（发酵工程专业论文）谷氨酸废水提取rna的研究.pdf

- f 厶 ， - - at h e s i ss u b m i t t e df o r t h ea p p l i c a t i o no f t h em a s t e r sd e g r e eo fe n g i n e e r i n g s t u d y o ne x t r a c t i o no fr n af r o m glu t a m a t e 帕白s t e w a t e r c a n d i d a t e ： y a n gx i a o j i a o s p e c i a l t y ： f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r l ij i n g l o n g s h a n d o n gi n s t i t u t eo fl i g h ti n d u s t r y , j i n a n ，c h i n a j u n e ，2 0 1 0 55洲6 4m坩ji7，iiiiiy y。j。， j 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：叠立邀! 导师签名： 日期：2 竺丝年么_ 月兰二日 - k - ： 山东轻工业学院硕十学位论文 摘 目录 a b s t r a c t i 第1 章绪论1 1 1 谷氨酸废水的概述1 1 1 1 谷氨酸废水特点1 1 1 2 谷氨酸废水提取菌体蛋白的工艺1 1 1 3 谷氨酸废水提取菌体蛋白的方法1 1 1 4 谷氨酸废水中提取菌体蛋白外表特征2 1 1 5 谷氨酸菌体蛋白的应用3 1 2r n a 的概况。3 1 2 1r n a 结构及理化性质3 1 2 2r n a 的应用4 1 2 3r n a 的提取。5 1 2 4r n a 的纯化5 1 2 5r n a 的测定。6 1 3r n a 的发展前景7 1 4 本课题研究目的意义7 1 5 本课题研究的内容7 第2 章谷氨酸废水成分的测定9 2 1 引言9 2 2 实验材料与仪器设备9 2 2 1 主要试剂9 2 2 2 仪器及设备一1 0 2 3 实验方法及步骤1 0 2 3 1 总酸含量的测定10 2 3 2 废水密度的测定1 2 目录 2 3 3 残留谷氨酸含量的测定1 2 2 3 4c o d c r 含量的测定1 3 2 3 5 蛋白质含量的测定1 5 2 36 氨基氮含量的测定1 6 2 37 还原糖含量的测定1 9 2 3 8 悬浮物含量的测定2 2 2 3 9 总固形物的测定2 2 2 3 1 0 游离脂肪含量的测定2 3 2 3 1 1 灰分含量的测定2 4 2 4 实验结果与讨论2 5 2 4 1 废水中总酸的测定结果2 5 2 4 2 谷氨酸废水密度的测定结果2 5 2 4 3 残留谷氨酸的测定结果2 5 2 4 4c o d e r 的测定结果2 5 2 4 5 蛋白质的测定结果2 6 2 46 氨基氮的测定结果2 6 2 47 还原糖的测定结果2 6 2 4 8 悬浮物的测定结果2 7 2 4 9 总固形物的测定结果2 7 2 4 1 0 游离脂肪的测定结果2 7 2 4 1 1 灰分的测定结果2 7 2 5 本章小结2 7 第3 章谷氨酸菌体蛋白提取工艺的研究2 9 3 1 引言2 9 3 2 实验材料与仪器设备2 9 3 2 1 主要试剂2 9 3 2 2 仪器及设备2 9 3 3 实验方法3 0 3 4 实验内容3 0 3 4 1 絮凝剂的添加量对谷氨酸菌体蛋白提取的影响3 0 3 4 2 温度对谷氨酸菌体蛋白提取的影响3 0 ， 1 i 山东轻工业学院硕士学位论文 3 4 3p h 对谷氨酸菌体蛋白提取的影响3l 3 4 4 搅拌速度对谷氨酸菌体蛋白提取的影响3 1 3 4 5 搅拌时间对谷氨酸菌体蛋白提取的影响3 1 3 5 实验结果与讨论。3 2 3 5 1 絮凝剂的添加量对谷氨酸菌体蛋白提取实验结果3 2 3 5 2 温度对谷氨酸菌体蛋白提取实验结果3 3 3 5 3p h 对谷氨酸菌体蛋白提取实验结果3 5 3 5 4 搅拌速度对谷氨酸菌体蛋白提取实验结果。