（生理学专业论文）α生育酚对链脲菌素诱导离体大鼠胰岛β细胞损伤的干预研究.pdf

重庆医科大学硕士研究生学位论文 英文缩写 q t s t z s o d m d a t - a o c n o s e n o s i n o s n n o s c a s p a s e c ”c f b s i n 呵 i l l b p b s t n f d t z m 尉n a d a b 符号说明 英文全称中文全称 仅t o c o p h e r o l q 一生育酚 s t r e p t o z o t o c i n链脲菌素 s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 超氧化物歧化酶 m a l o n d i a l d e h y d e 丙二醛 t o t a la n t i o x d a t i o nc o m p e t e n c e总抗氧化能力 n os v m h a s e一氧化氮合酶 e n d o t h e l i a lc e l ln o s内皮细胞型一氧化氮合酶 i n d u c i b l en o s诱生型一氧化氮合酶 n e u r o nn o s神经元型一氧化氮合酶 c y s t e i n ea s p a r t a t e s p e c i f i cp r o t e a s e s 特异性半胱氨酸酶 c v t o c h r o m ec细胞色素c 岛t a lb o v i n es e r u m 胎牛血清 i n t e r f e r o n干扰素 i n t e r l e u k i n - 11 3 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e t u m o rn e c r o s i sf a c t o r d i t h i z o n e m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ea c i d d i a m i n o b e n z i d i n e 1 白细胞介素一l1 3 磷酸盐缓冲液 肿瘤坏死因子 双硫腙 信使核糖核酸 二氨基联苯胺 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 学位论文作者签名：盘塞日期：墨丝星：臣：至 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业高校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文 论文作者签名：袁羹 指导教师签名：互! 红至；一 e t 期：羔塑多二三 重庆医科大学硕士研究生学位论文 q 一生育酚对链脲菌素诱导离体大鼠胰岛b 细胞损伤的 干预研究 摘要 第一部分：分离、培养的新生大鼠胰岛b 细胞形态及功 能鉴定 目的：探讨体外培养的新生大鼠胰岛b 细胞的功能状态。 方法：采用胶原酶对1 3 日龄w i s t a r 大鼠胰腺组织进行分次短时 消化。倒置显微镜观察接种1 8 h 细胞生长情况。继续培养7 2 h ，双硫腙 ( d i t h i z o n e ，d t z ) 染色及胰岛素免疫组化染色鉴定b 细胞，放射免 疫法检测葡萄糖刺激下胰岛素分泌水平。 结果：台盼蓝染色胰岛细胞存活率 9 0 ，d t z 染色可染率 8 0 ， 细胞分泌功能正常。 结论：胶原酶分次短时消化胰腺组织，细胞接种后及时转板的分 离培养方法为本实验提供了纯度较高、功能良好的胰岛细胞。 关键词：胰岛细胞，细胞培养 第二部分：c i 一生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛b 细胞 损伤的干预效应 目的：探讨q 一生育酚( a - t o c o p h e r o l ，q t ) 对链脲菌素( s t r e p t o z o t o c i n ，s t z ) 诱导大鼠胰岛b 细胞损伤的干预效应。 方法：1 分组：分离l 3 日龄w i s t a r 大鼠胰腺进行体外培养， 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 培养的细胞随机分为4 组：( 1 ) 对照组：培养的胰岛细胞不作任何干预 处理；( 2 ) a z 组：培养液中仅加入终浓度为2 0 m g lq t 作用2 4 h ； ( 3 ) s t z 组：培养液中仅加入终浓度为0 5 8 m g l 的s t z 作用3 0 m i n ；( 4 ) 干预组：培养液中加入终浓度为2 0 m g lq - z 预处理2 4 h 后，再加入终 浓度为0 5 8 m g l 的s t z 作用3 0 m i n 。各组作用时间一到，即离心弃上 清液，用新鲜培养液重悬细胞，继续培养1 8 h 后检测各项指标。2 方 法：采用m t t 比色法检测胰岛细胞活性，放射免疫法检测上清液中胰 岛素含量，透射电镜观察细胞形态，h o c h e s t 3 3 2 5 8 荧光染色观察细胞 荧光强度，t u n e l 法检测细胞凋亡率。 结果：与对照组比较，s t z 组胰岛细胞活性、胰岛素含量明显降低， 而胰岛细胞凋亡率显著升高( 仄0 0 5 ) 。