（生物化学与分子生物学专业论文）蒺藜苜蓿rop基因的克隆及功能研究.pdf

” 童盟杰掌2 q 鳗揖硬士研究生掌位蝗盘 蕻藜苜蓿中屁物因的克隆及功能研究 蒺藜苜蓿中r 卯基因的克隆及功能研究 学科专业：生物化学与分子生物学研究方向：真核生物基因及分子生物学 研究生：连瑞丽指导教师：赵德刚教授王彦章博士 摘要 r o pg t p a s e 是植物特有的一类小g 蛋白，属于r h o 亚家族成员。r o po t p a s e 信号在参与调控花粉管的极性生长、调节植物根毛极性发育方面承担关键性的作用。 根瘤菌与豆科植物建立共生关系过程中植物的管状结构侵染线的形成也是 一种极性生长。本研究目的就是寻找蒺藜苜蓿与根瘤菌共生固氮过程中参与侵染线 发育的r o p 基因，探索r o pg t p a s e 在共生互作过程的调控作用。 应用生物信息学的方法，从蒺藜苜蓿的数据网站，检索到2 0 个可能编码r o p 基 因的候选t c 序列。根据t c 序列设计引物，通过r t p c r 的方法，从蒺藜苜蓿中克隆 到两个c d n a 片段r o p 2 和r o p 6 ，两个片段都包含全长5 9 4 b p 的o r f 阅读框，编码1 9 7 个氨基酸。同源查询及序列分析，发现r o p 2 和r o p 6 的氨基酸序列与拟南芥1 1 个 r o p 蛋白同源性都达! n 5 0 以上；对两个基因在植物不同组织特异性表达分析，发 现均没有明显的组织特异表达；缺n 和盐处理也没有发现差异表达；根瘤菌侵染诱 导后r o p 2 和r o p 6 均有增强表达。这些实验结果表明，r o p 2 和r o p 6 基因很可能 参与豆科植物与根瘤菌共生过程的建立。 我们分别构建了r o p 2 和r o p 6 的植物表达载体，对蒺藜苜蓿进行遗传转化， g u s 组织化学染色表明目标基因已经获得成功转化，为r o p 基因进一步详细的功能 研究打下基础。 关键词：蒺藜苜蓿；r o pg t p a s e ；r o p 2 ；r o p 6 ；遗传转化 3 贵州大掌2 0 0 6 届硕士研究生掌位论文蒺藜苜蓿中吊糯园的克隆及功能研究 m o l e c u l a rc l o n i n ga n ds t u d yo nt h ef u n c t i o n o fr o p g e n e sf r o mm e d i c a g ot r u n c a t u l a s p e c i a l t y ：b i o c h e m i s t r ya n d m o l e c u l a rb i o l o g y r e s e a r c hf i e l d ：e u e a r y o t i eg e n ea n dm o l e c u l a rb i o l o g y p o s t g r a d u a t e ：r u i l i l i a na d v i s o r ：p r o f d e g a n g z h a od r y a n z h a n gw a n g a b s t r a c t r o p , ap l a n t s p e c i f i cs m a l lg t p a s e s ，i sas u b f a m i l yo fr h o g t p a s e s r o p sa l e a l s oi n v o l v e di nt h ed e v e l o p m e n to fc e l lp o l a r i t yi np o l l e nt u b e sa n dt h er e c e n ts t u d i e s d e m o n s t r a t eap i v o t a lr o l ef o rr o p si nr e g u l a t i n gv a r i o u sa s p e c t so fr o o th a i r d e v e l o p m e n t i nt h ed e v e l o p m e n to fr o o th a i rt h er h i z o b i n m l e g u m ei n t e r a c t i o n sd e p e n do nt h e f o l - mo ft h ei n f e c t i o nt h r e a d t h ef o r mo ft h ei n f e c t i o nt h r e a di sa p o l a r i t y d e v e l o p m e n t t h er e s e a r c ha i mo ft h i ss t u d yi s t oo b t a i nt h eg e n e sr e g u l a t i n gp o l a r i t y d e v e l o p i n go ft h ei n f e c t i o nt h r e a di nt h er h i z o b i u m l e g u m ei n t e r a c t i o