3 6 3 5 5 搅拌时间谷氨酸菌体蛋白提取实验结果3 8 3 6 本章小结3 9 第4 章r n a 提取工艺的研究一4 l 4 1 引言4 l 4 2 实验材料与仪器设备4 2 4 2 1 主要试剂4 2 4 2 2 仪器及设备4 3 4 3 实验方法4 3 4 3 1 谷氨酸菌体蛋白成分的测定。4 3 4 3 2 菌体蛋白的预处理4 6 4 3 3 上清液中r n a 的测定4 6 4 4 实验内容4 6 4 4 1 食盐法提取r n a 的研究4 6 4 4 2 超声波法提取r n a 的研究4 8 4 5 实验结果与讨论4 9 4 5 1 菌体蛋白的主要成分及含量4 9 4 5 2 盐法提取r n a 的单因素实验结果4 9 4 5 3 盐法提取r n a 的正交实验结果5 2 4 5 4 超声波提取r n a 的单因素实验结果5 3 4 5 5 超声波法提取r n a 的j 下交实验结果5 4 4 6 本章小结5 5 第5 章r n a 的纯化与鉴定5 7 5 1 引言5 7 目录 5 2 实验材料与仪器设备5 7 5 2 1 主要试剂5 7 5 2 2 仪器及设备5 7 5 3 实验方法与步骤。5 8 5 3 1r n a 的纯化方法5 8 5 3 2r n a 粗品的获得5 9 5 3 3r n a 定量测定5 9 5 3 4r n a 纯度的计算6 l 5 4 实验结果与讨论6 2 5 4 1r n a 纯化方法。6 2 5 4 2 紫外吸收法测定r n a 纯度6 6 5 5 本章小结6 7 第6 章结论与展望6 9 6 1 结论6 9 6 1 1 谷氨酸废水中各种成分以及含量6 9 6 1 2 谷氨酸菌体蛋白的提取工艺6 9 6 1 3 谷氨酸菌体蛋白中提取r n a 工艺的研究6 9 6 1 4r n a 的纯化与鉴定6 9 6 2 展望。7 0 参考文献7 1 致谢。7 5 在学期间主要科研成果7 7 一、发表学术论文7 7 二、其它科研成果7 7 4 山东轻丁业学院硕上学位论文 摘要 我国是味精生产大国，每年生产味精7 0 万多吨，居世界首位。味精生产过程 中等电点分离排放的废液，污染负荷高、数量大，污染严重。据统计，每生产味1 吨味精，可排放2 0 1 j 屯左右的废液。谷氨酸废水中含有大量的菌体蛋白以及有用的 有机物，充分的利用将会变废为宝。因此，研究从谷氨酸废水中提取r n a 的工艺， 对目前解决我国r n a 原料的短缺问题显得十分重要。本课题不仅可以去除废液中 的一部分有机物，减轻废液对环境的污染负荷，同时又生产出高质量的产品。该 项产品的开发，将会具有一定的经济和社会效益。 本课题以谷氨酸废水为原料，通过以下几个方面来开展工作： 第一：首先采用各种试验方法测定了谷氨酸废水中的主要成分及含量。废水 中总酸含量为0 9 9 8 4m l 1 0 0 m l ，密度为1 0 5 7 x 1 0 3m g l ，残留谷氨酸2 9 0m g d l ， c o d e r 为2 0 4 9 6m g l ，蛋白质7 6 7m g m l ，氨基氮0 2 5 ，还原糖0 9 7 3g 10 0 m l ， 悬浮物0 8 2g 1 0 0 m l ，总固形物0 0 9 7 2g m l ，游离脂肪2 3 ，灰分0 5 。 第二：以聚丙烯酸钠为絮凝剂，来提取谷氨酸废水中的菌体蛋白。通过研究 聚丙烯酸钠的添加量、作用温度、时间、搅拌速度等单因素实验和正交实验，得 出最佳提取工艺条件为：反应体系p h 值为3 0 ，接近于废水原有的酸度范围，维 持反应温度为6 0 ，聚丙烯酸钠的添加量为2 ，搅拌速度为2 0 r m i n ，搅拌时间 为1 5 m i n ，静止放置一段时间，谷氨酸菌体蛋白的提取率可以达到8 5 ，沉淀稳 定时间为5 m i n 。 第三：以提取出来的菌体蛋白为原料，采用盐法和超声波法，通过单因素实 验以及正交实验来确定r n a 提取工艺。实验表明：盐法提取r n a 最佳工艺条件 为：提取p h 为9 0 ，提取时间为1 0 5 m i n ，提取温度为9 5 ，n a c i 的浓度为6 ； 超声波法提取r n a 的最佳工艺条件为：超声波强度为2 0 0 w ，超声时间为4 0 m i n ， 料液比为l ：1 0 。 第四：将提取出来的r n a 进行纯化，采用酶法脱除其中的蛋白质，最佳条件 为：酶添加量为0 5 ，酶解时间为1 h ，酶解温度为5 5 ，p h 为6 0 ，此时蛋白 质的去除率为6 0 2 ，测得r n a 损失率为1 0 。紫外吸收法测定其纯度为8 9 4 7 。 