（外科学专业论文）mek1和mek2差异调节胰腺癌细胞功能的实验研究.pdf

一、摘 由 英 二、英 三、论 刖 实验材料与方法1 2 实验结果( 附论文图片) 2 l 讨论2 5 结论2 6 四、本研究创新性自我评价2 7 五、参考文献2 8 六、附录 综j 苤3 0 在学期间科研成绩4 1 致谢4 3 个人简历4 4 中文论著摘要 m e k l 和m e k 2 差异调节胰腺癌细胞功能的实验研究 鄹昌 胰腺癌常伴随广泛的侵袭和或转移，以至于无法进行根治性外科手术治疗。 开发以侵袭转移相关因子为靶点的新型分子靶向治疗方法为改善胰腺癌患者预后 提供了新的治疗手段。但目前胰腺癌侵袭转移的细胞及分子机制尚未完全阐明。 在前期研究中，利用b o p 诱导的叙利亚仓鼠实验性胰腺癌模型，建立了非解 离型低转移株胰腺癌细胞系( p c 1 ) ，再将p c 1 细胞经皮下种植后，取转移癌建 立了解离型高转移株胰腺癌细胞系( p c 1 0 ) ，而这两种同源细胞具有明显不同的 侵袭和转移能力。前期研究中我们利用m r n a 差异表达法( r e p r e s e n t a t i o n a l d i f f e r e n c ea n a l y s i s 。r d a ) 发现p c 一1 0 和p c 1m r n a 表达存在明显差异，其中 m e k 2 是与p c 1 0 和p c 1 细胞侵袭转移密切相关的因子之一。进一步研究中证 实m e k 2 参与调控胰腺癌细胞的侵袭转移过程。 m e k 2 作为丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，m a p k ) 信 号转导通路中的重要激酶分子，参与调控多种细胞生理学功能，包括细胞增殖、 分化，细胞分裂，应激和凋亡。而m a p k 信号转导通路几乎存在于所有真核生物 细胞中，为三级激酶体系：m a p k ，丝裂原活化蛋白激酶激酶( m a p 虹n a s eb n a s e ， m k k 或m e k ) 和丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶( m a p 虹n a s ek i n a s ek i n a s e ， m a p k k k ) 。m e k l 和m e k 2 是m e k 家族的两个成员，通常表示为m e k l 2 。二 者拥有8 5 相同的基因序列，通常被认为具有类似的生物学功能，但也有文献报 道二者可能通过不同途径调控细胞的生理功能。此外，在胰腺癌细胞侵袭转移中 m e k l 和m e 勉的作用机制尚未明确。 目的 通过r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 技术诱导p c 1 0 细胞中m e k l 和 m e k 2 基因表达沉默，并建立相应稳定转染的p c 1 0 亚细胞克隆，以进一步明确 m e k l 和m e k 2 在胰腺癌细胞中对生物学功能差异调节及其分子机制。 材料与方法 一、材料 利用仓鼠解离型高转移株胰腺癌细胞( p c 1 0 ) ，以r p m i 1 6 4 0 培养液培养， 并加1 0 胎牛血清、1 0 0u m l 青霉素g 和1 0 0p g m l 链霉素，于含5 c 0 23 7 。c 孵箱内培养。上述细胞在进行免疫细胞学实验前无血清培养。 利用r n a i 设计软件( c l o n t e c hl a b o r a t o r i e s ，i n c ，c a ，u s a ) 针对m e k l 和 m e k 2 基因序列设计s h r n a 序列。利用r n a i r e a d yp s i r e n - r e t r o q - z s g r e e n 质 粒构建m e k l 和m e k 2s h r n a 。利用g p 2 2 9 3 包装细胞感染p c 1 0 细胞，建立 m e k l 和m e k 2s h r n a 稳定转染的亚细胞克隆。利用荧光显微镜对细胞进行筛选。 利用兔抗人m e k l 、m e k 2 及1 3 - a c t i n 多克隆抗体( s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y , s a n t ac r u z ，c a ) 作为一抗。利用辣根过氧化物酶结合的抗体和f i t c 标记的荧光 抗体( s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y , s a n t ac r u z ，c a ) 作为第二抗体。 二、方法 利用基因敲减( k n o c kd o w n ) 技术分别抑制m e k l 和m e k 2m r n a 表达。应 用r t - p c r 、w e s t e r nb l o t 对m e k l 及m e k 2 基因敲减的p c 1 0 胰腺癌亚细胞克隆 进行筛选。对筛选出的m e k l 及m e k 2m r n a 表达抑制最明显的p c 1 0 胰腺癌 亚细胞克隆进行体外细胞增殖、细胞周期、体外侵袭及细胞形态学研究。 实验结果 一、表达m e k ls h i 州a 或m e l qs h r n a 的质粒及稳定转染 m e k ls h r n a 或m e l 心s h r n a 的胰腺癌亚细胞克隆的建立 为了抑制内源性m e k l 或m e k 2 的表达，我们利用r n a i 设计软件分别通过 设计了三种m e k l 及m e k 2s h r n a 序列。