n st op r o v i d es o m e i n f o r m a t i o na b o u tt h ef u n c t i o no ft h er o pg t p a s eb e t w e e ns y m b i o t i cp a r t n e r s u s i n gb i o l o g i c a li n f o r m a t i c sa n dh o m o l o g yg e n ec l o n em e t h e d ，w i t ht h et e c h n i q u e o fr t - p c r ，t w oe d n ac o l o n e sf r o mm e d i c a g ot r u n c a t u l a , r o p 2a n dr o p 6 ，w e r e o b t a i n e d t h ef u l l l e n g t ho ft h er o p 2a n dr o p 6c o n t a i n i n ga5 9 4 b po r f , w h i c he n c o d e s 1 9 7a m i n oa c i d s t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c ea l i g n m e n ts h o w st h a tr o p 2a n d r o p 6h a v e 5 0 i d e n t i t yw i t ht h el l r o p sf r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n a ；a c c o r d i n gt o t h ee x p r e s s i o np a t t e r n ，t h ee x p r e s s i o no ft h et w og e n e si sn o tt i s s u r e s p e c i f i c ，b u tt h et w o g e n ei n d u c e db yr h i z o b i u me x p r e s s e ds t r o n g l yt os o m ee x t e n t ；t h er e s u l t ss h o w e dt h a t p l a n t - s p e c i f i cr o pp r o t e i n sm a y b ep l a ya ni m p o r t a n t r o l ei nt h er h i z o b i u m 。l e g u m e i n t e r a e t i o l l 5 w ec o n s t r u c t e dt h ep l a n te x p r e s s i n o nv e c t o r so fr o p 2a n dr o p 6a n dt r a n s f o r m e d t h e mi n t om e d i c a g ot r u n c a t u l a k e yw o r d s ：m e d i c a g ot r u n c a t u l a ；r o pg t p a s e ；r o p 2 ；r o p 6 ；g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n 4 贵州大掌2 0 0 6 届硕士研究生掌位论文蒺藜苜蓿中舟腿因的克硅? 及功能研究 第一部分文献综述 1 模式豆科一蒺藜苜蓿 蒺藜苜蓿是模式豆科植物，是继拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 和水稻( r i c e ) 基因组大规模测序之后又一个基因组全部测序的植物( b a r k e r 等，1 9 9 0 ) 。目前已经 在包括美国、欧盟和法国的一些实验室展开了一个国际问合作的蒺藜苜蓿基因组测 序计划。参与蒺藜苜蓿基因组大规模测序的合作单位主要有美国明尼苏达州州立大 学和俄克拉苛马州州立大学( 染色体1 、4 、6 、8 ) 、t i g r ( 染色体2 和7 ) 、英国桑 格研究所( 染色体3 ) 和法国i n r a - c n r s ( 染色体5 ) 等研究单位。 蒺藜苜蓿基因组测序计划重点包括：1 ) 构建遗传和物理图谱，在蒺藜苜蓿、豆 科植物以及模式植物拟南芥之间开展比较基因组学研究；2 ) 基因功能研究，包括 构建基因序列数据库并进行大规模基因表达分析；3 ) 生物信息学研究，包括数据库 和数据资源的分析及相关资料的公布。这项计划的实施旨在加速一些重要农艺性状 的基因的发现，从而提高对豆科作物中基因和基因组演变的认识。 测序工作进展到现在，最直观的收获就是得到大批量的表达序列标签( e x p r e s s e d s e q u e n c et a g s ，e s t s ) 。截止到2 0 0 4 年初，已经获得相当密度的物理图谱，得到了 2 0 0 0 0 0 个e s t ( e x l j r e s s e d s e q u e n c e t a g s ) 。