关键词：谷氨酸废水；菌体蛋白；r n a ；提取；纯化 摘要 - _ _ _ _ - _ - _ _ - 一 山东轻丁业学院硕士学位论文 a b s t r a c t c h i n ai st h el a r g e s tp r o d u c e ro fm o n o s o d i u mg l u t a m a t e ，m s ga r ep r o d u c e dm o r e t h a n7 0 0 ，0 0 0t o n sa n n u a l l y i ti st h ef i r s ti nt h ew o r l d ，t h ep o l l u t i o no fm o n o s o d i u m g l u t a m a t ei sh i g ha n dw i l lc a u s es e r i o u sr e s u l t a c c o r d i n gt os t a t i s t i c s ，e a c h1t o no f m s gi sp r o d u c e d ，2 0t o n so fw a s t ec a i lb ed i s c h a r g e dt ot h ee n v i r o n m e n t g l u t a m a t e w a s t e w a t e rc o n t a i n sl a r g ea m o u n t so fp r o t e i n sa sw e l la su s e f u lo r g a n i c ，f u l lu s i n go f t h e s ep r o t e i n sw i l lb et u r n e dw a s t ei n t ow e a l t h t h e r e f o r e ，t h es t u d yo ne x t r a c t i o no f r n af r o mc e l lp r o t e i ni se x t r e m e l yi m p o r t a n tt os o l v et h ec u r r e n tr n a s h o r t a g eo f r a wm a t e r i a l si nc h i n a t h i si s s u ec a nn o t o n l yr e m o v ep a r to ft h eo r g a n i cw a s t e ，b u t a l s or e d u c et h ep o l l u t i o no fw a s t et ot h ee n v i r o n m e n t ，w h i l ep r o d u c i n gh i g hq u a l i t y p r o d u c t s i tw i l lb ec e r t a i ne c o n o m i ca n ds o c i a lb e n e f i t s i nt h i sp a p e r , ie x p l o r eg l u t a m a t ew a s t e w a t e ra sr a wm a t e r i a l s ，a n dc a r r yo u tt h e f o l l o w i n ga s p e c t so fw o r k ： f i r s to fa l l ，g l u t a m i ca c i dw a sd e t e r m i n e du s i n ga v a r i e t yo fw a s t e w a t e r c o m p o s i t i o na n dc o n t e n t t o t a la c i d ，d e n s i t y , r e s i d u a lg l u t a m a t e ，c o d e r , p r o t e i n , a m i n on i t r o g e n ，r e d u c i n gs u g a r , t o t a ls o l i d ，f l e ef a t ，a s h ，c o n t e n to fw a s t e w a t e ri s 0 9 9 8 4m u l 0 0 m l ，1 0 