通过r n a i r e a d y p s i r e n r e t r o q - z s g r e e n 质粒建立稳定转染m e k ls h r n a 或m e k 2 是r n a d e 胰 腺癌亚细胞克隆，发现所选择的s h r n a 均分别降低内源性m e k l 或m e k 2m r n a 表达，其中抑制最明显的分别是转染m e k ls h r n a3 的亚细胞克隆( 9 8 4 ) 和 转染m e k 2s h r n a 3 的亚细胞克隆( 7 7 5 ) 。在蛋白水平上，转染m e k ls h r n a 2 3 和转染m e k 2s h r n a 3 的p c 1 0 亚细胞克隆中m e k l 和m e k 2 的蛋白表达较对 照组明显降低。对上述m e k l 和m e k 2 基因敲减的p c 1 0 亚细胞克隆进行原代 培养，建立相应的p c 1 0 亚克隆细胞系以进行下一步实验。 二、m e k l 和m e l q 基因敲减的p c 1 0 细胞的形态学和生长方 式变化 m e k 2 基因敲减的p c 1 0 细胞以细胞克隆方式生长。而m e k l 基因敲减的细 胞在细胞生长方式方面较对照组p c 1 0 细胞无明显变化。 三、m e k l 和m e l q 基因敲减的p c 1 0 细胞的增殖变化 m e k l 基因表达下调抑制p c 1 0 细胞的增殖。在培养4 8 小时和7 2 小时后， p c 1 0 细胞增殖活性显著减低，与对照组细胞相比抑制率分别为6 2 0 ( 氏0 0 5 ) 和6 0 5 ( 火0 0 5 ) 。而m e k 2 基因表达下调的p c 1 0 细胞与对照组细胞相比无 统计学差异( 尸 0 0 5 ) 。 四、m e k l 和m e l ( 2 基因敲减的p c 1 0 细胞的细胞周期变化 应用流式细胞仪( f a c s c a n ，b d ，u s a ) 对m e k l 和m e k 2 基因敲减的p c 1 0 细胞进行细胞周期分析。在m e k l 基因敲减细胞中，我们发现只有8 i o o - - t ：0 7 的 细胞处于有丝分裂的s 期。而对照组p c 1 o 细胞中有2 6 6 4 - 5 4 的细胞处于s 期( 尸 0 0 5 ) 。 五、m e k l 和m e l ( 2 基因敲减的p c 1 0 细胞的体外侵袭能力变 化 对照组细胞表现为较强的体外侵袭能力( 侵袭细胞数= 5 2 6 5 8 ) 。而与对照组 相比，m e k 2 基因敲减显著抑制了p c 1 0 细胞的侵袭能力( 侵袭细胞数= 2 0 1 3 1 ， 尸 o 0 5 ) 。 结论宝日j p 匕 1 、在胰腺癌细胞中m e k l 和m e k 2 调节不同的生物学功能。m e k l 调控胰腺 癌细胞的细胞周期变化，而m e k 2 调控胰腺癌细胞的体外侵袭能力和形态学变化。 2 、m e k l 和m e k 2 可作为胰腺癌分子靶向治疗的新靶标。 3 关键词 胰腺癌；m e k l ；m e k 2 ；基因干扰；功能调节 4 英文论著摘要 m e k la n dm e l qi s o f o r m $ r i np a n c r e a t i cc i n t r o du c t i o n b yt h et i m ei t i sd i a g n o s e d ，p a n c r e a t i cc a n c e rh a so f t e nu n d e r g o n ee x t e n s i v el o c a l i n v a s i o na n d o rm e t a s t a s i s ，p r e c l u d i n gat h e r a p e u t i cs u r g i c a ls o l u t i o n d e v e l o p m e n to f n e wm o l e c u l a rt h e r a p e u t i cm e t h o d st a r g e t i n gt h ei n v a s i o n m e t a s t a s i s - r e l a t e df a c t o r si sa p r o m i s i n ga v e n u ef o ri m p r o v i n gt h ep r o g n o s i so fp a t i e n t s w i t hp a n c r e a t i cc a n c e r h o w e v e r , t h ec e l l u l a ra n dm o l e c u l a rm e c h a n i s m so fi n v a s i o n m e t a s t a s i so fp a n c r e a t i c c a n c e rh a v en o tb e e nf u l l ye l u c i d a t e d t w oh a m s t e rp a n c r e a t i cc a n c e rc e l ll i n e sw i t hd i f f e r e n tp o t e n t i a l sf o ri n v a s i o na n d m e t a s t a s i sa f t e ri n t r a - p a n c r e a t i ct r a n s p l a n t a t i o n ，p c 一1 ( 1 0 wp o t e n t i a l ) a n dp c 一1 0 ( h i g h p o t e n t i a l ) ，w e r e e s t a b l i s h e df r o map a n c r e a t i cd u c t a l c a r c i n o m ai n d u c e d b y n n i t r o s o b i s ( 2 - o x o p r o p y l ) a m i n e ( b o p ) i nas y r i a ng o l d e nh a m s t e r i no u rp r e v i o u s s t u d v g e n ee x p r e s s i o nd i f f e r e n c e sb e t w e e np c - 1 0a n d p c - 1c e l l sw e r ee x a m i n e du s i n g t h e r e p r e s e n t a t i o n a l d i f f e r e n c e a n a l y s i s ( r d a ) m e t h o d w ei d e n t i f i e d m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s e2 ( m e k 2 ) a s af a c t o rt h a tw a sc o r r e l a t e dw i t h t h ei n v a s i o na n dm e t a s t a s i sp o t e n t i a lo ft h e s ec e l ll i n e s f u r t h e ri n v e s t i g a t i o nc o n f i r m e d t h a tm e k 2w a si n v o l v e di ni n v a s i o n m e t a s t a s i so f b o t hh a m s t e ra n dh u m a np a n c r e a t i c c a n c e l c e l l s m e k 2i sak e yk i n a s ei nt h em i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ( m a p k ) s i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a y , w h i c hi si n v o l v e di nm a n yc e l l u l a rp r o c e s s e s ，i n c l u d i n gc e l l p r o l i f e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o n ，c e l ld i v i s i o n ，s t r e s s ，a n da p o p t o s i s t h em a p k p a t h w a y s a r ee v o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e di na l le u k a r y o t e sa n dc a nb eo r g a n i z e di n t oa t h r e e - k i n a s e h i e r a r c h y ：am a p k ，am a p ka c t i v a t o r ( m a pk i n a s ek i n a s e ，m k ko rm e k ) ，a n da m a pk i n a s ek i n a s ea c t i v a t o r ( m a pk i n a s ek i n a s ek i n a s e ，m a p k k k ) ( 1o ) m e k la n d m e k 2a r et h eo n l yt w oi s o f o r m so ft h em e kf a m i l ya n da r ec o m m o n l yr e f f e r e dt oa s m e k l 2 t h e i ra m i n oa c i ds e q u e n c e sa r e 8 5 i d e n t i c a la n dt h e y a r ee x p r e s s e d 5 u b i q u i t o u s l yi n c e l ll i n e sa n dt i s s u e s a l t h o u g hi t i sc o m m o n l ya s s u m e dt h a tt h et w o i s o f o r m sa r ef u n c t i o n a l l ye q u i v a l e n t ，s e v e r a ll i n e so fe v i d e n c e ，h o w e v e r ，i n d i c a t et h a t t h e ya l er e g u l a t e dd i f f e r e n t i a l l ya n dm a ye x e r tn o n - r e d u n d a n tf u n c t i o n sf1 1 13 ) t h u s 钉t h ei n d i v i d u a lr o l e so fm e k la n dm e k 2i np a n c r e a t i cc a n c e rc e l l sr e m a i nt ob e e x p l o r e d o b j e c t i v e i nt h i ss t u d y ，s h o r t - h a i r p i nr n a s ( s h r n a s ) e x p r e s s e di nar e t r o v i r a lv e c t o rw e r e u s e