为了保持与蒺藜曹蓿遗传学保持同步， 几家生物信息学团体也相继建立了不同的数据库，把蒺藜苜蓿的e s t 或者b a c 序 列聚积起来，人们可以在许多网址( t h ei n r a - c n r s g e n o s c o p e ，n o b l ef o u n d a t i o n , a n dn s fp r o j e c t s ) 看到构建的e d n a 库和e s t 序列，也可以通过进入网页 ( h t t p ：w w w m e d i c a g o o r g ) 链接到其更多有关测序的共享资源。这些数据库的数据 不仅包含植物的各种主要组织( w u l fe ta l 2 0 0 3 ) ，还综合了植物的不同发育阶段和 用不同的微生物病原体、细菌和真菌共生体( b u r l e i g he a l l 9 9 7 ) 、昆虫有害物以及 不同外界胁迫处理的材料( h a r i d a se ta 1 1 9 9 6 ) 。这些不同的信息库之间是互相链接 的，能为研究人员提供一整套的技术手段来阐述与豆科生物相关的基本问题 ( o l d r o y de ta 1 ，2 0 0 1 ；o l d r o y d2 0 0 3 ；p e n g1 9 9 6 ；p e n m e t s a2 0 0 0 ) 综合分析这些来自 多个单位的研究结果具有更大的可信度。蒺藜苜蓿基因索引能为研究人员提供一个 基因相应表达模式的最初迹象( s m a l l e ra 1 1 9 9 6 ) 。随着蒺藜莒蓿基因组大规模测序 的进行，越来越多的免费资源为研究人员提供了越来越多的帮助( t h o q u e t e t 5 a i 2 0 0 2 ) 。大羹的e s t 序捌糯t c 序列跌及释种信怠学分析鄱有助予入 f 】进一步韵 磅究( s a 廷e r 露a l 2 0 0 0 ) 。 2 臻蛋耋 小g 虽自( s m a n 限p a 辩s ) 窳羧成鼹是荸俸予异三豢傣好爨酝，入稍遇常称完为小g 蛋融。小g 虽自家族成员都具衡几个保守的结构特锻，包攒娌个鸟梭替酸结合区鄢 一令效痤器势予绥会嚣( 蚕i 囊a ) ( 瓢耀e ta l 2 0 0 2 ) ，毽楚蠢、g 蛋壹慈绣褥帮凌麓菇 蕊基骞骧显鲍多榉我。真竣塞物利鼹小g 蛋鑫形式懿多榉避秘其不鞠岛援营羧结合 态，调控着细胞许多重要的缴璃过稔( t a k a i 甜a l 2 0 0 1 ) 。在真核生物有机体进化 孛，小g 蛋巍籀爨缳守，美存一争霉霈器守鳃臻麓嚣域，帮l l v 结穗嚣，这氇蒋瑗恣 它狂细胞信母转碍i 建程中的黛鬻作用。小g 龋白的同源序列猩酵母、人类和植物中 魏稽著裰关髂鬟壤功惩。热蒙植蘩中存在簧数量据愆麓物较少豹异曼蒙体g 蚤自， 那么夺g 蛋寤农毯秘信号转譬孛撵菇塞鼗熬分予秀美鹱显瑟荔怒了( y m l g 拼 a l 2 0 0 2 ) 。近年来，随着不断发现撼物中小g 蛋自家族的新成员，嘏不断桶示小g 蛋白麴囊功能。诲多檀物特宥的信譬途径葶鞋功能嚣受小g 蛋岛这个熬装鲍分子聂关 寒宠成。 魏1 1 孛g 萤藏瓣铩守结耱嚣秘璃控过凝 f 毽1 1c o m c r v e ds t r u c t u r ea n dr e g u l a t i o no f s m a l lo t p a s e s ( y a n g e ta l 2 0 0 2 ) 小g 蛋融家族至少分为5 个渡家族，包括r a s 、r h o 、r a b 、a r f 和r a n 2 0 0 ，p 2 0 0 ，表明r n a 的纯度很高，不存在蛋白质、多糖和酚类的污染。 表2 7 总r n a 的紫外分析结果 2 6 0 2 8 02 6 0 2 3 0r n a ( , u 跏d 1 9 72 31 1 2 2m t r o p 2 和m t r o p 6 的克隆 用r t - p c r 方法，从人工气候室( 2 5 ，光照1 8 1 e 黑暗8 h ) 生长的蒺藜首蓿幼苗 的总r n a 中扩增出特异条带( 图2 2 ) 。将目的片段分别克隆到t 一载体p m d l 8 一 v e o o r 后，p c r 检测条带大小与预期r o p 6 序列大小8 0 0 b p 左右，r o p 2 序列大小6 8 0 b p 左右基本一致( 图2 3 ) 。 圈2 2 霆。j p 2 帮露d 黝的r t - p c r m 1 ：枷i n d i im a r k e r ( 见附录a - 2 ) m 2 ：d 2 0 0 0m a r k e r ( 见跗录办1 ) 2 3 生耪信息学分橱 瀚2 3r o p 2 和r o p 6 克隧到p m d l 8 - v e c t o r 厮，阳性转化子的p c r 检测 肫d l 2 0 0 0m 幽敝附录a 一站 2 3 1 以拟南芥1 1 个震dp 纂因序列筛选蒺藜苜稽的e s t 数据库和t c 序列 现有研究结栗表明烈，p 蘩因具有高度的保守往，嘲此我们以拟南芥中的1 1 个 照妒蒸因序列作为鸯诲序列，在蒺藜越蓿的数据库( h t t p ：w w w t i g r o r g ) 中进行 b l a s t n 搜索。