亲缘关系鉴定，不仅有 助于对动物进行保护管理，而且可以为某些动物行为生态学理论提供实际依 据。1 9 9 4 年，z h a n g 等，就用7 个微卫星座位排除了一些参与交配的雄性成为 子代的真正生物学父亲的可能。张于光( 2 0 0 3 ) 利用其筛选的1 0 对有效引物，就 成功的鉴定了7 个父子关系不清的东北虎后代。 本次研究是利用分子生物学的方法构建林麝富含微卫星重复序列的d n a 文库，然后通过测序找到微卫星重复序列。这种筛选的方法的优点是，所获得 微卫星座位对于自身物种具有良好的适用性，能很好的分析该物种的遗传多样 性，利于对于该物种展开大规模的研究。由于微卫星多分布在基因组中的非编 码区域，突变率较高。对于很多物种来说，都需要采用该方法来找到自己的微 卫星座位。 6 阴川大学硬t 论丈- 2 材料和方法 2 1 材料 一只雄性林麝的肌肉组织。由都江堰养麝研究所提供d y n a l 磁珠为m 2 8 0 链霉亲和素包被的磁珠。生物素标记探针包括：57 ( c a a ) 837 生物素，5 ( a g c ) s3 生物素。b i o t i n 标记由上海生工有限公司完成。 接头序列为 o l i g o a 序列：5 g g c c a g a g a c c c c a a g c t i g 3 7 o l i g o b 序列：37 - c c g g t c t c t g g g g t t c g a a g c c t a g p 0 4 5 7 序列合成由北京赛百盛基因技术有限公司合成。 2 2 试剂 ( i ) 2 0 x s s c ： n a c i1 7 5 3g 柠檬酸钠8 8 2g 1 4i 1 1 0 i lh c i 调节p h 至7 0 ，高压灭菌。 ( 2 ) s o b 培养基： 配制每l 培养基，在9 5 0m l 去离子水中加入： 胰蛋白胨2 0 9 ， 酵母提取物5 9 n a c lo 。5 9 摇动容器使溶质溶解。加1 0m l2 5 0m m o l lk c i 溶液，用5m o l l n a o h 调节p h 值至7 0 ( 约需o 2 m l n a o h ) ，定容至1 升。在1 5 p s i 高 压下蒸汽灭菌2 0m i n 。在使用前加入5m l 灭菌的2m o l lm g c l 2 。 ( 3 ) s o c 培养基： s o c 培养基除含有2 0m m o l l 葡萄塘之外，其它成分与s o b 培养基 相同。配制时，向无菌的s o b 培养基加入过滤除菌的1m o l l 葡萄糖， 达到终浓度2 0m m o i l 。 ( 4 ) l b 培养基( l u r i a - b e r t a n im e d i u m ) ： 7 四川丈学硕七论文- - 配制每l 培养基，在9 5 0m l 去离子水中加入： 胰蛋白胨1 0 9 酵母提取物5 9 n a c l l o g 用5m o l l n a o h 调节p h 值至7 0 ( 约需0 2 m l n a o h ) ，定容至 l l ， 1 5p s i 高压下蒸汽灭菌2 0m i n 。配制l b 固体培养基时，在灭菌 前加入琼脂耱1 5 9 i 。 ( 5 ) a m p ( 安卞青霉素) ： 1 0 0 m g i i l l ( 6 ) i p t g 2 ( 7 ) x - g a l 4 0 ( s ) t bb u f f e r ( 9 ) 5 x t b e ( 1 0 0 0m e ) r r i sb a s e5 4g ，b o r i ca c i d2 7 5g ，o 5 m o u e d f a2 0m l ，p i - l $ o 2 3 方法 2 3 t 基因组d n a 的提取 根据 ( 第三版，s a m b r o o kj 耵以2 0 0 1 ) 上提供的提取肌肉组织 d n a 方法，并根据本实验的方法做了些改进： ( 1 )取2 0 0m g 的林麝肌肉组织，并用酒精消毒后的剪刀剪碎，放入一 个1 5 m l 的e p 管； ( 2 )加入5 0 ( i i l l 裂解缓冲液( 含1 0m m o l lt r i s - c 1p h 8 o ，o 1m o l j l e d t ap h 8 0 ，0 5 s d s ) ，混匀，加入蛋白酶k 至终浓度1 0 0 r t g m l ， 混合均匀，在5 5 缓慢摇床消化过夜； ( 3 )将溶液冷却至室温，加入等体积的t r i s 饱和酚，缓慢颠转1 5r a i n 直 至两相混合成乳浊液； ( 4 )室温1 32 0 0r p m1 5 r a i n ，用】m l 枪头缓慢将黏滞的上清液移至另 一离心管； ( 5 )加入等体积的苯酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，缓慢颠转1 5r a i n ： 1 3 2 0 0 r p m1 5 r a i n ，转移上清； 8 四川人学硕士论文- ( 6 )加入等体积的氯仿，上下颠倒数分钟，1 2 0 0 0 r p m1 0m i n ，转移上 清。 ( 7 )将上清液移至另一离心管，加入0 2 倍体积的1 0m o l l 的醋酸铵及 2 倍体积的2 0 乙醇，缓慢颠转离心管，可见白色絮状沉淀； ( 8 )7 0 乙醇洗涤d n a 沉淀2 次： ( 9 )最后1 0 0 乙醇洗涤，于室温下风干d n a ； ( i o )最后加入t e 缓冲液和r n a 酶，r n a 酶浓度至终浓度2 0 9 e d m l ， 3 7 保温3 0 r a i n 后，于4 c 缓慢摇动溶解1 2 - 2 4h 直至d n a 完全 溶解，储存于4 c 或2 0 备用。 注意事项：在( 7 ) 步为了获得高分子d n a ，可放于- 2 0 c2 0r a i n ； 在( 9 ) 步风干时尽量避免完全风干否则很难溶解； 用0 8 的琼脂糖电泳( 水平电泳槽，b i o r a d ，美国) ，对比d l 2 0 0 0m a r k e r 亮度，检测d n a 浓度。 e 2 3 2 基因组d n a 酶切争连接人工接头及酶切产物回收 一 取基因组d n a 大约l ou g ，用s a u 3 a i 限制性内切酶消化。 基因组d n a 6r t g ( 大约l o 此) s a u 3 a i ( 1 0 u _ t l ，瑚c a r a )5 此 1 0 x h b u f f e r3u l 亟堕h 2 q ! 也l t o t a l ： 3 0 9 l 3 7 c 消化大约l o 个小时，消化后，取2 此电泳检测消化结果，电泳显示d n a 片段长度在3 0 0 1 0 0 0 b p 之f b j ，即可进行下一步骤。 将酶切产物用用酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提酶切产物，然后用冷 的异丙醇沉淀，7 0 乙醇洗涤d n a ，溶解于t e 缓冲液中，然后与s a u 3 a 1 人工 接头o l i g o a 和o l i g o b 连接。 s a u 3 a 1 人工接头的制备：将等体积的o l i g oa 链1 5 p l ( 2 5p m o l l l ) 和 o l i g o b 链1 5i t l ( 2 5p m o l 此) 混匀，短暂离心l os ，8 0 c 加热1 0m i n ，室温( 约 2 0 ) 放霄6 0m i n ，制备成1 2 5p m o l 此的s a u 3 a 1 人工接头。 9 网j i f 大掌硕士论文 s a u 3 a 1 人工接头0 2 5p m o l p , l )3 此 酶切d n a9 0 n l t 4 连接酶( 3 5 0 u ，t a k a r a )l 此 1 0 , , t 4l i g a s eb u f f e rl l 乩 盟氇q：吐 t o t a l ：11 0 1 t l 4 c 连接过夜。 为了检测连接是否成功，用o l i g o a 作为上、下游引物进行f c r f 增。 p c r 反应体系如下： 1 0 x p c rb u f f e r 2 5 虹， m g c h ( 2 5r e t o o l l ) 1 5i , t l d n t p ( 2 5m m o l le a g t t )1 0 儿 t a q 酶o u p l ，天为时代) 1 5 皿， 接头一酶切d n a 8 此 o l i g oa ( 2 5p m o l i t l )8 儿 查直至丝q ： 至：主哇l t o t a l -2 5 止 p c r 扩增程序为：7 2 延伸5m i n ，然后9 4 变性5m i r a 接着进行1 8 个循环，每个循环为9 5o c5 0s ，5 5 0 c5 0s ，7 2 0 c9 0s ；最后在7 2o c 延伸5 m i n 。 用l 琼脂糖凝胶电泳检测p c r 产物。 用胶回收试剂盒回收酶切产物，切胶4 0 0 9 0 0 b p 长度d n a 。 ( 1 )用新的丑姬缓冲液； ( 2 ) 加入等体积的b i n d i n gb u f f e r ( 假设凝胶为1 9 m 1 5 0 2 9 凝胶，需要加入 0 2 m l b i n d i n gb u f f e r ) 5 5 c - 6 6 。c7 m i n 。 直到凝咬全溶，可上下颠倒或 旋涡振荡； ( 3 ) 溶解后的溶液加入一个收集管，8 0 0 0 1 0 0 0 0 r p m ，l m i n 。