同时，s t z 组电镜观察到凋亡 细胞，h o c h e s t 3 3 2 5 8 荧光染色发现发明亮淡蓝色强荧光细胞数显著增 多( 仄o 0 5 ) 。而在s t z 作用前给予q - t 预处理的干预组，胰岛细胞活 性、胰岛素含量及胰岛细胞凋亡率虽未恢复到对照组水平，但其下降 和上升的程度较s t z 组出现明显抑制( 仄o 0 5 ) 。 结论：q - t 能够抑制s t z 所致胰岛1 3 细胞凋亡而起到1 3 细胞保护 作用。 关键词：a 一生育酚，链脲菌素，胰岛1 3 细胞，细胞凋亡 第三部分：q 一生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛1 3 细胞 损伤的干预机理 目的：探讨a t 对s t z 诱导大鼠胰岛b 细胞损伤的干预机理。 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 方法：1 分组：同第二部分。2 方法：采用分光光度计测量上清 液中总抗氧化能力( t a o c ) 水平、超氧化物歧化酶( s o d ) 活性、丙 二醛( m d a ) 水平，一氧化氮合酶( n o s ) 活性、n o 水平及胰岛细胞特 异性半胱氨酸酶一3 ( c a s p a s e 一3 ) 活性、特异性半胱氨酸酶一8 ( c a s p a s e - 8 ) 活性。免疫组化法测定胰岛细胞b c l - x l 、b a x 蛋白表达。 结果：与对照组比较，s t z 组上清液中t - a o c 水平、s o d 活性明显 降低( 仄o 0 5 ) ，m d a 、n o 水平显著升高( 仄o 0 5 ) ，而n o s 活性无显著 性改变( 莎o 0 5 ) 。胰岛细胞c a s p a s e - 3 活性、c a s p a s e - 8 活性、b a x 表达明显升高( 仄0 0 5 ) ，b c l x l 表达明显降低( 仄o 0 5 ) 。在s t z 作 用前给予q - t 预处理的干预组，上述指标的变化虽未恢复到对照组水 平，但其下降和上升的程度较s t z 组出现明显抑制( 仄o 0 5 ) 。 结论：q - t 抑制s t z 所致胰岛1 3 细胞凋亡的机制与增强细胞抗氧 化能力，清除自由基，减少脂质过氧化，从而降低c a s p a s e - 3 、 c a s p a s e 一8 、b a x b c l x l 比例有关。 关键词：q 一生育酚，链脲菌素，胰岛1 3 细胞，c a s p a s e - 3 ，b c l x l 第四部分：q 一生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛b 细胞 损伤干预的n - 效关系 目的：探讨q t 对s t z 所致大鼠胰岛1 3 细胞损伤干预的剂一效关系。 方法：培养的胰岛细胞分为4 组：( 1 ) 对照组：培养的胰岛细胞不 作任何干预处理；( 2 ) q t 组：培养液中仅加入终浓度为8 0 m g lq t 作用2 4 h ：( 3 ) s t z 组：培养液中仅加入终浓度为0 5 8 m g l 的s t z 作用 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 0 m i n ；( 4 ) 干预组：培养液中加入终浓度为5 m g l 、l o m g l 、2 0 m g l 、 4 0 m g l 及8 0 m g l 的q - t 作用2 4 h 后，再加入终浓度为0 5 8 m g l 的s t z 作用3 0 m i n 。各组作用时间一到，即离心弃上清液，用新鲜培养液重悬 细胞，继续培养1 8 h 后采用m t t 法检测胰岛细胞活性、放射免疫法测 定胰岛素含量、分光光度计测量上清液中t a o c 水平。 结果：与s t z 组比较，不同浓度q t ( 5 - - - 8 0 m g l ) 干预组中胰岛 细胞活性、胰岛素分泌量及t - a o c 水平都有明显回升( p 0 0 5 ) ，该 效应随q - t 浓度的增加而增强，呈一定剂量依赖趋势( 不同浓度干预 组间比较p 0 0 5 ) 。 结论：q t 对胰岛细胞的保护作用呈一定剂量依赖趋势。 关键词：q 一生育酚，链脲菌素，胰岛1 3 细胞 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 t h ei n t e r v e n t i o ne f f e c to f 伐t o c o p h e r o lo n p a n c r e a t i cb e t ac e l l sd a m a g e db y s t r ep t o z o t o c i na n di t sr e l e v a n t m e c h a n i s m a b s t r a c t p a r to n e ：t h em o r p h o u sa n df u n c t i o ni n 订豫n c u l t u r eo fp 砒m a r yp a n c r e a t i c c e l l so fn e o n a t er a t s