（精密仪器及机械专业论文）数字化量可控细胞显微注射仪实验研究(精密仪器及机械专业优秀论文).pdf

南京理t 人学坝l ：学位论文数4 ，化量刈拄细胞娃微注射仪实验研究 摘要 随着生物技术的发展，显微注射技术在细胞操作方面得到了广泛的应用。本论文 搭建了显微注射系统平台，通过对显微注射仪的测试及注射试验，证明了显微注射仪 微容积的改变对微注射量输出的实现，验证了显微注射仪在生物工程中的应用价值。 在显微注射过程中，对注射量有严格的要求。本文通过对显微注射仪的深入研 究，建立了注射量的数学模型。设计了基于图像处理的皮升级的注射量精密测量的方 法，并通过后期的注射量实验对注射量与注射角度、微针尺寸、驱动电压等参量的关 系进行了研究，得出了微注射量随驱动电压增大等有用的结论，同时还对数学模型进 行了完善和改进。通过数学模型可以快速和有效的计算出实际注射量，可以通过数字 脉冲控制信号实现对注射量的控制。 微流体数字化技术是南京理工大学微系统研究室最新取得的重要研究成果。微流 体数字化技术的研究在基本概念上和理论上有原创性，对微流体系统的研究和技术进 步有重要意义。本论文是上述微流体数字化技术在细胞显微注射技术上的实验研究。 关键词：微流体，显微注射注射量，量可控，压电陶瓷 南京理t 人学坝j 学位论义散，化量o ，挖舅胞挂微沣刺仪实验研究 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fb i o t e c h n o l o g y ，t h et e c h n o l o g yo fm i c r o i n j e e t i o nh a sb e e n w i d e l ya p p l i e di nt h ea r e ao fc e l lm a n i p u l a t i o n ，t h ea m o u n to fi n j e c t i o nd r o pi sd e s i r e d r i g i d l yi nt h ep r o c e s so fm i c r o i n j e c t i o n t h em i c r o i n j e e t i o ns y s t e mi sb u i l t t h eo u t p u to f m i c r o f l u i dc a u s e db yc h a n g i n go fm i c r o - i n j e c t o r sm i c r o v o l u m ei sp r o v e db yt h et e s tt o t h em i c r o i n j e c t o ra n dm i c r o i n j e c t i o ne x p e r i m e n t s a n dt h e m i c r o i n j e c t o r sa p p l i c a t i o n v a l u ei nb i o l o g ye n g i n e e r i n gi se v i d e n c e d m a t h e m a t i c a lm o d e lo fm i e r o i n j e c t i o na m o u n ti sf o u n d e dt h r o u g hd e p t h t h e o r y r e s e a r c ht ot h e m i c r o i n j e c t o r m e a n w h i l e ，t h ep r o g r a mo fm e a s u r i n gm i c r oi n j e c t i o n a m o u n ti sd e s i g n e d t h r o u g hp l e n t yo f e x p e r i m e n t s ，t h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e ni n j e c ta n g l e ， m i c r o p i p e t t e ss i z e ，v o l t a g ea n dm i c r o i n j e c t i o na m o t m ta r er e s e a r c h e d u s e f u lc o n c l u s i o n s s o m el i k em i c r o i n j e c t i o na m o a n ti n c r e a s i n gw i t hv o l t a g ea r ec o n c l u d e d a n dm a t h e m a t i c a l m o d e lo fm i c r o i n j e c t i o na m o u n ti s c o m p l e t e da n di m p r o v e dt h r o u g ht h ee x p e r i m e n t s p r a c t i c a lm i c r o