掉管中废液； ( 4 ) j i i k 3 0 0 1 t lb i n d i n gb u f f e r ，1 3 2 0 0 r p m ，l r n i m ( 5 ) n a 7 0 0 p ls p w 静置3 m i n ，1 3 2 0 0 r p m ，l m i m ( 6 )重复第五步一次； ( 7 ) 用空管1 3 2 0 0 r p m 离尽废液； ， 0 网川丈学硕t 论文- - ( 8 ) 加入3 0 5 0 9 ld n a e l u t i o nb u f f e r ，并将吸附柱放a e p 管，静置3 m i n ， 1 3 2 0 0 r p m ， i r a i n ： ( 9 )重复第八步一次； ( 1 0 ) 定容3 0 p l 。 2 3 3 磁珠富集微卫星d n a a ：( 1 ) 在1 5 m l e p 管中加入新吸取的1 0 0 l m 一2 8 0 磁珠( 1 0 m g m l ，d y n a b e a d s m - 2 8 0 ，d y n a lb i o t e c h ，挪威) ，置于磁力架上架( d y n a lm p c s ，d y n a l b i o t e c h ，挪或) 上1r a i n ，吸去清夜； ( 2 ) 用l w b ( 1m o l l n a c l ，1 0m m o l lt f i s c i ，p h7 5 ，lm l l l o i l e d t a ，p h8 o ) 用相同方法洗涤两次，除去游离的链霉亲和素； ( 3 ) 加入2 0 0p l 2 x w b ( 2 m o l l n a c i ， 1 0 m m o l l t r i s l ，p h 7 5 ，1 m m o l le d t a ，p h 8 o ) ，重新悬浮磁珠； ( 4 ) 加入2 0 0p m o l3 端标记生物素的探针和适量的水，使总体积为4 0 0 p l ，室温反应3 0 m i n ，使链霉亲和素磁珠与生物素探针结合； ( 5 ) 用i x w b 洗涤一次，6 s s c 洗涤两次，最后用5 0p l 6 x s s c 重悬，放 在7 0 预热； b ：将酶切回收片段4 0 0 9 0 0 的d n a 于一个0 2 m lp c r 管中，同时加入d n a ， 1v l ，o l i g oa ( 2 5p m 0 1 ) ，1 5 ”l2 0 s s c ，3 0 儿m i n i qh 2 0 形成5 0 皿d n a 混 合物。9 5 变性1 0 m i n ，然后在探针的杂交温度( 表1 1 ) 下加入第一步的7 0 c 预热的探针，在这个温度下杂交6 0m i n 表i l 各探针的杂交温度 t 。a b 。1 。e ，1 - - 1 、h y b ，r i d i z a t i o n 。t 。e m p e r a t u r e s ，f ，o 。r t h e o ，1 i g o u n u e 。1 e o ，t i d e s 探针 熔融温度 杂交温度h y b p r o b e t m ， - 网川大学硕士论文- c ；杂交结束后，将杂交后m 2 8 0 磁珠分别用lm l2 s s c 洗4 次，5n l i n 次； 1 s s c 洗4 次，5m i n 次；然后将磁珠悬浮于1 0 0 皿的1 s s c ，分成4 份， 每份分别加入2 5 0h l 的1 s s c ，于各自的洗脱温度下孵育1 0 m i r a 然后快速移 去上清液，室温下磁珠分别- 与4 0 0t t lt e 、5 0m m o l ln a c i 孵育3 0s ，除去没 有结合上的多余的d n a ：最后悬浮于5 0 此m i n i qh 2 0 ，得到磁珠富集微卫星 产物。 d ：p c r 富集磁珠富集后的d n a 产物 取1 0 0 u g 带有微卫星片段的磁珠作模板，以5 0 p m o l o l i g o a 为引物，进 行p c r 扩增： 1 0 ) ( p c rb u f f e r + ( n h 4 h s 0 4 ，天为时代1 ：4u l d n t p ( 1 0 m m ，天为时代) ：4 u l t a qd n a p o l y m e r a s e ( 1 u u l 天为时代) ： l1 1 l o l i g oa ( 2 5 p m o l u 1 ) lu l 磁珠( 5u g u l ) ：2 0 u l m g c l 2 ( 2 5m m 。m b i ) ： 8u l d d h 2 0 ： 2u l 4 0 u l 扩增程序为：9 5 ( 2 变性5m i n ：然后在扩增仪( g e n e a m p p c rs y s t e m9 7 0 0 ) 上进行5 个循环，每个循环为9 5o c3 0s ，5 5 0 c5 0s ，7 20 c6 0s ；然后又 进行2 5 个循环，每个循环为9 2o c3 0s ，5 5 0 c5 0s ，7 2o c6 0s ；最后在 7 2o c 延伸1 0 m i n 。 