dt os p e c i f i c a l l ys i l e n c et h ee x p r e s s i o n so fm e k 1a n dm e k 2i nt h el l i g h l yi n v a s i v e a n dm e t a s t a t i cp a n c r e a t i cc a n c e rc e l ll i n ep c 一1 0t oe s t a b l i s ht h es t a b l es u b c l o n e so f t h e p c 1 0c e l l sa n dt od e m o n s t r a t et h ed i s t i n c tf u n c t i o n sr e g u l a t i o no fm e k la n dm e k 2 i np a n c r e a t i cc a n c e rc e l l s m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 m a t e r i a l s w eu s e dt w oh a m s t e rp a n c r e a t i cc a n c e rc e l ll i n e s ：t h ew e a k l yi n v a s i v ea n dr a r e l y m e t a s t a t i cc e l ll i n e ，p c - 1 ，a n dt h eh i g h l yi n v a s i v ea n dm e t a s t a t i cc e l ll i n e ，p c - 1 0 t h e p c 1c e l ll i n ew a se s t a b l i s h e df r o mp a n c r e a t i cd u c t a l d u c t u l a ra d e n o c a r c i n o m a s i n d u c e db yb o pi nas y n a ng o l d e nh a m s t e r w eu s e dr n a i ( c l o n t e c hl a b o r a t o r i e s ，i n c ，c a ，u s a ) t o o lt od e s i g nt h es h r n a s e q u e n c e sa c c o r d i n gt ot h es e q u e n c e so ft h em e k la n dm e k 2 w eu s e dr n a i r e a d y p s i r e n r e t r o q z s g r e e np l a s m i dt o e s t a b l i s ht h em e k la n dm e k 2s h r n a t o e s t a b l i s ht h es t a b l es u b c l o n e so ft h ep c - 1 0c e l l se x p r e s s e dt h em e k lo rm e k 2 s h r n a ，w eu s e d g p 2 2 9 3p a c k a g i n gc e l lt oi n f e c tt h e m w eu s e df l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p et oo p t i m i z et h ec e l l s t h e s ec e l ll i n e sw e r ei n c u b a t e di nr p m i - 16 4 0 ( g i b c o - b r l ，g r a n di s l a n d ，n y ) ， s u p p l e m e n t e dw i t h 10 f o e t a l b o v i n es e r u m ( b i o s e r u m ，v i c t o r i a ，a u s t r a l i a ) ，10 0 u n i t s m lp e n i c i l l i nga n d1 0 0 g m ls t r e p t o m y c i na t3 7 。ci na h u m i d i f i e da t m o s p h e r e o f5 c 0 2a n d9 5 a i r t h ec e l l sw e r es e r u ms t a r v e do v e r n i g h tb e f o r ee x p e r i m e n t s 2 m e t h o d s w eu t i l i s e ds h r n a m e d i a t e dk n o c k d o w no ft h e i rt w om r n a si n d i v i d u a l l y w e u s e dp t - p c r ，w e s t e r nb l o tt oo p t i m i z et h er i g h tc e l l sw i t h i ns e v e r a lo n e s w es t u d i e d t h ee f f e c t so fm e k 1a n dm e k 2k n o c k d o w no np r o l i f e r a t i o n ，m i t o t i ca r r e s t ，i nv i t r o 6 i n v a s i o nc a p a b i l i t ya n dc e l lm o r p