i n j e c t i o na m o u n tc a nb ec o u n t e dr a p i d l ya n de f f e c t i v e l yb ym a t h e m a t i c a l m o d e l i tm a k e st h ec o n t r o lo f m i c r o i n j e c t i o na n a o u n tb yd i g i t a ls i g n a l sc o m et r u e ， t h em i c r o f l u i d i cd i g i t a lt e c h n o l o g yi sa ni m p o r t a n tr e s e a r c ho fm i c r o s y s t e ml a bi n n a n j i n gu n i v e r s i t yo fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g yl a t e l y t h e r ea r es o m ec r e a t i v et h e o r i e si n t h em i c r o f l u i d i c d i g i t a lt e c h n o l o g y i n t h i s p a p e r , t h ea p p l i e d r e s e a r c ho fc e l l m i c r o i n j e c t i o ni sb a s e do nt h em i c r o f l u i d i cd i g i t a lt e c h n o l o g ya b o v e k e y w o r d s ：m i c r of l u i d ，m i c r o i n j e c t i o n ，m i c r o i n j e c t i o ng u n o u n t ，c o n t r o l l a b i l i t yo fa m o u n t ， p i e z o e l e c t r i cc e r a m i c r 7 6 3 0 0 2 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包畲我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名： 勘匹年月驾日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上目公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文。按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：拗r 年g 月砖日 南京理工大学硕士学位论文 数字化量可控细胞显徽注射仪实验研究 l 绪论 1 1 面向生物工程的显欲操作系统 1 1 1 细胞工程技术 细胞工程是指在细胞水平上的遗传操作，即通过细胞融合、核质移植、染色体或 基因移植以及组织和细胞培养等方法，抉速繁殖和培养出人们所需要的新物种的技 术。细胞工程的优势在于避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗 传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞，因而能够提高基因的转移效率。 此外，细胞工程不仅可以在植物与植物之闻、动物与动物之间、微生物与微生物之间 进行杂交，甚至可以在动物与植物与微生物之间进行融合，形成前所未有的杂交物种。 随着人类迈入2 1 世纪，作为前沿技术的细胞工程技术将会得到更大的发展。许 多细胞级操作：如植物细胞的染色体切割，细胞融合，动物卵细胞转基因注射等均成 为当前生物工程的研究热点。目前，经常用到的细胞操作技术主要包括细胞核移植、 细胞内药物注射，细胞核内d n a 注射、胚胎注射及细胞单个分离等。按操作性质分， 细胞操作主要分成两大类：细胞注射，细胞切割“。而目前最常用的是细胞微注射 技术。 l 。1 2 面向生鐾工程盼显徽操作系统 在微纳米科技飞速发展的当前，显微操作系统( m i c r om a n i p u l a t i n gz y s t e m ) 在 微机械制造、纳米加工与测量、半导体工业、自适应光学、生物医学工程、复合材料、 航空舷天等诸多尖端领域中正逐渐成为不可或缺的关键技术。随着操作对象的不断徽 纫化，末端工具在三维空间内操作精度的不断提高，在显微操作技术与生物医学工程 技术的交叉领域内，发展出了面向生物工程的显微操作系统。 面向生物工程的显微操作系统一般自高倍频、高分辨率的显微视觉系统，多自由 度的高精度、大范围定位及校准平台和适于细胞级对象微细操作的末端工具组成，通 过标准化和模块化的高精度定位、校准平台实现分辨率可达纳米级的精密微动，通过 显微图像分析和引导技术实现末端工具图像的实时闭环采集、延时处理、三维标定和 自发引导，并最终通过系统末端工具实现游离细胞的生物医学操作，如捕获和释放单 一游离细胞，向细胞内注入和拾取某一成分，以及测定和记录细胞体的生物电参数等。 