o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no fp a n c r e a t i cb e t ac e l l sf r o m n e o n a t er a t sc u l t u r e di nv i t r o m e t h o d s ：t h ep a n c r e a t i ct i s s u e so fn e o n a t er a t su n d e r w e n tr e p e a t e d d i g e s t i o nf o rs h o r td u r a t i o n sw i t hc o l l a g e n a s e ，a n dt h ec e l lg r o w t hw a s o b s e r v e du n d e ri n v e r t e dm i c r o s c o p e1 8 ha f t e rc e l li n o c u l a t i o n 。t h e nt h e c u l t u r e dc e l l sw e r et r a n s f e r r e dt oan e wc u l t u r ep l a t e 。t h ep a n c r e a t i cb e t a c e l l sw e r ei d e n t i f i e db yd i t h i z o n ea n di m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g ，a n d i n s u l i ns e c r e t i o ns t i m u l a t e d b yh i g h g l u c o s e w e r ee x a m i n e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y 7 2 ha f t e rc e l li n o c u l a t i o n 。 r e s ul t s ：t h er a t i oo fd i t h i z o n e s t a i n e dc e l l sw e r em o r et h a n8 0 w i t h t h ec e l lv i a b i l i t ye x c e e d i n g9 0 a sa s s e s s e db yt r y p a nb l u es t a i n i n g t h e s e c r e t i o nf u n c t i o no ft h ec u l t u r e dc e i l sr e m a i n e dn o r m a l 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 c o n c l u s i o n ：r e p e a t e dd i g e s t i o no ft h ep a n c r e a t i ct i s s u e sf o rs h o r t d u r a t i o n sw i t hc o l l a g e n a s ea n dt i m e l yc e l lt r a n s f e rt on e wp l a t em a y h e l p a c h i e v eh i g h l y p u r i f i e d v i a b l ei s l e tc e l l st h a ta r ew e l l a p p l i c a b l ef o r e x p e r i m e n t a ls t u d i e s k e y w o r d s ：p a n c r e a t i ci s l e tc e l l s ，c e l lc u l t u r e p a r tt w o ：t h ei n t e r v e n t i o n e f f e c to f 伐一t o c o p h e r o lo np a n c r e a t i cp c e l l sd a m a g e d b ys t r e p t o z o t o c i n o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ei n t e r v e n t i o ne f f e c to f0 【一t o c o p h e r o lo n p a n c r e a t i cb e t ac e l l sd a m a g e db ys t z m e t h o d s ：1 g r o u p s ：i s o l a t e da n dc u l t u r e db e t ac e l l sf r o mp a n c r e a so f n e w b o r nw i s t a rr a t sw e r ed i v i d e di n t of o u rg r o u p s ：( 1 ) c o n t r o l g r o u p ； ( 2 ) a - tg r o u p ：o n l y0 【tw a sa