通过阿源性、结构域的比较以及进化树分析，我们筛选到2 0 个可能 编璐舳p 基瓣瓣全妖秘部分全长改谡秘摩列c ( 霓文皴综述表1 2 ) 。其中t c 9 5 4 5 0 、 t c l 0 7 4 3 2 、t c l 0 8 1 8 1 和t c l 0 8 8 3 2 等包含全长c d n a 序列，与拟南芥中用卯基因在核 营酸痒鬟上豹一致毪在7 5 戮圭。 2 3 2 开放阅读框，功能位点、保守结构域分析 麓这些游殛遘符开放阅读稚趣分析，确定了它翻编码豹氮基酸彦磺，然露矮 p r o s i t e 数据库分析了蛋白结构位点。用n c b ic d d 数据库分析了保守功能结构 域。它稻都禽有r h o 保守结构域。 2 3 3 全长c d n a 生物学分析 2 3 3 1 序列测定和可读框架分析 将得到鲍克隆测序，得到薅个7 5 0 b p 左右的全长c d n a 缪列，命名先r o p 2 ( 鳖 2 4 ) 和r o p 6 ( 图2 5 ) 。联网到n c b i 的o r f f i n d e r 服务器对全长基因进行可读框架 分掇，结果发理其鄙缡玛1 9 7 个氨基黢。 a a c t 怕舳瑚瑚翎蝴c a n 朗棚c c 霉g 蝴t 糖碧呲a 妇c c 铲锄黜a 黼柏c n g a 舭鞠n a g 甜t c t g a a 9 2a t p a g t g g t t c c a g g t t c a t c a a g t g t g t c a c t g t t g g t g a t g g t sgsr flkcvtv6dg 1 3 7g c c g t t g g a a a g a c t t g t u g c t t a t c t c c t a c a c c a g c a a c a c t 量捌盎堂2 q q 星塑妻缝塞生整堡缝煮壅熬笪堕史丝坚整嘲竺皇璧垫整丝逖墨一 1 8 2t t c c c t a e g g a c t a t g t g c c g a c t g t e t t t g a e a a t t t c a g t g e a f ptdyvptvfdnfsa 2 2 7a a t g t a g t t g t g g a t g g g a g c a c t a t a a a t e t c g g g t t g t g g g a t nvv vdgstlnl ，glwd 2 7 2a e t g c t g g c c a a g a a g a t t a e a a t a g a t t a a g a e e e t t a a g c t a t tagq取dynrlrp lsy 3 1 7c g t g g a g c a g a t g t t t t e e t g c t t g c t t t t t e t e t e a t a a g e a a g roadvfllafsl18k 3 6 2g e c a g e t a t g a a a a t a t t g e e a a a a a a t g g a t t c c t g a g t t g a g g as ￥塞n1 矗kwipebr 4 0 7c a t t a t 蝌c c t g 舒磬t c c a a t t a t t c t c g t g g a a c a a a a e t t hyapa vp1 ilvgtkl 4 5 2g a t c t t c g g g a t g a t a g e e a g t t c l t c a a g a e c a t e e t g g t g c g dl r ddsqffqd 珏争ga 4 9 7g c g c c a a t c a e e a e a g e a c a g g g t g a g g a a c t g a g a a a a e t t a t e ap1ttaqoeblrkl1 5 4 2g g t g e t e e a g t t t a c a t t g a a t g t a g t t c e a a a a c a c a g a a g a a t gapvyiecssktq kn 5 8 7g t g a a g g e t g t t t t t g a t t e g g c e a t c a a a g t a g t t c t a c a g c e a vxavfdsaikvvlqp 6 3 2e e a a a g c a a a a g a a a a e a a a g a g a a a g g g g e a a a a a g c e t g t t e e pkokktkrkgokacs 6 7 7a t t t t g t g a6 8 5 l l t c u c a g a c t t c g t a t t g t a g a c g t g g a g g a t g 嘲2 4r o p 2 的核哿酸序列及其编码的氨基酸序列 讯= t