5 7 x 10 m g l ，2 9 0m g d l ，2 0 4 9 6m g l ，7 6 7m g m l ，0 2 5 ， 0 9 7 3 9 10 0 m l ，o 8 2 9 10 0 m l ，o 0 9 7 2g m l ，2 3 ，o 5 s e c o n d l y ：t h ef l o c c u l a n ti ss o d i u mp o l y a c r y l a t eu s e dt oe x t r a c tc e l lp r o t e i n b y s t u d y i n g t h e s i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n t so fa d d i t i o no fs o d i u m p o l y a c r y l a t e ，t e m p e r a t u r e ，t i m e ，s t i r r i n gs p e e d ，r e c e i v i n gt h eo p t i m u me x t r a c t i o n c o n d i t i o n sw e r e ：p ho fr e a c t i o ns y s t e mw a s3 0c l o s et ot h eo r i g i n a lw a s t e w a t e r , t h e r e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s6 0 ，s o d i u mp o l y a c r y l a t ew a s2 ，s t i r r i n gs p e e dw a s2 0 r m i n ，m i x i n gt i m ew a s15m i n ，e x t r a c t i o nr a t eo fc e l lp r o t e i nw a su pt o8 5 ，t h et i m e o fs e d i m e n t a t i o ns e t t l i n gw a s5m i n t h i r d l y ：t h ec e l lp r o t e i ne x t r a c t e do u to ft h ew a s t ew a t e rw a sa sr a wm a t e r i a l s ，s a l t ， a n da l k a l i n ea u t o l y s i su l t r a s o n i cm e t h o dw a su s e d ，b ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa n d o r t h o g o n a lt e s tt od e t e r m i n et h er n a e x t r a c t i o n e x p e r i m e n t ss h o wt h a t ：t h eo p t i m a l c o n d i t i o n ss a l te x t r a c t i o nr n aw e r e ：t h ep h lt i m e t e m p e r a t u r eo fe x t r a c t i o nw e r e9 0i 1 0 5m i n ，9 5 。c ，c o n c e n t r a t i o no fn a c lw a s6 t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r eu l t r a s o n i c e x t r a c t i o no fr n a ：t h ep o w e ro fu l t r a s o u n dw a s2 0 0 w , t h et i m eo fu l t r a s o u n dw a s4 0 m i n ，r a t i oo f s o l i dt ol i q u i dw a s1 ：10 a b s t r a c t l a s t l y ：t h er n a e x t r a c t e dw a sp u r i f i e d ，o n em