d d e dt ot h ec u l t u r em e d i u ma tt h e c o n c e n t r a t i o no f2 0m g lf o r2 4h o u r s ；( 3 ) s t zg r o u p ：o n l ys t zw a sa d d e d t ot h ec u l t u r em e d i u ma tt h ec o n c e n t r a t i o no f0 5 8m g lf o r3 0m i n u t e s ；( 4 ) i n t e r v e n t i o ng r o u p ：i s l e tc e l l sw e r et r e a t e df o r2 4h o u r sw i t h2 0 m g l 仅一t , t h e n0 5 8m g ls t zw a sa d d e df o r3 0m i n u t e s c u l t u r em e d i u mw a s r e m o v e da ts p e c i f i ct i m ea n dt h ec e l l sw e r er e s u s p e n d e dw i t hn o r m a l c u l t u r em e d i u m ，t h e nt h ef o l l o w i n gp r o c e d u r e sw e r eu n d e r t a k e na f t e r18 h o u r so fr e c o v e r yp e r i o d 2 m e a s u r e m e n t s ：t h ev i a b i l i t yo fi s l e tc e l l sw a s e v a l u a t e db ym t t ；i n s u l i nc o n t e n t so fc e l ls u p e m a t a n tw e r ee x a m i n e db y 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 r a d i o i m m u n o a s s a y ；t h ea p o p t o t i cc e l l sw e r ei d e n t i f i e db yt r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p e a n dh o e c h e s t 3 3 2 5 8f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g u n d e r f l u o r e s c e n tm i c r o s c o p ea sw e l la sq u a n t i f i e db yt u n e l r e s u l t s ：i ns t zg r o u p ，t h ei n s u l i nc o n t e n t sa n dt h ev i a b i l i t yo fi s l e t c e l l sw e r el o w e r , t h ea p o p t o s i sr a t ew a sh i g h e rt h a nt h o s ei nc o n t r o lg r o u p p o 0 5 ) t h ea p o p t o t i cb e t ac e l l sw e r ei d e n t i f i e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p ea n dh o e c h e s t 332 58 f l u o r e s c e n c es t a i n i n gu n d e rf l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e i ni n t e r v e n t i o ng r o u p ，t h ei n s u l i nc o n t e n t s ，t h ea c t i v i t yo fi s l e t c e l l sa n dt h ea p o p t o s i sr a t ed i dn o tr e t u r nt ot h en o r m a ll e v e l s ，b u tt h e y w e r ei n h i b i t e ds i g n i f i c a n t l yb y0 【一t ( c o m p a r e dw i t hs t zg r o u p ，p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：t - tc a ni n h i b i t et h ea p o p t o s i so fp a n c r e a t i cb e t ac e l l s i n d u c e db ys t z k e y w o r d s ：a t o c o p h e r o l ，s t r e p t o