h o l o g yi np c - 1 0c e l l s r e s u l t s 1 c o n s t r u c t i o no fm e k l s h r n aa n dm e k 二s h r n ap l a s m i d s t ob l o c ke n d o g e n o u sm e k lo rm e k 2 ，w et e s t e dt h r e es h r n a s e q u e n c e sa g a i n s t e a c hg e n ei nt h er n a i r e a d yp s i r e n - - r e t r o q - z s g r e e nv e c t o r w ef o u n dt h a ta l lt h r e e s h r n a st a r g e t i n ge i t h e rg e n el o w e r e de n d o g e n o u sm e k lo rm e k 2m r n al e v e l s ， r e s p e c t i v e l y , w i t hm a x i m u mr e d u c t i o n so f9 8 4 ( m e k l - s h r n a3 、a n d7 7 5 ( m e k 2 一s h r n a3 1 t h em e k 1 一s h r n a3a n dm e k 2 一s h r n a3v e c t o r sa l s or e d u c e d m e k la n dm e k 2 p r o t e i nl e v e l sr e s p e c t i v e l y , c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lv e c t o r s t h u s ， t h e s et w ov e c t o r st h a ta c l l i e v e dt h eg r e a t e s td e g r e eo fk n o c k d o w nw e r es e l e c t e df o rt h e f o l l o w i n ge x p e r i m e n t s 2 c e l l u l a rm o r p h o l o g ya n dg r o w t hp a t t e r n si nm e k a n d m e l q k n o c k d o w np g l 0c e l l s w ef o u n dt h a tt h em e k 2 - k n o c k d o w np c 一1 0c e l l sg r e wi na na g g r e g a t e do r c l u m p e dp a t t e mi nc u l t u r e h o w e v e r , m e k1 一k n o c k d o w nc e i l ss h o w e dn oc h a n g ei n g r o w t hp a t t e r nc o m p a r e d 、析t ht h a to fe m p t yv e c t o r - i n f e c t e dp c 一1c e l l s 3 e f f e c t so fm e k la n dm e l ( 2k n o c k d o w no np r o l i f e r a t i o no f p c 1 0c e l l s w ef o u n dt h a td o w n r e g u l a t i o no fm e k li n h i b i t e dp r o l i f e r a t i o na n dg r o w t ho f p c - 1 0c e l l s i np a r t i c u l a r ，4 8ha n d7 2ha f t e ri n c u b a t i o n ，p c 一1 0c e l l ss h o w e d m a r k e d l yd e c r e a s e dp r o l i f e r a t i v ea c t i v i t y ，w i t hi n h i b i t i o nr a t e so f6 2 o a n d6 0 5 ， r e s p e c t i v e l y ，c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lc e l l s 俨 o 0 5 ) 4 e f f e c t so fm e k la n dm e l qk n o c k d o w no nc e l l c y c l ep h a s ei n p c 1 0c e l l s t h ec e l l c y c l ed i s t r i b u t i o n so fm e k l 一k n o c k d o w na n dm e i q k n o c k d o w np c - 1 0 c e l l sw e r ea n a l y s e du s i n gaf a c s c a nf l o wc y t o m e t e r i nm e k l 一k n o c k d o w nc e l l s ，w e f o u n do n l y8 1 士0 7 o fc e l l si nt h esp h a s eo fm i t o s i s i nc o n t r a s t 2 6 6 士5 4 o f c o n t r o lp c 一1 