用l 琼脂糖凝胶电泳回收p c r 产物，用步骤2 2 2 所示方法，用胶回收试 剂盒回收d n a 长度在4 0 0 9 0 0 b p 之f b j 的片段。 2 3 4 连接t 载体和转化 将上步的p c r 回收产物与p m d l 8 t 载体( t a k a r a ) 相连接： p c r 扩增富集产物( 5 n g t t l )7 皿 p m d l8 - t 载体( 5 0n g t t l ，t a k a r a ) l “l l i g a t i o ns o l u t i o ni ( 2 ) 8 肛l 网川大学硬t 论丈- - 1 6 连接6 个小时。 高效大肠杆菌j m l 0 9 感受态细胞的制备： i )用无菌接种丝蘸取冻存于l b 甘油中的e c o l i 细胞，在l b 琼脂平扳表 面划线，于3 t c 培养过夜； ( 2 )挑取一个单菌落于含3 m ls o b 培养基的小试管中，3 7 ，2 0 0 r p m 培 养过夜； ( 3 )吸取过夜培养的菌液0 5 m l 于5 0 m l 的s o b 培养基的锥形瓶中，1 8 c 强烈振荡1 4 1 7 小时左右，至0 d 6 0 0 约为0 6 ； ( 4 )培养液于冰上放置1 0 r a i n ，然后转移至5 0 m l 的离心管中，4 。c3 5 0 0 r m 离心1 0 m i n ； ( 5 )去上清，用1 5 m l 冰预冷的t b 缓冲液重悬沉淀，冰上放置1 0 m i n ，4 3 5 0 0 r m 离心1 0 r a i n ； ( 6 ) 去上清，加4 m l t b 缓冲液和2 8 0 1 t ld m s o 重悬沉淀，使d m s o2 8 c i 止 到最终浓度为7 ； ( 7 )冰上放置1 0 m i n ，分装成2 0 1 3 l 吐于e p 管，保存于液氮中。 感受态细胞转化效率测定： ( 1 )将2 0 1 3 i 儿感受态细胞置于冰上，解冻后，分成2 管； ( 2 ) 加l 皿的标准质粒( 1 肛g ，此) 于其中一管感受态细胞中，作为阳性对照， 另一管加入l 此灭菌水，作为阴性对照，将两管分别混匀，冰上放置 3 0 m i n ； 。 ( 3 ) 4 2 热击9 0 秒，置于冰上，3 m i n - ( 4 )加0 8m l s o c 液，混合后，3 7 强烈振荡：4 5 0 r p m ，6 0 m i r a ( 5 ) 取1 0 0 1 s l 菌液均匀涂于含1 0 0 l _ t g m l a m p 的l b 培养基平板上； ( 6 )3 7 倒置培养过夜； ( 7 )第二天检查阳性对照有多少菌落长出，同时观察阴性对照有无菌落。 转化效率的计算： 标准质粒l 斗g ，转化到l r a l 垦，涂1 0 0 l 旺。 菌落数l 1 0 0 0 1 0 0 = 转化效率，理想菌落数为1 0 0 以上。 所以转化效率在1 0 7 1 0 8 一个好的感受态细胞，转化效率应该在1 0 8 ，阴性对照应该没有菌落。 鸥f f 大学硕十论文- 连接产物的转化 ( 1 )将2 0 0 1 t l 感受态细胞室温解冻后，置于冰上，分成2 管； ( 2 )加6 止的连接液于感受态细胞中，混匀，冰上放置3 0 m i n ： ( 3 ) 4 2 热击9 0 秒，置于冰上。加o 8 m l s o c 液，混合后，3 7 振荡 6 0 m i r a 速度：4 5 0r 口m ； ( 4 ) 4 0 0 0 r m 在室温离心5 r a i n ，吸出8 0 0 1 t l 上清后，重悬沉淀，2 0 0 此菌 液均匀涂于含1 0 0 r t g m la m p 、7 皿i p t g ( 2 0 0 m g m l ) 、4 0 “l x - g a l ( 2 0 m g r n l ) 的l b 培养基平扳上； ( 5 ) 3 t c 倒置避光培养过夜，蓝白斑筛选，挑取重组子到含有l b a r n p 的 9 6 孔文库板中，构建富集微卫星的小片段插入文库； ( 6 )余下的菌液加入入1 5 的甘油，储存于8 0 。 2 3 5 阳性克隆的筛选和鉴定 用灭菌牙签挑选培养基平扳上的白色菌斑，接种到每孔含有l o o 儿的 l b + a m p 培养基的9 6 孔板中。3 7 ，静置培养2 h 。构建好微卫星工作文库。 采用p c r 方法筛选微卫星座位。对于2 个文库，我们分别以o l i g o a 和 没有标记生物索的探针( c a a ) 3 和( a g c ) s 作为引物，用工作文库的菌液作 为模板，进行p c r 扩增。同时，对实验室以前构建的( a c ) n 的文库也进行 p c r 筛选。同样以o l i g o a