c 雄托| c a c g 既l 勰t g g 蜮鐾c 瘿a 4 t t g 勰磐帮a l 啦n g 擎g 酽磬殍枣g 鱼g l 铲髓t 蜒雒l g 越赫g 殍辨甜拶l c l 摆蹲a 鬏落t | t _ 萨 a a g a a g 1 1 2a t g a g c g c t t c t a g g t t e m c a a g t g t g t t a e t g t t g g g g a t g g a msasrfikcvtvgdo t 5 7g e t g t t g g t a a a a c t t g t t t g t t a a t t t e a t a c a c e a g c a a t a c e avaktcll1sytsnt 2 0 2t t e e e e a c t g a c t a t g t g e c a a c t g t c t t c g a c a a t t t c a g t g e a fptdyvptvfdnf sa 2 4 7a a t g t g g t t g t g a a t g g a a g c a c t g t g a a t c t g g g t t t g t g g g a c nvvvnostvnlglwd 2 9 2a c t g c a g g a c a a g a g g a t t a t a a c a g a t t a a g a e c t t t g a g t t a t 零矗gqe 赫yn巍l巍plsy 3 3 7c g t g g t g e c g a t g t t t t c a t t c t c g c t t t c t c c e t c a t a a g e a a g rgadvfilafs lisk 3 8 2g e c a g t t a t g a a a a t g t t t e c a a a a a g t g g a t t c c a g a g t t g a a g asyenvskkwlp elk 4 2 7c a t t a t g c a c c t g g t g t t e e c a t t a t t c t g g t t g g c a c a a a g c t t hyapgvplllvotkk 4 7 2g a e e t t c g g g a t g a e a a g c a g t t c t t c g t e g a e e a t e e a g g t g e t dlrddkqffvdhp6a 5 1 7g t t e c t m t a c c a c t g c t c a g g g a g a a g a g c t t a g g a a g e t g a t c vplttaqg 基elrkkl 5 6 2a a t g c a e e t g c t t a t a t c g a a t g c a g t t c g a a a t c a e a g c a g a a t 责州大掌2 0 0 6 届硕士研究生掌位论文蒺錾苜疆，碰2 隧因的宾t 1 堂丛壁整叠壅 6 0 7g t g a a a g c a g t c t t t g a t g c a g c c a t a a g a g t t g t c c t t c a a c c a vkavfdaairvvlqp 6 5 2c c a a a g c a a a a g a a a a a g a a g a g t a a a g c a c a a a a g g c t t g t t c g pkqkkkkskaqkacs 6 9 7a t a r t g t g a7 0 5 il m g c 纽g 昏c g 昏c t a a a g a 醐m g a c 船c c a n d c c 柚l g 嘣n _ 嘶：嘲c “c t t a = t a t t m 翻n c c t a t t a t gc t _ 醇a g g n g g a g t c 切t g t g g g t g t t c t a c g t 图2 5r o p 6 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列 2 3 4 同源序列比较 将j r 0 尸2 和尺d 尸6 与拟南芥数据库进行序列相似性分析，发现该基因的氨基酸序 列和拟南芥1 1 个r o p 同源性达至u s o 以上( 图2 6 ) 。( 从上到下依次为a r a c 6 、1 1 、 1 、3 、4 、5 、2 、1 0 、8 、7 和a r a c 9 ) 图2 6r o p 2 和r o p 6 氢基酸序列和拟南芥数据库b l a s t 分析 2 3 5 蛋白质序列分析 在n c b ic d d 数据库分别对r o p 2 和r o p 6 蛋白结构功能域进行分析，发现r o p 2 和r o p 6 蛋白都具有一个保守的小g 蛋白结构域r h o ( 图2 7 和图2 8 ) 。 