z o t o c i n ，p a n c r e a t i c1 3c e l l s ，a p o p t o s i s p a r tt h r e e ：t h ei n t e r v e n t i o nm e c h a n i s mo f 仅一t o c o p h e r o lo np a n c r e a t i c pc e l l s d a m a g e db ys t r e p t o z o t o c i n o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ei n t e r v e n t i o nm e c h a n i s mo f0 【一t o c o p h e r o l o np a n c r e a t i cb e t ac e l l sd a m a g e d b ys t z m e t h o d s ：1 g r o u p s ：t h es a m ea st h ep a r tt w o 2 m e a s u r e m e n t s ：t h e t - a o cl e v e l ，t h es o da n dn o sa c t i v i t y , t h em d aa n dn ol e v e l sw e r e e v a l u a t e d b ys p e c t r o m e t e rr e s p e c t i v e l y ；t h ea c t i v i t y o fc a s p a s e 一3a n d 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 c a s p a s e 8w e r ea ls om e a s u r e db ys p e c t r o m e t e r ；t h ee x p r e s s i o no fb c l x l a n db a xp r o t e i nw e r ee v a l u a t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g r e s u l t s ：i ns t zg r o u p ，t h et - a o cl e v e l ，s o da c t i v i t y , t h ee x p r e s s i o n o fb c l - x lw e r el o w e r , t h ea c t i v i t yo fc a s p a s e 一3a n dc a s p a s e 一8 ，t h el e v e l so f m d aa n dn o ，t h ee x p r e s s i o no fb a xw e r eh i g h e rt h a nt h o s ei nc o n t r o l g r o u p ( p o 0 5 ) ；i ni n t e r v e n t i o ng r o u p ，t h ea b o v ei n d e x e sd i dn o tr e t u mt o t h en o r m a ll e v e l s ，b u tt h e yw e r ei n h i b i t e ds i g n i f i c a n t l yb y 。【一t ( c o m p a r e d w i t hs t zg r o u p ，p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：t h ei n h i b i t i o no f0 【一to nt h ea p o p t o s i so f p a n c r e a t i cb e t a c e l l si n d u c e db ys t zi sp r o b a b l yc o r r e l a t e dw i t hi t sc a p a b i l i t yo fi n c r e a s i n g a n t i o x i d a t i o no fi s l e tc e l l s ，d o w n r e g u l a t i n gt h ea c t i v i t yo f c a s p a s e 一3a n d c a s p a s e 一8a sw e l la st h ep r o p o r t i o no fb a x b c l x 1 k e yw o r d s ：a t o c o p h e r o l ，s t r e p t o z o t o c i n ，p a n c r e a t i c1 3c e l l s ，c a s p a s e - 3 ， b c l x l p a r tf o u r ：t h ed o s e e f f e c tr e l a t i o n s h i po f 仅一t o c o p h e r o lo np a n c r e a t i c b c e l l s d a m a g e db ys t r e p t o z o t o