自2 0 世纪前半叶开始，显微操作系统首先应用予活细胞的电生理研究。在引入 g r a e s s 噩a n n 的技术以后，向生长于固体支持物上的体细胞进行毛细管微注射的技术 有了很大发展( c e l i s1 9 8 6 ) 。而随着实验条件的标准化，微注射与微操作方法的自动 化，以及计算机辅助与微处理器控制注射系统的产生，注射速率和注射的可重复性都 有了大幅度的提高，也使得轴向定量注射成为可能。在这一相对较新的但却是发展迅 速的研究领域，大量新的并不断改进的转基因方法和技术不断地涌现，一定会给现代 南京理工大学硕士学位论文 数字化量可控细胞显微注射仪实验研究 生物学带来新的革命。 1 2 显徽注射技术概述及发展状况 1 2 1 细胞显徽注射技术 显微注射技术是直接向活体细胞和细胞器内引入物质的最佳方法之一。显微注射 使得我们能够使用单细胞为研究对象，来研究体内复杂的细胞过程、结构和功能。可 以用于微注射的分子很多，如蛋白质、核酸等，都可以注射到细胞里面，并分析它们 在细胞内的活动情况。微注射可以应用在细胞学、细胞生物学、生理学、分子生物学、 发育生物学和药理学等领域。可以分析酶与酶系统的功能、细胞结构蛋白、激素的控 制机制、细胞内和细胞间的调控机制、信号传递与细胞周期研究、转运过程、蛋白质 生物合成和遗传信息的翻译与转录等3 1 。 随着细胞微注射技术的广泛应用，对实验手段和实验设备也提出了较高的要求。 比如，设备操作的容易程度以及微注射量的控制精度等问题。在细胞微注射过程中， 微注射的量一般要求不超过细胞总体积的2 0 ，因此，对微注射量的可控性提出了 较高的要求“。 目前，定量微注射常用的有如下几种方法“： ( 1 ) 包被针尖法 在包被针尖方法中，将针尖( 密闭针) 浸到即将导入到细胞的物质溶液中。然后将 浸蘸有样品液的微注射针刺入细胞，样品在细胞质中溶解。这种方法虽然既快又简单， 但对实际上导入细胞中样品的量是难以控制的。 ( 2 ) 被动注射法 在被动注射方法中，针中充满注射溶液。溶液的填充是依赖虹吸的作用，即将针 管末端插入溶液中使其针头充满溶液。也可将针头置于定体积的样品中，使针的开 放端由于虹吸作用而充满。将针刺入细胞中，样品被动地流入细胞中。这种方法避免 了包被针尖方法所遇到的许多问题，包括由于针尖干燥使样品变性问题。另一个优点 是导入到细胞中的物质的浓度是已知的，但控制注射的量极为困难。这是由于时间、 位置以及导入样品进入细胞的速度无法精确控制。 ( 3 ) 直接压力法 相对于以上两种方法而言，直接压力法微注射应用较为广泛。它对大量的特异分 子如细胞骨架蛋白质是很有效的。这种方法有如下两种不同的方式： 恒定流动显微注射 恒定流动显微注射方法最初是由g r a e s s n l a n ( g r a e s s m a n n1 9 7 0 ；g r a e s s m a n 和 g r a e s s m 锄m1 9 8 3 ) 开发成功的。他提出一种非常优秀的方法将相对恒定量的物质导入 到生长与玻璃器皿的培养细胞中。注射物质的量取决于注射液中样品浓度、通过针尖 的速度和针尖停留在细胞质中的时间。然而由于该方法要精确的测定样品溶液流过针 2 南京理工大学硕士学位论文数字化量可控细胞显微注射仪实验研究 尖的速度是有一定困难的，因此，想精确测定最后注射入细胞中的溶液量是不可能的。 另外该方法所需注射物质较多，因此对于十分宝贵的样品是不适合的。 脉冲流动注射 脉冲流动注射方法可能是当前最为广泛使用的方法。其主要原理是利用压力控制 装置导入可控的脉冲气流来驱动一小份溶液通过针尖，从而实现定量注射。 1 2 2 细胞显徽注射技术发展状况 显微注射最早应用始于将导入的物质包被于玻璃注射针头，并将其植入植物细胞 ( b a r b e r1 9 1 1 ) 。4 0 年代中期，许多研究者使用空微电极研究柔鱼巨大神经细胞的电 特性。在1 9 4 5 到1 9 4 9 年期间，在制造可再生微电极尖直径上取得较大进展，针尖从 2 5um 发展到0 1hm 。到1 9 5 1 年，这些可以作为注射针的电极初期是以小分子流形 式( 1 9 5 1 ) 、脉冲注射形式( 1 9 5 3 ) 将小分子( 如乙酰胆碱) 导入活体细胞。这一工作使注 射与同一电极的记录( 1 9 5 5 ) 以及注射染料来确定在外植组织中细胞伴随生理活动的 记录一系列过程相结合。在以后不到十年间，使用类似的技术直接将生物物质转送到 细胞内( c h a m b e r s c h a m b e r s1 9 6 1 ) 。起初显微注射的目的是向培养的受体细胞中转 移哺乳动物的细胞核( r a e s s m a n n1 9 7 0 ) 和染色体( d i a c u m a k o s1 9 7 3 ) 。随着物质的提 纯和设备的改进，已经能够向细胞内转移不同来源的大分子溶液，比如病毒 l n a ( g r a e s s m a n n r a e s s m a n n1 9 7 6 ；s t a c e ye ta 1 1 9 7 7 ) ，纯化的蛋白质和病毒d n a 。 