图2 7r o p 2 保守结构域分析 爨趔查堂麴鳗攒塑生堡塞生黛照鲨壅熬篷蔓焦鱼缓憋垦壁塞鳖热襞整堡塞 阁2 8r o p 6 保守结构域分析 2 4 r o p 2 和r o p 6 基因表达模式分析 2 ，4 1 缝绥裘运特异往分耩 如图2 9 和圈2 1 0 ，分别以貘藜苜蓿的不同组织器宙根、茎、叶、花和瘤进行 r t - p c r 分析，绩果显示r o p 2 鞠基因并没肖明显的组织特异表达。 图2 9r o p 2 组织特异性表达分析 囤2 1 0r o p 6 维级特异性表达分轿 2 4 2 缺n 和0 1 mn a c i 处璎结果 先矮全n 戆f m 营养滚浇灌嚣蔼，瓣一天浇灌一次，每次浇1 0 0 - - 2 0 0 毫嚣。 再用缺n 和0 i mn a c i 处璎处理生长在人工气候室的蒺藜苜蓿胁遗处理五次( 图 2 1 1 ) ，每天浇水1 0 0 m l 。然聪提取根部总r n a 进行r t - p c r ，研究逆境胁迫处理， 嚣令b o p 基因瓣表达差异。黧2 ，1 2 夔臻慕表黉，遂凌魏遥下羲禳聱露口p ? 窝露 dp 6 的表达岛对照没有明擞差异。 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 蒺藜苜蓿中r o p 基因的克隆及功能研究 图2 1 1蒺藜苜蓿对照与o i mn a c l 和缺n 胁迫处理一周 图2 1 2r o p 2 和r o p 6 逆境处理的表达分析 2 4 3 根瘤菌诱导处理 先用全n 的f m 营养液培养蒺藜苜蓿七天后，再用无氮fm 继续培养3 5 天， 用根瘤菌r m l 0 2 1 ( o d 6 0 0 = 1 ) 接种；不同时间观察根毛经根瘤菌诱导发生的应答反应 ( 图2 1 3 ) 。 r t p c r 结果如图2 1 4 和2 1 5 所示，根瘤菌处理3 0 m i n 和1 5 h 后，月0 p 2 和 r o p 6 基因与未经根瘤菌处理时( c k ) 相比都分别有不同程度的增强表达。 童艘态堂z q q 掇髓生变墨皇爨整鲨奎 熬整蔓焦主戮摄垦笪塞壁热照丝堡壅 圈2 1 3 蒺蓥蘸猪穰毛对裰瘸麓的应答反应 ( a ) 正常横毛( b ) 侵染3 0 分钟根毛( c ) 侵染1 4 , 时根龟( d ) 侵染1 5 小时根毛 图2 1 4r o p 2 根瘤菌诱导表达分析 图2 1 5r o p 6 j t 诞瘤菌诱导表达分析 2 。s3 5 s ：m t r op2 和3 5 s ：m t r op6 檬物表达载体的摘建 2 5 13 5 s ：m t r 0p2 袋达载体棱建 p c a m b i a l 3 0 1 和p b l l 2 1 载体是由上海植物生理生态研究所分予遗传室提供的 带蠢g s 豹空载谯先用e c o r i 靼h i n d l l l 从p b l i 2 1 载体上双酶切褥至i j 3 5 s ：g u s 与用阏 种双酶切的p c a f 1 i a l 3 0 1 载俸连接得到审间载体。利藤合适的b a m h l 和s a e i 位点遴 行政酶切、胶回收用含有酶切位点的p 7 、p 8 引物从含有r o p 2 基因片段的t 载体上p c r 褥剥曩标片段，熙b a m h i 和s a c i 双酶切进移驳回收，将翅这嚣转嗣榉黥酶切得到的 酲椽基因片段和载体片段连接帮得到构建好的表达载体( 豳2 1 砩。 3 l 贵州大掌2 0 0 6 届硕士研究生掌位论文蒺纂苜蓿中席燃因的克隆及功能研究 竺竺兰产“ 鼍甲丫尹 - - 唧t 打。幽妇_ 一m m u ，c 柚姗i i 。葛- j , i 哪瑚， 嘲 。 i + i i d q + i h 枷k 械 如h 帕 k r 日n 皿 嶝卜= = = i 志尊卜扣剩 i：竺竺竺i 。“岫i 耳l i - i 晖一 ”k + o 神 c 1 斗a 睢， - i h - 日 # m 1 - + - l 一，_ 一 o u s “ 1 柚_ ，柚 一 j t o p 2 i 一“ _ _ i 埘) p 2 1 _ j lt 枷 - 乞r 卜* = 。 t 图2 1 63 5 s ：m t r o p 2 植物表达载体构建流程 2 5 23 5 s ：m t r op6 表达载体构建 实验中用到的p c a m b i a l 3 0 1 载体由上海植物生理生态研究所分子遗传室文启光 实验室提供，该载体除含有g u s 以外，还构建有一个包含有启动子和终止子的b a m h l 位点用b a m h l 酶切后胶回收载体片段。用带有b a m h l 酶切位点的p 9 、p 1 0 引物从含 有r d p 6 基因序列的t 载体p c r 得到且标片段，b a m h l 酶切、胶回收，与同样单酶切 的载体片段连接得到构建的植物表达载体( 图2 1 7 ) 。 