e t h o do ft h ep r o t e i n sr e m o v a l i n g w a su s e db ye n z y m a t i c ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fe n z y m a t i cw e r e d o s a g eo fe n z y m e o 5 ，r e a c t i o nt i m elh ，h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e5 5 c ，p h6 0 a tt h i sc o n d i t i o n ，t h e r e m o v a lr a t eo fp r o t e i nw a s6 0 2 a n dt h el o s so fr n aw a s10 t h ep u r i t yo fr n a d e t e r m i n a t i o nb yu va b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r yw a s8 9 4 7 w a s t e w a t e r ，c e i lp r o t e i n ，r n a ，e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ， 山东轻t 业学院硕上学位论文 第1 章绪论 1 1 谷氨酸废水的概述 1 1 1 谷氨酸废水特点 改革开放以来，我国发酵行业发展迅速，尤其是味精行业。众所周知，我国 味精生产量之大，已稳居世界榜首，其废水中含有高浓度c o d 和b o d 及大约o 6 还原糖和1 o 谷氨酸菌体【1 1 。谷氨酸废水主要来自于提取谷氨酸剩余离交母液、 生产过程洗涤各种设备污水及各个过程中冷凝水。大量废液的排放和废菌体挤压 堆积，已经成为一种主要污染源，破坏了生态环境，浪费了有用资源【2 】。如果将 谷氨酸废水加以利用，是与环保相结合的一个重要举措，不但能充分利用废弃资 源，而且能获得新产品，一举两得，应用前景极其广阔，这也是广大味精企业普 遍关注的问题【】。 1 1 2 谷氨酸废水提取菌体蛋白的工艺 发酵行业废水的排放给人们的生存空间带来了很大的污染，因此，对谷氨酸 废水的治理已经成为目前迫切需要解决的问题【5 】。谷氨酸废液中含有大量的有用 物质，可以通过絮凝沉淀法、离心分离法、超滤分离等方法提取，可降低废水中 的c o d 含量，其除去率可以达到5 0 左右，达到减污减排的目的，符合国家目 前的环保政策【6 】。 高速离心技术提取谷氨酸菌体蛋白，也可显著提高味精产品质型7 1 。等电交 换技术提取味精后，再从味精的离交母液中获得谷氨酸菌体蛋白。到目前为止， 此法已经被大多数味精厂所接受【8 】。从等电母液获得谷氨酸菌体蛋白，首先在提 取味精后的废液，加入絮凝剂使菌体絮凝沉淀，从而获得谷氨酸菌体蛋刨引。 1 1 3 谷氨酸废水提取菌体蛋白方法 ( 1 ) 离心法 此法是利用味精母液中有机物质与水比重差，通过离心达到固液分离目的。 味精菌体特别小，一般采用进口的蝶片离心机m 1 1 1 。该技术在西方发达国家使用 较多，设备也比较完善，国内有较少的报道。自二十世纪九十年代以来，使用该 工艺后，得到了较好社会效益和经济效益，测得的谷氨酸菌体中含有6 5 以上粗蛋 白，粗脂肪为3 5 ，扶分不大于4 ，并且含有十几种有用的氨基酸，因此可作 为高效饲料添加剂【l2 1 。目前，高速离心机尚依赖进口，投资较大，运行能耗也高， 且处理能力有限，制约了发展。投资较大，运行能耗高是离心分离谷氨酸菌体蛋 第1 章绪 论 白面临的瓶颈问题【1 3 】。 ( 2 ) 超滤膜法 超滤技术近几年来作为一种新兴的分离方法，在处理废水中应用广泛，其设 备比较简单，一般对菌体蛋白提取率超过9 0 ，符合味精母液资源再利用的要求 【1 4 】。超滤就在压力的推动作用下一种膜分离方法，该方法从废液中获得谷氨酸菌 体蛋白，早在好几年前，国外就有过类似的报道【l5 1 。国内有的专家利用此法分离 获得的谷氨酸菌体，其提取率达9 8 以上，并且可以很大程度上降低味精废水中 的生化需氧量和化学需氧量。 虽然超滤技术具有上述优点，但是在应用中存在膜污染严重，容易产生二次 污染。