人们采用同样的方法，利用微注射把d n a 转移到受精卵中。不久，人们把重组基因稳 定地引入到鼠生殖细胞系中。从此以后，微注射成为转基因动物研究的常规方法，广 泛地应用于活细胞的研究中，如基因表达、信号转导或细胞骨架研究等“。 我国著名生物学家童第周教授及其领导的研究组，在6 0 年代初就开始利用显微 注射技术，进行鱼类的细胞核移植研究。继而在7 0 年代初，童第周教授又与美籍牛 满江教授合作，应用同样的显微注射技术，将外源信使r n a ( m r n a ) 注射到新受体细胞 内，在国内首先开始了外源遗传物质的诱导及遗传性状变异等一系列的有关研究“。 当今世界的其它国家对微注射技术的研究方兴未艾。美国、日本、加拿大、瑞典 等国家都有不同类型的微注射机器人的出现，其中特别著名的有美国的s u t t e r 公司 和日本的尼康公司，但他们共同的特点是微注射时通过对气体压力的控制来实现对注 射量的控制的n “。 美国明尼苏达大学的s u ny u 和b r a d l e yj n e l s o n 提出了用于胚胎生殖核的半 自动注射系统，该系统利用视觉伺服技术搜寻、捕捉细胞，细胞捕捉器利用i j e m s ( 微 机电系统) 技术制造”3 。 日本已研制出用于细胞操作( 细胞切割、细胞转移、基因注射等) 的双指微操作机 器人样机，1 9 9 5 年日本a i s t 机器人机械技术研究所开发出双指微操作机械手，由压 电陶瓷驱动，可以实现微米级的精确定位0 1 。 3 南京理丁人学硕f 学位论义 数，化量刈拄细胞u 微渖甜仪实验研究 法国在包括用于对昆虫及各种卵细胞进行显微手术或操作的微操作机器人系统 研制方面现已取得阶段性成果，已初步研制出实验样机“。 韩国科技大学微系统研究中心研制了以压电陶瓷驱动的微央钳用于央持细胞。 相比较而言，国内研究起步较晚，进步较快自1 9 9 3 年起我国开始展丌对高精 度微操作技术的研究，1 9 9 7 年7 月，国家“8 6 3 ”计划分别资助北京航空航天大学、 南丌大学、中国科技大学等单位研制丌发用于细胞或基因微操作的微操作机器人系 统，研究各有侧重点，现已取得阶段性成果。 南开大学研制的“面向生物医学工程的微操作机器人系统”。”在细胞搜索定位方 面取得了一定进展：用图象识别技术引导显微镜工作台快速移动以使随机散在培养皿 中的细胞出现于显微镜视野中，从而提高了细胞定位自动化程度和定位速度。 国内其他单位，如中国科技大学研制的“全光学生物微操作系统”“3 、哈尔滨工 业大学机器人研究所研制出“仿生型多维超精密驱动机器人”、北京航空航天大学研 制的“具有视觉反馈的微操作系统”“、中国科学院长春光学精密机械研究所采用微 央钳技术和立体成像技术的微操作系统“等，都在细胞微注射仪主机方面作了探索。 南京理工大学章维一、侯丽雅教授领导的微系统研究室在国家“8 6 3 计划”( 4 项) 、圜家自然科学基金、江苏省高技术研究计划、国防军工技术基础计划、博士学 科点专项基金等项目的资助下，取得了下列主要成果：在国际上率先提出并在实践 上创建了微流体数字化技术“”“。：利用自己原创的微流体数字化技术研制了数字 化量可控微注射仪，其分辨率为飞升级、达国外商品最高水平，且在其自动化程度、 生产率等指标已较国外更高：研制了成套的微工具制造设备、包括微拉针仪、微磨 针仪、微锻针仪等。 对于章维一、侯丽雅教授的“微流体数字化技术”原创性和先进性，在江苏省科 技厅于2 0 0 4 年3 月2 3 同主持的“微流体系统数字化技术”鉴定会上作了充分肯定。 鉴定意见认为：“。微流体系统数字化技术的研究在基本概念和理论上有原创性，为 建立与信息数字化、能量传输及固体运动数字化有等同意义的物质传输数字化丌辟了 道路对微流体系统的研究和技术进步有重要意义；该项研究总体达到国际先进水 平。” 章维一、侯丽雅教授的“微流体数字化技术”在2 0 0 5 年2 月更被科技导报 ( 中国科学技术协会会刊) 遴选为“2 0 0 4 年中国科学、技术与工程重大进展”，同时 入选的重大技术进展还有袁隆平的超级杂交水稻技术、“中国资源二号”卫星和“长 征”运载火箭、1 0 万亿次高性能计算机等7 项。“微流体数字化技术”是江苏省唯一 入选的重大技术进展。 综合而言，与国外相比，国内微注射领域研究队伍比较薄弱，资盒投入不足，有 待于进一步的发展。 南京理工大学硕士学位论文数字化量可控细胞显微注射仪实验研究 1 3 数字化细胞显徽注射仪的研究意义 细胞工程中的显微作业形式很多，其操作尺度都是在微米或纳米级。由于细胞工 程技术的研究对象是具有“生命”的动植物的细胞，每一个实验环节的失败都会导致 生命的死亡，前功尽弃，造成人力、物力、时间的巨大浪费。就目前来说，实验动植 物的挣化技术，细胞的培养、洗涤、消毒技术，基因表达水平的检测技术等自动化程 度都已很高，所以显微操作技术和手段的提高是实验成败的关键。但因微注射和基因 切割等显微操作工具一直停留在手动或半自动状态。这无疑会大大限制实验成功率的 提高。从方法学角度考虑，也不太符台“系统工程”的原则。