c i n o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ed o s e e f f e c tr e l a t i o n s h i po fa t o c o p h e r o l o np a n c r e a t i cpc e l l sd a m a g e d e db ys t z m e t h o d s ：1 g r o u p s ：i s o l a t e da n dc u l t u r e db e t ac e l l sf r o mp a n c r e a so f n e w b o r nw i s t a rr a t sw e r ed i v i d e di n t of o u rg r o u p s ：( 1 ) c o n t r o l g r o u p ； 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ( 2 ) c 【- t g r o u p ：o n l y a tw a s a d d e dt ot h ec u l t u r em e d i u ma tt h e c o n c e n t r a t i o no f8 0m g lf o r2 4h o u r s ；( 3 ) s t zg r o u p ：o n l ys t zw a sa d d e d t ot h ec u l t u r em e d i u ma tt h ec o n c e n t r a t i o no f0 5 8m g lf o r3 0m i n u t e s ；( 4 ) i n t e r v e n t i o ng r o u p s ：i s l e tc e l l sw e r et r e a t e df o r2 4h o u r sw i t h 5 ，10 ，2 0 、 4 0 、8 0 m g l0 l - tr e s p e c t i v e l y , t h e n o 5 8 m e d ls t zw a sa d d e df o r3 0 m i n u t e s c u l t u r em e d i u mw a sr e m o v e da ts p e c i f i ct i m ea n dt h ec e l l sw e r e r e s u s p e n d e dw i t hn o r m a lc u l t u r em e d i u m ，t h e nt h ef o l l o w i n gp r o c e d u r e s w e r eu n d e a a k e na f t e r18h o u r so fr e c o v e r yp e r i o d 2 m e a s u r e m e n t s ：t h e v i a b i l i t yo fi s l e tc e l l s w a se v a l u a t e db ym t t ；i n s u l i nc o n t e n t so fc e l l s u p e m a t a n tw e r ee x a m i n e db yr a d i o i m m u n o a s s a y ；t h et - a o cl e v e lw a s e v a l u a t e db ys p e c t r o m e t e r r e s u l t s ：c o m p a r e d w i t hi ns t zg r o u p ，i nd i f f e r e n ti n t e r v e n t i o n g r o u p s ( t h ec o n c e n t r a t i o n so f 仪一tf r o m5t o8 0m r d l ) ，t h ev i a b i l i t yo f i s l e t c e l l sa n dt h ei n s u l i nc o n t e n t sa sw e l la st h et - a o cl e v e lw e r eh i g h e r ( p 0 0 5 ) ，t h e e f f e c t so f0 【一te n h a n c e d a l o n g w i t hi n c r e a s e dw i t hi t s c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d ，s h o w i n gac e r t a i nd o s e d e p e n d e n tt r e n d ( c o m p a r e d i nd i f f e r e n ti n t e r v e n t i o ng r o u p s ，p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：t h ep r o t e c t i v ee f f e c to fq to nt h ep a n c r e a t i cpc e l l s d a m a g e db ys t zs h o w e dad o s e d e p e n d e n tt r e n d k e yw o r d s ：a - t o c o p h e r o l ，s t r e p t o z o t o c i n ，p a n c r e a t i cpc e l l s 1 0 重庆医科大学硕士研究生学位论文 q 一生育酚对链脲菌素诱导离体大鼠胰岛b 细 胞损伤的干预研究 上- j 一 刖青 细胞凋亡是指在一定生理或病理条件下，受基因调控、遵循自身程序的细胞 死亡过程。