一r 雌6 j b 删 - t d 姒# 即 ，o h ， 3 菇血哂 图2 1 73 5 s ：m t r o p 6 的植物表达载体构建 贵州大掌2 0 0 6 届司e 士研究生掌位论文蒺尊苜蓿中h o 镰因的克僚及功能研究 2 5 3m t r o p 2 和m t r r o p 6 重组质粒的检测 将上述连接产物转化大肠杆菌d h 5 的感受态细胞，涂板后分别提取单菌落进行 检测，分别得至u 7 0 0b p 大小的有目标带，进一步验证了重组质粒，说明基因已克隆 进表达载体( 图2 1 8 和图2 1 9 ) 图2 1 8r o p 2 重组质粒酶切鉴定图2 1 9r o p 6 重组质粒酶切鉴定 m ：见附录a - 3m ：见附勇t a 1 2 6 蒺藜苜蓿的遗传转化及再生 蒺藜苜蓿的组织培养开始于2 0 世纪9 0 年代，1 9 8 9 年，n o l a n 等人首次通过体 胚发生途径获得了蒺藜苜蓿再生植株( n o l a n e t 以1 9 8 9 ) 。随后又有人采用其它方法 如芽器官发生途径( t r i e ue t 以1 9 9 6 ) 和真空渗透法( t r i e ue ta 2 0 0 0 ) 获得蒺藜苜 蓿植株再生，但结果并不太理想，而运用最多的还是体胚诱导途径，目前已先后有 多种基因被转入蒺藜苜蓿。因此本文也是采用体胚诱导途径( n o l a ne ta 1 1 9 8 9 ) 将 目标基因r o p 2 和r o p 6 对蒺藜苜蓿进行遗传转化，经过侵染、共培养、抗性愈伤 诱导、体胚诱导和再生芽等过程，g u s 染色鉴定发现转化再生芽显蓝色，表明遗传 转化成功( 图2 0 ) 在农杆菌介导的遗传转化中，适当的菌液浓度和侵染时间的长短都是影响转化 效率非常重要的方面。菌液浓度过低，会使农杆菌细胞数目不足导致转化效率较低； 农杆菌浓度太高，菌体产生的某些有害代谢产物对植物细胞造成伤害，农杆菌生长 过盛还会造成愈伤组织的褐化或死亡；侵染时间过长会严重损坏植物组织材料，侵 染时间过短会降低转化效率：经过实验我们发现菌液浓度在o d 6 0 0 值为0 1 左右、 侵染1 5 分钟，遗传转化效率会维持在一个相对的稳定值。 3 3 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文蒺藜苜蓿中成髓因的克隆盈功能哦窭 另外不同的植物组织具有不同的再生效果和遗传转化效率，能过对根、茎和叶 的实验比较，我们最终选择了效果比较好的蒺藜苜蓿叶片。 2 7 转基因植株的g u s 组织化学鉴定鉴定 g u s 组织化学染色的原理是在适宜的反应条件下，b 一葡聚糖苷酶( g u s ) 能将 x g l u c 水解成蓝色物质因此具有g u s 活性的部位或位点就会呈现蓝色。 取遗传转化的蒺藜苜蓿再生芽，放入配制好的g u s 染液中，3 7 。c 保温，染色过 夜。然后取出染色过夜的实验材转入7 0 乙醇中脱色2 - 3 次( 除去叶绿素) ，至阴性 对照材料呈白色，而实验材料仍然显示x - - g l u e 染色液形成蓝色，结果如图22 0d 。 图2 2 0r o p 2 和r o p 6 遗传转化蒺藜苜蓿以及g u s 组织化学染色 ( a ) 共培养叶盘( b ) 诱导的体胚( c ) 体胚的发育( d ) g u s 染色的转基因芽 3 讨论 虽然文献报道r o p 基因在模式植物拟南芥有比较详细的研究，r o p s 基因在拟 南芥中参与了花粉管和根毛的极性发育，一个在空间上调控的r o p 信号网络控制花 粉管的极性生长。但蒺藜苜蓿与拟南芥有着很大不同。首先，蒺藜苜蓿是豆科植物， 所以它有豆科能与根瘤菌共生固氮的特性；其次，它是豆科模式测序植物，从它的 研究得到的信息可以容易用于其他豆科，研究植物微生物共生固氮机理具有重大生 产意义。 那么r o p 信号网络会不会也调控根毛和侵染线的极性发育? 本研究首次提出了r o p 基因可能参与根瘤菌植物共生过程中的侵染线发育的 推论。 通过信息学分析和r t - p c r 技术，我们得到两个全长基因序列r o p 2 和r o p 6 ， 经过序列分析，发现其都具有r o p s 的保守结构。 初步表达模式分析发现两个基因都没有明显的组织特异性表达，并且在逆境处 贵州大掌2 0 0 6 届硕士研究生学位论文蒺藜苜蓿中翮均k 园的克隆反功能研究 理条件下也没有明显的表达量的差异，而当用根瘤菌诱导进都不同程度有所增强表 达。因此我们希望能通过遗传转化的功能分析发现其在豆科植物与根瘤菌共生因氮 过程中所起的调控作用。 因此，本研究分别构建了两个基因的植物表达载体并将其对蒺藜首蓿进行了遗 传转化。转化蒺藜苜蓿进行g u s 组织化学活性染色，发现其已被转入植物组织。 遗传转化是基因工程为了阐明基因的表达机制、研究植物生理和发育过程所不 可缺少的一种重要工具。通过体胚发生途径进行遗传转化时体胚的诱导率高低会严 重影响到遗转化效率。 蒺藜苜蓿的j e m a l o n g 生态型是从一百个蒺藜苜蓿的生态型中选育出来的模式 研究材料( n o h ne ta l1 9 8 9 ) ，高体胚发生率的蒺藜苜蓿株系j e m a l o n g2 h a 则是从 蒺藜苜蓿c v j e m a l o n g 培育得到的( r o s e e t a l 1 9 9 9 ) 除2 h a 株系以外，1 9 9 7 年， h o f f m a n n 等人还培育的另外一个具有高效体胚再生能力的株系r 1 0 8 1 ( h o f f m a n ne t a l l 9 9 7 ) ，每一个外植体都能诱导出大量的体胚，几乎有8 0 的体胚都能在三到四 个月再生出小植株( 1 h i l l le ta 1 9 9 8 ) 。