0c e l l sw e r ei nsp h a s ep 0 0 5 ) 5 e f f e c t so fm e k la n dm e k 2k n o c k d o w no ni nv i t r oi n v a s i o n i np c 1 0c e l l s t h ec o n t r o lc e l l se x h i b i t e d as t r o n gi n v a s i v ec a p a b i l i t y ( i n v a s i v e c e l l n u m b e r = 5 2 6 + 5 8 1 o nt h ec o n t r a r y , m e k 2k n o c k d o w nm a r k e d l y i n h i b i t e dt h e i n v a s i v ec a p a b i l i t yo fp c 1 0c e l l sc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lc e l l s ( i n v a s i v ec e l l n u m b e r = 2 0 1 + 3 1 ，p o 0 5 ) c o n c l u s i o n s 1 m e k1a n dm e k 2m e d i a t ed i f f e r e n tb i o l o g i c a lf u n c t i o n si np a n c r e a t i cc a n c e r c e l l s m e k1w a sa ne f f e c t i v ea n ds p e c i f i cm e t h o do fi n h i b i t i n gc e l lp r o l i f e r a t i o na n d i n d u c i n gg o g la r r e s t m o r e o v e r , t a r g e t i n gm e k 2m r n as p e c i f i c a l l yd i s r u p t e d c e l l m o r p h o l o g ya n dr e d u c e dt h ei n v a s i v ea b i l i t yo fc u l t u r e dp a n c r e a t i cc a n c e r c e l l s 2 m e k la n dm e k 2h a v et h ep o t e n t i a lt o s e r v ea st h e r a p e u t i ca g e n t si nt h e t r e a t m e n to fp a n c r e a t i cc a n c e r k e vw o r d s p a n c r e a t i cc a n c e r , m e k1 ，m e k 2 ，r n a i ，f u n c t i o nr e g u l a t i o n 8 英文缩略语 9 k b r p m m a n t k i l o b a s e r o u n d sp e rm i n u t e k i l o d a l t o n n u c l e o t i d e b p b a s ep a i r s 1 0 千碱基对 每分钟转数 千道尔顿 核苷酸 碱基对 论文 m e k l 和m e k 2 差异调节胰腺癌细胞功能的实验研究 翮舌 胰腺癌常伴随广泛的侵袭和或转移，以至于无法进行根治性外科手术治疗。 开发以侵袭转移相关因子为靶点的新型分子靶向治疗方法为改善胰腺癌患者预后 提供了新的治疗手段。但目前胰腺癌侵袭转移的细胞及分子机制尚未完全阐明。 在前期研究中，利用b o p 诱导的叙利亚仓鼠实验性胰腺癌模型，建立了非解 离型低转移株胰腺癌细胞系( p c 1 ) ，再将p c 1 细胞经皮下种植后，取转移癌建 立了解离型高转移株胰腺癌细胞系( p c 1 o ) ，而这两种同源细胞具有明显不同的 侵袭和转移能力。前期研究中我们利用m r n a 差异表达法( r e p r e s e n t a t i o n a l d i f f e r e n c ea n a l y s i s r d a ) 发现p c 1 0 和p c 1m r n a 表达存在明显差异，其中 m e k 2 是与p c 1 0 和p c 1 细胞侵袭转移密切相关的因子之一【4 1 。进一步研究证实 m e k 2 参与调控胰腺癌细胞的侵袭转移过程 5 1 。 m e k 2 作为丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，m a p k ) 信 号转导通路中的重要激酶分子，参与了多数细胞生化功能，包括细胞增殖、分化， 细胞分裂，应激和细胞凋亡【6 剐。而m a p k 信号转导通路几乎存在于所有真核生 物细胞中，为三级激酶体系：m a p k ，丝裂原活化蛋白激酶激酶( m a pl 【i i 瑚ek i n a s e ， m k k 或m e k ) 和丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶( m a p 虹n a s ek i n a s ek i n a s e ， m a p i o ) 【1 0 】。m e k i 和m e k 2 是m e k 家族的两个成员，通常表示为m e k i 2 。 二者拥有8 5 相同的基因序列，通常被认为具有类似的生物学功能，但也有文献 报道二者可能通过不同途径调控细胞的生理功能【1 1 1 3 】。此外，在胰腺癌细胞侵袭 转移中m e k l 和m e k 2 的作用机制尚未明确。 