生理状态下的细胞凋亡能够维持内环境的稳定、组织器官的正常生理 功能，而病理条件下凋亡过程的紊乱可能直接或间接导致肿瘤、a l z h e i m e r s 病、 糖尿病以及其他自身免疫性疾病的发生。细胞凋亡是多基因严格控制的过程，这 些基因包括b c l - 2 家族、c a s p a s e 家族等。随着分子生物学技术的发展，人们对凋 亡相关基因在细胞凋亡过程中的作用有了一定的认识。但是，其确切的作用机制 尚不完全清楚。 糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，以1 型、2 型较为常见。研究表明，1 型糖尿 病胰岛细胞死亡的病理学特征主要表现为凋亡。2 型糖尿病肥胖和非肥胖型患者的 胰岛b 细胞数量较正常人群均明显减少，且b 细胞凋亡率分别较之增加了3 倍 和1 0 倍。由此认为，2 型糖尿病同样具有b 细胞凋亡的病理学特征。因而减少b 细胞凋亡将有利于保护胰岛功能，延缓糖尿病的发生、发展。 自由基是最外层电子轨道上具有不配对电子的原子或原子团，对维持正常生 命活动必不可少旺1 。同时，自由基具有高度的氧化活性，与生物膜中不饱和脂肪酸 反应，造成膜损伤。脂质过氧化产物又可分解为更多的自由基，引起自由基的连 锁反应。自由基产生过多或清除障碍，不仅会导致广泛的氧化损伤，还可调控基 因表达诱导细胞凋亡，诱发各种疾病b 1 。近年来发现胰岛b 细胞内抗氧化酶系含 量较其他细胞少h 1 ，而细胞对自由基损伤的易感性取决于胞内抗氧化酶系的含量 西1 ，因而b 细胞较其他细胞对氧化应激更为敏感，体内自由基产生过多更易导致 b 细胞凋亡及糖尿病的发生氓7 1 。这些结果为探索抗氧化剂作为糖尿病防治的可能 性提供了新的理论依据。 维生素e 是一类生理性抗氧化剂，是生育酚和生育三烯酚以及具有d a t 生 理活性的衍生物的总称。其中，生育酚的分子结构如下： 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 根据苯环上甲基数及其位置的不同，将生育酚区分为a 一、1 3 一、y 一、6 4 种 异构体。其中- t 生理活性最强，在人体内分布最广泛阳1 。q - t 是目前公认的氧自 由基清除剂，其结构中具有酚性羟基，可将活泼的氢原子传递给细胞膜中的活性 氧，使后者变为稳定性分子，有效阻断和防止自由基引发的氧化、过氧化反应， 保护生物膜免受氧化、过氧化损伤。在其它诸多领域中已经证实a - t i 昵, 够抑制活 性氧介导的细胞凋亡过程，但少见关于q - t 对胰岛细胞保护效应方面的研究，而 a t 对1 3 细胞凋亡直接干预作用方面的研究报道更是少见。本研究以s t z 诱导离体 大鼠胰岛1 3 细胞损伤为模型，通过检测胰岛素分泌量、细胞t - a o c 水平、s o d 活性、 m d a 水平、n o s 活性、n o 水平、1 3 细胞凋亡率、c a s p a s e 一3 及c a s p a s e - 8 活性变化、 b a x 和b c l x l 蛋白表达等指标的变化，探讨q - t 对s t z 所致胰岛b 细胞损伤的干预 作用及其可能的机制，以期为q - t 对糖尿病的防治提供相关的实验资料和理论依 据。具体内容分为四部分： 第一部分：分离、培养的新生大鼠胰岛b 细胞形态及功能鉴定 第二部分：q 一生育酚对链脲菌素诱导的大鼠胰岛1 3 细胞损伤的干预效应 第三部分：q 一生育酚对链脲菌素诱导的大鼠胰岛1 3 细胞损伤的干预机理 第四部分：q 一生育酚对链脲菌素诱导的大鼠胰岛1 3 细胞损伤干预的剂效关系 1 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一部分分离、培养的新生大鼠胰岛b 细胞形态及功 能鉴定 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 实验动物 选用出生1 - 3 天的清洁级w i s t a r 新生鼠，由重庆医科大学实验动物中心提供。 