例如，利用人工微注射 法产生转基因家畜( 猪、羊、牛) 的成功率只有1 左右( 转基因小动物的成功率更低 。 一个熟练操作人员一天约可注射1 0 0 个受精卵，折合成活一个，而培养一个熟练的操 作人员要花3 5 年时间。目前，国内在进行植物线形染色体切割时，都是手动操作， 且必须在夜深入静、操作员状态极佳时进行。因此，改良显微操作技术和手段是基因 工程能否产业化的关键技术之一o ”。”。 利用微液压泵系统进行微量注射( 或吸取) 是操作员最为头痛的闯题。因为对注入 的外源基因量要求很严格，过多会使细胞致死，过少又达不到目的。而液体惯性的存 在又使得现有的旋转推进器不能精确地控制注入量的多少。如何解决这一矛盾是个很 棘手的问题”“1 。 目前在细胞药物定量注射方面主要有两类注射仪，第一类是手动旋纽式微注射仪 ( m a n u a lm i c r o i n j e c t o r ) ，具有结构简单、成本低、操作方便的特点。生产该类注 射仪有美国的s u t t e r 公司和日本的n i k o n 公司及德国的l e i c a 公司等。图1 3 1 为 美国s u t t e r 公司制造的手动旋纽式注射仪，靠手旋动微分头的旋钮实现注射量的调 节，这样的注射量级是无法满足细胞注射皮升级注射量精度，主要操作过程靠手动调 节和显微观察进行，操作精度由操作者的技能来保证。利用微注射法制备携带 e p s t e i n - b a r r 病毒膜抗原基因一一b f f l l 的转基因小鼠时，使用l e i c a 公司的 i m - 5 a b 型注射仪时将注射针轻轻扎入原核，转动注射针推进器旋钮施以正压直至原 核膨胀为止，迅速拔出注射针。注射量根据操作者的观察凭注射经验确定。无法实现 注射量的精确控制1 。 图1 3 1 手动旋纽式注射仪( 美国s u t t e r 公司) 另一类注射仪被称作可编程微注射仪( p r o g r a m m a b l em i c r o i n j e c t o r ) ，用于按 南京理工大学硕士学位论文数字化量可控细胞显微注射仪实验研究 照预先确定的时间和压力，可以自动地注射或从细胞、卵和细胞组分中抽取少量液体。 图1 3 2 美国w p i 公司制造的用于转基因实验的微注射仪，采用容积气泵，由相应的 密封舱提供正负压力，正压用于高压注射，负压用于吸住细胞或从尖端冲灌微管。注 射压、保持压和负压都通过控制钮独立调节，并在面板上显示。由于注射玻璃微针针 尖的内径尺寸在微米级，针尖处毛细阻力较大，因此注射压，保持压和负压要根据注 射玻璃微针针尖的内径尺寸确定。 图1 3 2 编程微注射仪( 美国肿i 公司) 对于微操作机器入系统的自动微注射装置来说，要求被注射液体( 包括外源基因、 蛋白质、染料、石蜡等) 的控制量要精确到纳升甚至皮升级。而且针对不同的操作对 象，毛细玻璃管或针管内的压力要求也随之变化。即使利用上述的编程微注射仪，如 何自动精密控制注射量及内部压力仍是生物科研工作者十分头痛的问题之一”3 。 细胞注射时微注射玻璃针的临界喷射压力决定了系统的内部压力，而微注射玻璃 针的制造要经过拉制和磨制两个工艺过程，针尖的直径较难控制，每根针尖的壹径的 差别会使临界喷射压力有所不同。注射不同的药物时，注射玻璃针是不允许重复使用 的，因此不同批次注射时都需要靠旋纽调整压力。另外容积式气泵压力控制的延迟性 及气体的压缩性实际上无法精确保证压力施加时间的控制精度，同时存在着结构复 杂、体积大、成本高、成功率低的缺点。由于目前尚无成熟的定量微注射方法，目前 国内大多用户虽仍然在使用前面所述的二类仪器，但对定量注射方法妁研究一直在进 行。 为提高注射效率及注射成功率，国内外许多科研机构和大学都开展了微注射技术 的研究，主要利用计算机图像采集和处理技术、微机电技术，在细胞观测、定位、寻 找、接近、瞄准方面开展自动化控制研究，但在注射仪技术研究方面进展不大。 广东工业大学研制了一种气压电控式超微量注射仪，整个系统内有压力传感器和 放大电路。可以通过对注射气压和注射时间的精确调定注射剂量，弥补了液压手控式 微注射仪在注射时不能精确定量的不足，消除了人为因素所造成的注射剂量不一致， 解决了因注射剂量不一致而导致胚胎注射后发育不同步的矛盾。但在试验过程中，微 注射针端部非常狭长，气体本身存在一定的压缩性，导致在试验结果与理论推导间存 在一定的出入1 。 k y o s e o kc h u n 和g e nh a s h i g u c h i 等人在开发d n a 注射系统时，采用在玻璃或硅 的基体上刻蚀出可吸持批量细胞的呈阵列状排列的微孔，矛4 用与之对应的注射针阵列 6 南京理t 人学侦卜学位论正数1 ，化量n j 挣钏胞“微渖剁仪实验研究 对细胞进行批注射，是一种基于概率注射的系统，在成功率和生产率上无法保证“1 。 1 4 数字化量可控细胞显微注射技术的提出 数字化细胞注射技术利用微机械电子技术进行注射仪的制造及装配，利用计算 机、通信等技术对细胞注射时的各种信息进行采集、整理、保存、加工及控制。可以 将微玻璃针的在穿刺时的运动特性和注射量的控制直接由分离手工控制和旋钮设置 转变为计算机系统通过对控制量特征的信息搜集、归纳，j 4 - 其进行参数化定义，利用 操作性和可视性俱佳的计算机数字进行数字式整体控制操作。