此外也有研究发现高感染强度的农杆菌菌株 可以在一定程度有效的提高遗传转化的效率( c h a b a u d e t a l 2 0 0 3 ) 。 参考以上文献资料本研究选用了高体胚发生率的植物材料j e m a l o n 9 2 h a ，有助 于实验的快速展开。虽然本研究还没有得到遗传转化r o p 2 和r o p 6 基因的再生植 株，完全搞清楚r o p 2 和r o p 6 基因在蒺藜苜蓿与根瘤菌共生关系建立过程中的详 细功能，但是本研究首次提出r o p 基因可能参与根瘤菌植物共生过程中的侵染线 发育，并且从蒺藜苜蓿克隆了两个r o p 基因成功的对蒺藜苜蓿进行了遗传转化，这 对以后进一步r o p 基因的功能研究打下基础，也为揭示微生物植物建立共生关系 过程中r o p 可能起到的调控机理具有重要意义。 那么如果要对下一步的工作做个计划的话，我有以下几点想法： ( 1 ) 对转基因植物做p c r 鉴定，进一步确认目标基因是否转化成功； ( 2 ) 对转基因植株做s o u t h e r nb l o t i n g 分析，进一步鉴定遗传转化效果。 ( 3 ) 利用根瘤菌对转基因蒺藜苜蓿植株进行侵染诱导后做r o p 表达分析。 贵州大掌2 0 0 6 届硕士研究生掌位论文蒺藜苜蓿中角臌园的克硅：及功能研究 附录：本文所用到分子量m a r k e r 图谱 量塑查些垫鳗鱼塑生塑塞生苎堡笙壅 壅壅笪堕生点塑堡垦箜塞壁垒壁整墅塞 缩略语 缩写名英文名 中文名 a a p a b r i d g e da n c h o rp r i m e r 节短的锚定引物 a b a a b s c i s i ca c i d 脱落酸 a m pa m p i c i l i n 氨苄青霉素 a p a d a p t e rp f i m e r 接头引物 a s a c e t o s y r i a g o n e乙酞丁香酮 6 一b a 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e6 苄氨基嘌呤 b p b a s ep a i r s 碱基对 b s a b o v i n e5 e l - u ma l b u m e n 牛血清蛋白 d a g r e s sc e l s i u s摄氏度 c a m v c a u l i f l o w e rm o s a i cv i n “ 花椰菜花叶病毒 c v ( s )c u l t i v a “s )品种 2 ，4 一d 2 , 4 - d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d2 ，4 一二氯苯氧乙酸 d n l p d e o x y n u c l e o t i d et d p h o s p h a t e “l i xo fd a t p d c t p d g t p d t i 甲) 脱氧核糖核苷酸混合物 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核苷酸 姗 d i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e c o i le s c h e r i c h i ac o l 大肠杆菌菌株 e d l a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二氨四乙酸= 钠 日h a e p i p a 如h e l l o b o r i n ea g g l u t i m n农杆菌菌株 e la 1 融a l i a i ( l a t i n ；a n do t l l e r s 、其它 g s p g e n e - s p e d f i cp r i m e r 基因特异引物 g u s p g l u c u r o n i d a s e p 一葡糖醛酸糖苷酶 口1 g l s o p r o p y l 一1 - t h i o b - d g a l a c t o a i d e 异丙基一阻d 一半乳糖苷 h h o u r ( s )小时 k i n k a n s m y c i n 卡那霉素 k t k i h e r i n 激动素 i j b l u r i a - b e r i a n i l b 培养基 m m o l a r 摩尔 n n m i n u t e ( s )分钟 m l m i l l i l i t r e ( s )毫升 m m m i l l i m o l a r 毫摩尔 t u r n a m e s s e n g e r r n a信使r n a m s m u r a s h i g ea n ds k o o gm s 培养基 n a a n a p h t h a l e n e a c e t i ca d d萘乙酸 0 d o p t i c a ld e n s i t y光密度 o