1 1 2 试剂 1 ) r p m i 一1 6 4 0 培养液( 美国g i b c o 公司) 2 ) 胎牛血清( 杭州四季青生物制剂公司) 3 ) v 型胶原酶( 美国s i g m a 公司) 4 ) d t z 染色液( s i g m a 公司) 5 ) 小鼠抗人胰岛素抗体( 美国抗体诊断公司) 6 ) f i t c 一山羊抗小鼠i g g ( 江苏碧云天生物科技公司提供) 7 ) d a b 显色试剂盒( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 8 ) 胰岛素放射免疫检测试剂盒( 北京原子高科股份有限公司) 1 1 3 主要仪器与设备 1 ) c 0 2 细胞恒温培养箱：( 美国t h e r m of o r m a 公司) 2 ) 电热恒温水浴箱：( 北京医疗设备厂) 3 ) c k x 4 1 型倒置光学显微镜：( 日本o l y m p u s 公司) 4 ) d f m - 9 6 型放射免疫y 计数器：( 合肥从成机电技术开发有限责任公司) 5 ) b h i i 型荧光显微镜：( 日本o l y m p u s 公司) 1 2 方法 1 2 1 大鼠胰岛细胞分离、培养 取出生l 3 日龄w i s t a r 大鼠，常规消毒，剖腹暴露手术野，无菌取出胰腺， 清除胰外网膜、脂肪组织后，4 h a n k s 液清洗2 3 次。用外科剪将胰腺剪至 1 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 0 5 - 1 r n m 3 大小组织碎块。h a n k s 液漂洗3 次后，加入5 倍体积1 m m lv 型胶原酶 溶液混匀，3 8 水浴箱中振动消化8 1 0 m i n ，至消化液浑浊时，用4 。ch a n k s 液 终止消化，消化产物静置片刻，自然沉淀后吸取上层消化浊液，剩余未消化组织 基本消化完毕。收集各次消化浊液，经2 0 0 目不锈钢筛网过筛，离心( 1 0 0 0 r m i n 3 m i n ) ，弃上清液。用无血清r p m i 1 6 4 0 培养液重悬细胞沉淀，离心( 1 0 0 0 r m i n 3 m i n ) ，洗涤2 次，弃上清液，细胞沉淀接种于内含1 0 胎牛血清、1 0 0 u m l 的 青霉素和0 1 m g m l 链霉素的r p m i - 1 6 4 0 完全培养液的培养瓶，置于3 7 c ，5 c 0 2 9 5 空气完全湿化的c 0 2 培养箱内进行培养。细胞培养1 8 h 后转皿去除成纤维 细胞。收集胰岛细胞悬液，离心( 1 0 0 0 r m i n x3 m i n ) ，弃上清液，重复一次，细胞 沉淀中加入新鲜r p m i 1 6 4 0 完全培养液，接种于2 4 孔板( 1 1 0 5 细胞孔) 继续 培养7 2 h 。 1 2 2 胰岛细胞的生长情况 倒置显微镜观察分离后培养1 8 h 的胰岛细胞的生长状态。细胞明亮、折光性 强、培养液颜色变浅指示细胞生长良好。 1 2 3 胰岛细胞活率及1 3 细胞获得率测定 台盼蓝染色：取转皿后培养7 2 h 的胰岛细胞悬液，离心( 1 0 0 0 r m i n l m i n ) ， 弃上清，加入l m l p b s 缓冲液( p h 值7 4 ) 重悬细胞沉淀，吸取1 0 0 i _ t l 重悬的细胞到 一塑料离心管内，加入1 0 0 i - t l 台盼蓝染色液，轻轻混匀，染色3 一- - 5 m i n 。吸取少量 混匀的细胞悬液，用血细胞计数板计数，至少计数5 0 0 个细胞。凡折光性强而不 着色的为活细胞，染上蓝色的为死细胞。数出蓝色细胞和细胞总数。 细胞存活率= ( 细胞总数一蓝色细胞数) 细胞总数1 0 0 d t z 染色：取转皿后培养7 2 h 的胰岛细胞悬液，洗涤2 次，细胞沉淀中加入 l m l p b s 缓冲液( p h 值7 4 ) 及l m l d t z 染色液，置于3 7 c 培养箱中温育1 5 m i n ，倒置显 微镜下观察细胞着色情况，用血细胞计数板计数，猩红色即为胰岛1 3 细胞，数出 猩红色细胞和细胞总数，计算胰岛1 3 细胞获得率。 胰岛1 3 细胞获得率= ( 猩红色细胞数细胞总数) l o o 。 1 2 4 胰岛1 3 细胞鉴定 免疫荧光化学鉴定胰岛且细胞。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。 1 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 2 5 胰岛d 细胞功能检测 利用葡萄糖刺激胰岛素释放试验，检测胰岛功能。接种7 2 h 的胰岛细胞，加 入含有5 6 m m o l l 葡萄糖和1 6 7 m m o l l 葡萄糖的r p m i - 1 6 4 0 培养液，孵育1 h ，收 集上清液，分装，置于一2 0 保存待测。采用放射免疫双抗体法，y 计数仪测定 上清液中胰岛素含量。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。 1 3 统计学分析 实验结果以均数- 4 - 标准差( 叉士s ) 表示，数据用s a s 软件进行统计分析，采用 两个样本均数比较的t 检验，以p 0 0 5 表示差异有显著性。 2 结果 2 1 胰岛细胞生长情况 刚分离纯化的胰岛细胞，光镜下表现为大小不一的圆形或椭圆形细胞团，细 胞团周边形成一完整包膜，边缘清晰，折光性强。散在分布的单一细胞较少。台 盼蓝染色显示9 0 以上的细胞活性良好。1 8 h 后，胰岛细胞转皿前，可见成纤维细 胞己贴壁生长。胰岛细胞团呈圆形或椭圆形，尚未贴壁。其周边发亮，折光性强， 培养液颜色变淡，提示细胞生长状态良好。散在分布的单一细胞较前有所增多， 其折光性相对减弱。接种7 2 h 后，散在分布的单个胰岛细胞明显增多，圆形或椭圆 形，形态较均一，胞质颗粒丰富，部分细胞胞质较透明，可见胞核与核仁( p h o t o 1 ) 。