本实验中，为进一步阐明m e k l 和m e k 2 差异调节胰腺癌细胞功能的调控机 制，我们利用短发夹r n a ( s h o r t h a i r p i nr n a s ，s h r n a s ) 敲减技术将逆转录病毒 导入到解离型高转移株胰腺癌细胞p c 1 0 中，分别敲减m e k l 和m e k 2 的基因 表达。 材料与方法 一、材料 ( 一) 研究对象：细胞株和细胞培养 采用仓鼠非解离型低转移株胰腺癌细胞系p c 1 细胞和解离型高转移株胰腺癌 细胞系p c 一1 0 细胞。p c 1 细胞系是利用b o p 诱导的叙利亚仓鼠实验性胰腺癌模 型建立【1 1 。p c 1 0 细胞系是由同系仓鼠皮下接种p c 1 细胞后产生的肿瘤而建立【2 1 。 上述两种细胞系呈不同形态学方式生长。p c 1 细胞呈岛样细胞克隆方式生长， p c 1 0 细胞主要呈单个细胞方式生长【3 】o 利用r n a i 设计软件( c l o n t e c hl a b o r a t o r i e s ，i n c ，c a ，u s a ) 针对m e k l 和 m e k 2 基因序列设计s h r n a 序列。利用r n a i r e a d yp s i r e n r e t r o q - z s g r e e n 质 粒构建m e k l 和m e k 2s h r n a 。利用g p 2 2 9 3 包装细胞感染p c 1 0 细胞，建立 m e k l 和m e k 2s h r n a 稳定转染的亚细胞克隆。利用荧光显微镜对细胞进行筛选。 上述细胞系均以r p m i - 1 6 4 0 培养液( g i b c o b r l ，g r a n di s l a n d ，n y ) 培养，并 加1 0 胎牛血清( b i o s e r u m ，v i c t o r i a , a u s t r a l i a ) 、1 0 0u m l 青霉素g 和1 0 0p g m l 链霉素，于含5 c 0 23 7 c 孵箱内培养。上述细胞在进行免疫细胞学实验前行无 血清培养。 ( 二) 抗体 本实验中利用兔抗人的m e k l 、m e k 2 及l b - a c t i n 多克隆抗体( s a n t ac r u z b i o t e c h n o l o g y , s a n t ac r u z ，c a ) 作为一抗。利用辣根过氧化物酶结合的抗体( s a n t a c r u zb i o t e c h n o l o g y , s a n t ac r u z ，c a ) 作为第二抗体。 ( 三) 其他主要试剂 f b sg i b c o 美国 r p m i1 6 4 0 培养液g i b c o 美国 p t - p c r 试剂盒t a k a r a 同本 t r i z o l i n v i t r o g e n 美国 t r y p s i n g i b c o 美国 1 2 细胞裂解液 d m s o 细胞冻存液 u 0 1 2 6 分子量标志物 脱脂奶粉 e c l 发光液 抗荧光淬灭剂 多聚甲醛 牛血清白蛋白 c c k 8 碘化丙锭( p i ) ( 四) 主要仪器 超净工作台 c 0 2 恒温培养箱 倒置相差显微镜 旋涡振荡器 多功能电泳仪 转印电泳仪 自动凝胶成像分析仪 超纯水装置 实验室制冰机 p h 仪 电子天平 超低温冰箱 p c r 扩增仪 离心机 共聚焦显微镜 南京凯基 s i g m a 美国 c e l lb a n k e r 日本 c e l ls i g n a l i n g a m e r s h a m 美国 m e r k 美国 s a n t ac r u z 美国 v e c t o rh 1 0 0 0 美国 s i g m a 美国 s i g m a 美国 d o j i n d o 日本 s i g m a 美国 a i r t e c h 美国 t h e r m os c i e n t i f i c 美国 o l y m p u s 公司日本 q i l i n b e i e r 江苏 b a y g e n e 美国 t a n o n 上海 s y n g e n e 英国 m i l l i p o r e 美国 g 凡埘t 英国 s a r t o 耐u s 德国 d e n v e ri n s t r u m e n tc o m p a n y 美国 t h e r m os c i e n t i f i c 美国 聊 a r a 日本 e p p e n d o f f 德国 f v 5 0 0 一i x ，o l y m p u s 日本 1 3 p c 1 0 细胞。对照组细胞由g p 2 2 9 3 细胞与相应的空白载体( r n a i r e a d y p s i r e n - r e t r o q z s g r e e n 和p v s v - g ) 感染而来。转染后上述细胞系在r p m i1 6 4 0 培养液中培养4 8 小时。根据逆转录病毒基因转染和表达用户手册( p t 3 1 3 2 ， c l o n t e c hl a b o r a t o r i e s ，i n c ，c a ，u s a ) ，将含有逆转录病毒的细胞上清液过滤并感 染p c 1 0 细胞。为了得到m e k l 和m e k 2 基因敲减的亚细胞克隆株，我们利用 免疫荧光显微镜进行亚细胞克隆筛选，并建立p c 1 0 亚细胞克隆细胞系，并分别 培养和分析。 ( 三) 反转录p c r ( i m p c r ) 1 、总r n a 提取 应用t r i z o l 总r n a 提取试剂，按说明书进行操作： 1 4 ( 1 )