操作者通过计算机对细 胞注射的诸多要素进行数字化控制操作。细胞定量注射过程实际上是对注射药液的控 制，属于微流体的精确驱动控制范畴。 目前，国内对于显微操作系统中的显微注射的研究丌展甚少，这方面的研究对于 生物工程中的细胞及基因工程的研究和发展犹为关键。 1 5 论文背景和主要工作 本论文数字化量可控细胞显微注射仪的实验研究是微流体数字化技术在细胞 显微注射技术上的应用研究，结合南京理工大学微系统研究室承担的国家自然科学基 余项目“微流体系统数字化驱动一控制技术的基础及应用”( 课题编号：n o 5 0 2 7 5 0 7 9 ) 、江苏省高技术研究计划项目“细胞工程用微操作机器人系统及配套微工 具制造设备研制”( 项目编g - b g 2 0 0 1 0 2 3 ) 等项目，进行了列数字化量可控细胞显微 注射仪的实验和研究。 如前所述，由于我国在细胞操作仪器系统方面的研究还不够，因此，目前细胞操 作仪器系统全部依赖进口，外商般将显微注劓仪及其附属设备微拉针仪、磨针仪、 锻针仪进行捆绑式销售。表1 5 1 为细胞工程仪器系统的组成及国外售价。 袁1 5 1 细胞i ：程仪器系统弁勺组成及国外僻价 国外同类产品售价 序号 名称备注 ( 万元人比币) 1 显微操作仪 1 3 液乐传动式 2显微注射仪 1 8 烈活塞式 3拉针仪 2 4 舣向拉制 t磨针仪 4 3 配备显微镜 5 锻针仪 6 7 烈电流精密调1 ， 从表1 5 1 中可以看出显微操作仪加上显微注射仪，价格就要高达1 5 力人民币， 尚未算上配套的其它设备，十分昂贵。而国内对于显微操作系统中的显微注射的研究 丌展甚少，特别是在对细胞注射量的精确控制方面，这方面的研究对于生物工程中的 细胞及基因工程的研究和发眨犹为关键。 本论文的主要工作如下： 7 南京理t 人学坝l ：学位论史 数，化量a j 拎细胞“微沣身4 仪实验研究 ( 1 ) 在微系统实验室的研究条件下搭建好显微注射实验系统。 ( 2 ) 对其中数字化量可控细胞显微注射仪进行结构和实验分析。本显微注射用 注射仪主要采用改变容积的原理，依靠压电陶瓷的微位移来改变容积，从而实现微流 量注射。 ( 3 ) 建立数学模型，进行注射量输出的计算。 ( 4 ) 设计出适合显微注射仪的注射量测量方案。在一定的参数条件下，对输出 微流量的体积进行精密测量。利用数学工具，通过对实验数掘的后期分析，来确定显 微注射仪的注射量与各影响参数变量间的数学关系。 南京型t 大学倾i j 学位论文敬。产化量口j 捧细胞豇微汁刺仪实验研究 2 数字化量可控细胞显微注射仪及注射试验 本论文在南京理工大学微系统研究室创造的微流体数字化技术实验坏境中进行， 涉及到的实验条件有： 数字化量可控细胞显微注射仪 细胞微注射驱动系统 显微注射用微针的制备 2 1 压电陶瓷的位移特性分析 压电效应是1 8 8 0 年由屠旱兄弟( j a c q u e sa n dp i e r r ec u r i e ) 在a 石英晶体上首 先发现的。它是反映压电晶体的弹性和介电性相互耦合作用的，当压电晶体在外力作 用下发生形变时，在它的某些相对应的面上产生异号电荷。这种没有电场作用，只是 由于形变产生的现象称为正压电效应。当压电晶体施加一电场时，不仅产生了极化， 同时还产生了形变，这种出电场产生形变的现象称为逆压电效应。逆压电效应的产生 是由于压电晶体受到电场作用时，在晶体内部产生了应力，这应力称为压电应力，通 过它的作用产生压电应变。 逆压电效应所产生的形变与外电场成f 比例关系，而且当电场反向时，形变也发 生变化( 如原来伸长可变为缩短，或者原来缩短可变为伸长) 。 压电材料可用于将电能转变成机械能，反之办然。对于纳米级的位置控制，由电 场作用于压电材料而产生的精确运动具有巨大的价值。利用这一效应的驱动器的使 用，使精确定位、精密机械领域产生了巨大变革”7 “。 本研究论文中涉及应用的都是堆栈式p z t 压电陶瓷驱动器。 2 1 1 单层空载压电驱动器的位移 p z t 陶瓷驱动器的位移是加载电场强度e 、所用压电材料以及p z t 陶瓷的长度l 的函数。材料特性可由压电应变系数( p i e z o e l e c t r i cs t r a i nc o e f f i c i e n t s ) d ，来 描述，这些系数描述了电场强度与发生的机械应变之肛j 的关系。 对于单层空载压电驱动器( 如图2 2 1 所示) ，在逆压电效应中，陶瓷位移与电场 强度之间的关系如式( 2 1 ) ： a l2 s o2 ( d 9 e + m e 2 ) 上o f 2 1 1 式中：l 陶瓷位移 s 应变 相对长度变化l l ，无量纲系数 l 。，一陶瓷长度 m e 一电场强度 v m 口l 厂一压电系数 m v m 一电致伸缩系数 9 南京理t 人学坝i 。学位论义 数。j 7 化量口j 挖细胞娃微滓射仪实验 l | = 究 压电陶瓷在电场的作用下产生形变，在弹性限度内，该形变与外加电场成线性关 系，在较低的电场下具有较高的灵敏度，电场极性改变，形变性质发生改变( 伸长或 缩短) 。在公式( 2 1 ) 中，d 较m 大几个数量级，可一般认为： 2 e 矗”l 。 ( 2 2 ) 幽2 1 1p z t 压电陶瓷片在施加电压对的伸长和收缩 压电应变系数中吐，描述平行于压电陶瓷极化矢量的应变，西，则描述与极化矢量 f 交方向上的应变。凶；应用于堆栈式p z t 压电陶瓷驱动器，而画则用于管状和带状 驱动器。 在有反向电场的情况下，收缩( 负伸长) 的存在使名义位移增加2 0 ”7 ”3 。 2 1 2 堆栈式p z t 压电陶瓷驱动器及其位移 p z t 陶瓷可以承受的最大电场强度约为l 2 k v m m 。为了使工作电压保持在实际 的极限值内，p z t 驱动器通常由许多薄片形的电活化材料平行地并联接在一起，各层 厚度可由0 0 2 1 m m ( 如图2 1 2 所示) 。出于压电原件的活性部分是堆由薄金属电 极分开的压电陶瓷片构成，因此最大工作电压与陶瓷片的厚度成厄比总位移是各层 位移的总和”。 例2 1 2 堆栈式p z t 压l b 陶瓷 堆栈式元件可以承受很高的压力，是所有结构形式中刚度最高的。出于p z t 陶瓷 o 南京垲丁人学坝f 、学位论文 数7 ，化量a j 拄细胜“微往射仪实骀研究 不能受大的拉力，所以常设计成具有弹簧预载的形式。堆栈式p z t 压电陶瓷用于静态 或动态工作。 堆栈式p z t 压电陶瓷的位移可由以下公式计算： 址2 d 3 3 月u ( 2 3 ) 凶厂压电系数 m v 3 圩一压电陶瓷的层数 u 一工作电压 2 2 数字化细胞显微注射仪 2 2 1 显微注射仪的结构组成及基本原理 本文所使用的是利用堆栈式压电陶瓷的微位移特性和产生较大推力的特性，通过 改变充装药液容器的微小容积来进行微量注射的方法。注射量可以通过施加在压电陶 瓷上的驱动电压柬控制。由于压电陶瓷电压与位移有较好的线性关系及复位性能，保 证了微量注射时药液量的控制具有较好的可靠性和稳定性，可望实现细胞注射的定量 控制。 图2 2 1 为本实验室所研制的数字化细胞显微注射仪主要结构简图”1 。注射仪主 要由两个堆栈式压电陶瓷微位移器 、b 与弹性薄膜9 及腔体l l 构成。整个注射仪由 连接在压电陶瓷微位移器a 上的连接杆l 安装在倒置显微镜的左边操作微动装置上。 l 连接杆2 陶瓷微位移器a3 过渡块4 调整螺挣5 陶瓷微位移器b6 筒体7 螺帽8 淬 火钢球9 弹性薄膜1 0 密封罔u 腔体1 2 旋帽1 3 电磁换向阀1 4 密判固1 5 压帽1 6 玻璃微针 1 7 紧定螺钥 幽2 2 1 数字化显微注射仪结构简幽 工作原理：控制施加在陶瓷微位移器a 上的基础电平、跳变电压和驱动波形可满 足不同要求的细胞膜穿刺及退针的运动特性要求，包括穿刺速度、时问、刺入位移、 加速度及退针的运动等诸多参数的变化。控制施加在陶瓷微位移器b 上的基础电平、 跳变电压和驱动波形n - j - 以控制陶瓷微位移器b 的微量位移的大小和位移的速度。淬火 钢珠在陶瓷微位移器b 位移的作用下，由中心点压迫圆形薄膜9 ，薄膜9 的变形对 i l 南京理t 人学坝l 岸位论文数j 7 化釜口j 挣纠胞址微溶剁仪实验研究 应于陶瓷微位移器b 的微量位移。薄膜9 的变形引起腔体体积的微小变化，使得注射 试剂由与腔体相通的注射针尖喷出，因此控制压电陶瓷微位移器b 的微量位移可以控 制细胞注射的剂量和注射速度。控制压电陶瓷微位移器a 的微量位移可以控制细胞穿 刺细胞膜的位移和速度特性。两个压电陶瓷微位移器由一个双路驱动电源控制，参数 控制通过驱动程序在计算机上实现，可实现细胞膜穿刺和注射量的数字化控制。 2 2 2 显微注射仪所采用的压电陶瓷驱动器 压电陶瓷微位移器a 压电陶瓷微位移器a 负责细胞注射时注射针对细胞的穿刺的运动。为了能够有效 刺破不同弹性和硬度的细胞膜，有时需要在微位移器上施加不同类型的驱动波形使微 针获得一定的加速度，电致伸缩陶瓷的特性很好地满足了这一要求。选用电子工业部 重庆二十六所制造的w t d s 型电致伸缩陶瓷位移器，如图2 2 3 型号为w t d s i f 。 驱动电源接钱 封装金属板 ( 两端) 封装复台材料 幽2 2 3w t d s 系列堆栈式p z t 压i 岜陶瓷( 重庆一十人所) 这是堆栈式p z t 压电陶瓷最简单的封装形式，红线接“+ ”极黑线接“一”极。 w t d s i f 型叠层数很多，最大位移耋1 0 0 um ，是w t d s 型电致伸缩陶瓷中可产生最大 位移的一种，同时具有工作电压低，分辨率高，响应快，滞后小，回零再现性好，无 老化现象。驱动电压o 一3 0 0 v ，最大荷重5 0 k g ，回零位移再现性小于0 0 5um 。其缺 点是无封装保护，安装时只能使用不可拆的高强度胶粘按方式与其他构件联结，只具 备一次使用性，粘接强度受环境温度、载荷等影响较大。 陶瓷微位移器b 陶瓷微位移器b 用于控制弹性薄膜9 的变形，要求有较高的灵敏度，因此采用德 国的p i 公司的p - 8 4 4 1 0 型压电陶瓷。p i 公司专业生产p z t 压电陶瓷器件，有较长 的历史。我们可以登陆到公司的网站( h t t p ：w w w 1 3 i w s ) 上去了解和选择需要的产 品。p - 8 4 4 1 0 压电驱动器的外形如图2 2 2 所示。p - 8 4 4 1 0 是丌环( o p e n 一1 0 0 p ) 系 统。表2 2 2 为主要参数，产品主要具备以下技术特征： ( 1 ) 内置弹簧预载可抵消动态工作时产生的拉应力，可用于动态操作系统： ( 2 ) 不锈钢外壳，避免内部p z t 压电陶瓷受弯曲或扭矩的破坏； 南京理工大学硕士学位论文 数字化量可控细胞显微注射仪实验研究 ( 3 ) 两端各有m 8 螺栓( 孔) “接口”结构，便于联接使用； ( 4 ) 产品系列化、标准化； ( 5 ) 可以得到具有内置传感器的闭环( c o s e d l o o p ) 系统压电元件。 图2 2 2p i 公司( 德国) p 一8 4 4 系列驱动器外形图和安装尺寸图 表2 2 1p i 一8 4 4 1 0 技术参数( 从h t t p ：m p i w s 下载) 1 1 转c h n i c a ld a t 耩 舅孥哺警罐。 models粤磐啊j u n r s j ”j o p a l ) - i 0 0 p t f a v 。i oo t o1 0 0 v垮，i l - n 啦竹 c 1 啪酗d t f a v e j 主 一 7 j 帅 oi m e a f a 帕d f o e d b a c k 轴n s o r n一、j c 1 0 l “1 0 0 f ，口啪4 0 0 p + or i b l o i u t o ；t 瓴j 5 ，m 9 t a t t cl j r 口o _ 鑫l 口n 珊s t i 怖b 躯。 。2 聋57 n p r o 2 0 p u s h f p i l hf o r c 日c 目p a 哪i 善0 0 0 7 0 0 h t o f c i u gl i m i t ( a tt i 翻、t 一? n m e l e c t r | c a | c 神琏a 咐 4 7 z 童一4tp f 蝴； 窑婴塑堡2 塑鲤塑堡曼! 璧苎塑竺墅坚竖堡。黧；纛：鲤憋兰坚型 竺! ! 竺! ! ! 竺! 竺坐塑竺竺竖墅，j 撰o ：站翌塞! 型 墅鲤! 型! 塑罂塑! 竺篓鲤竺! ! ! ! ! ：二塑受篓篓一 蝗苎塑璧! 嗍鼎婴 然：二墨；一 铂r 并口r c m 试l q n i ： t 。? ，。要，+ w o i 口m 幽o m c 曲i 神“琅镲g 5 塑! 竺! 墼! ! 竺! 塑! 型! 苎!二；! 鬯签： 缝盟些! 一 二壁：釜盐塑翌 辩钟叫i m n 幽d i t tp i j 怕。惭脚口瀚r 。i 每璺避：”1 。 变唑塑竺雯燮璺曼二曼塑l 。 ： ! ：亟兰立羔。一 2 2 3 驱动控制系统 驱动控制系统包括可编程任意波形压电陶瓷功率驱动电源和驱动控制软件两部 份。由微系统研究室其他老师和同学负责设计开发。 在w i n d o w s 2 0 0 0 系统下，通过程控任意波形驱动控制软件，我们不仅可以调整压 电陶瓷的驱动电压和频率，还可以通过选择步行方式来选择是采用连续驱动还是单步 驱动模式。在单步驱动模式下，我们可以设置“步数”即驱动脉冲波形的个数。见下 图2 2 5 ： 1 3 南京垲t 人学坝卜学位论文数7 化量口j 拧纠胞 u 2 微注射仪实验研究 型2 2 5 波形参数驶蓝 在程控任意波形驱动控制软件中，我们可以写入符合设计要求的压电陶瓷驱动波 形，通过专用的驱动放大电路柬实现对压电陶瓷的驱动控制。 2 2 4 注射仪关键零部件的制造与装配 弹性薄膜的材料为6 0 s i 2 m n ，属合金弹簧钢，合金弹簧钢是含碳量0 5 一o 。7 的高碳合金钢，具有较高的弹性极限、疲劳强度和足够的韧性。轧制成厚度为0 1 m m 厚的薄膜，经淬火及中温回火处理，性能与普通钢板q 2 3 5 的性能对比见表2 2 2 。： 表22 2 力学性能对比表 f 牌号 力学性能 0 ，( m p a ) 0 、m p a )6 ( )h r ch b s 1q 2 3 5 3 7 5 5 0 01 8 5 2 3 52 1 - 3 61 8 0 2 2 0 f6 5 s i 2 m n 1 3 0 01 2 0 054 0 5 0 g c r l 5 1 5 0 01 4 0 04 55 0 6 0 h r c 表示洛氏硬度，h b s 表示布氏硬度，一般情况下：1 h r c i o h b s 。0 。表示强 度极限，。表示屈服极限，6 为塑性指标伸长率。从表中可知6 0 s i 2 m n 具有与制造 钢珠的g c r l 5 接近的强度和硬度，由于含有较多的m n ，表现出较高的弹性极限。弹 性薄膜与钢珠的作用力不会在各自表面产生不可恢复的塑性压痕，保证了微变形的精 度。弹性薄膜变形时不会产生断裂，在去除力后可快速恢复。6 0 s i 2 m n 的弹性模量大 约在1 8 6 2 1 6g p a ”3 。腔体、筒体由不锈钢材料制造。 在2 2 1 节的注射仪结构中，对注射量起作用的是弹性薄膜的半径、弹性薄膜的 厚度、微珠的半径尺寸三个参数，其他零件是共用的。在制造时所有尺寸系列化的零 件在相同的加工条件下采用相同的加工工艺一次性加工完成。用较高的精度等级和形 4 南京理工大学硕士学位论文数字化量可控细胞显微注射仪