并且一次投资大等问题，尚不能很好解决，这些问题还有待于进一步研究。 ( 3 ) 加热沉淀法 高温加热谷氨酸废水后，就可以杀死其中的菌体，因为高温可使蛋白变性， 从而使菌体絮凝沉淀，就可以获得大量菌体蛋白，其中粗蛋白含量约在6 0 左右。 该方法虽然简单易行，但是能耗比较大，也不容易实现连续生产【1 6 1 。 ( 4 ) 絮凝沉降法 味精母液含有大量菌体蛋白等悬浮物和胶体物质，加入适量絮凝剂，在一定 条件下静置，使菌体和蛋白质凝集在一起，再加助滤剂过滤，经脱水干燥就可以 获得菌体蛋白【1 7 】。一般情况下，絮凝法很少单一使用，需要和沉淀法联合使用， 构成絮凝沉淀，这是提取谷氨酸菌体蛋白的重要方法【l8 1 。谷氨酸废水中蛋白质、 残糖等含量比较高，粘性比较大，不容易压缩沉淀，酸性比较强，悬浮颗粒也带 有较强的正电荷【1 9 】。常用的絮凝剂有无机絮凝剂和有机絮凝剂。无机絮凝剂一般 也很少单独使用，通常作为助凝剂，与有机絮凝剂联合使用【2 0 捌】。 ( 5 ) 气泡捕集法 在谷氨酸母液中加入阳离子电解质，因为谷氨酸废水中含有大量带正电荷的 悬浮物，这些电解质能够捕集母液中的菌体，菌体自溶物及杂蛋白，形成一定大 小的颗粒，再加入阴离子表面活性剂，产生的气泡与颗粒结合，由于气泡上浮， 夹带颗粒脱离液相，再经板框过滤、干燥即得谷氨酸菌体蛋白。该工艺具有操作 条件简单、消耗时间短、运用成本低、废水的处理量大等优点，适合谷氨酸废水 中菌体蛋白的提取【2 2 】。 1 1 4 谷氨酸废水中提取菌体蛋白外表特征 谷氨酸菌体蛋白是谷氨酸发酵过程中副产物，是提取谷氨酸后的废弃菌体。 一般情况下，它的外形为颗粒状，也有的为粉术状，且颜色也会随着发酵原料的 不同而不同，多数情况为灰白色、土黄色，也有的呈现出褐色【2 3 j 。 山东轻- 丁业学院硕上学位论文 1 。1 5 谷氨酸菌体蛋白的应用 为减少谷氨酸发酵产生的废液对环境造成污染，充分利用有用资源，将其有 用的成分生产多种产品，能够实现味精清洁生产，不但提高原料利用率，还能减 少污染，具有重要经济效益和社会效益。 用作饲料酵母：目前，生产饲料酵母的工艺已经很成熟，应用范围也极其的 广泛，这是谷氨酸菌体蛋白最常用的用途【2 4 】。 用作家禽饲料：据报道，亚洲及欧洲少数国家将谷氨酸废液充分利用，来生 产家禽饲料。饲料中含有大量的蛋白质和多种容易被家禽所吸收的氨基酸物质， 牲畜的适1 3 性良好【2 5 j 。 生产酵母膏类似物：谷氨酸发酵液中大约1 的菌体，可提取味道鲜美的、 多功能的调味品酵母抽提物，其中含有多种核苷酸、二十多种有益的氨基酸、 生物素等各种物质，他们之间平衡性比较好【2 6 1 。 提取r n a ：从谷氨酸菌体蛋白中可提取遗传物质r n a ，提取后剩余的残 渣仍然可用作蛋白质饲料2 7 之8 1 。 发酵生产饲料添加剂：以味精发酵液为培养基，乳酸杆菌、光合细菌和酵母 菌等多种有益的菌，经过多代培养、驯化后，就会得到最优发酵菌种，进行发酵 生产饲用微生物制剂；在味精废液中加入玉米渣等原料，再接入经过培养驯化好 的乳酸菌以及酵母菌等菌，进行多菌固体发酵，然后经低温、干燥等工艺就能获 得复合酶益生素；以味精发酵液为培养基，对乳酸杆菌、酵母菌等有益菌株，进 行培养、后驯化接到玉米秸杆上，然后再经过固体发酵、低温、干燥和粉碎等工 艺得到秸杆饲料发酵剂制品【2 9 1 。 1 2r n a 的概况 1 2 1r n a 结构及理化性质 核酸最早发现于1 9 世纪6 0 年代，是瑞士科学家米歇尔首次从外科绷带的脓细 胞的细胞核中鉴定出来的。后来的研究证明，核酸是一种高分子化合物，普遍存 在于生物细胞中，可分为两类，一类是脱氧核糖核酸，另一类是核糖核酸【3 2 1 。 核糖核酸( 缩写为r n a ，即r i b o n u c l e i ca c i d ) ，作为多数生物细胞以及部分的病 毒、类病毒中的遗传信息载体。r n a 作为一类重要的生物大分子之一，在2 0 世 纪5 0 年代左右j 。丌始被人们所研究【3 0 】。 r n a 是具有重要生物学功能的另一种核酸，其含量在原核细胞中约占6 ，在 真核细胞中约占1 1 。r n a - 般是单链的长分子，不构成双螺旋结构，但是很多 r n a 也需要通过碱基配对原则，形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学 功能。r n a 的碱基配对规则基本和d n a 相同，不过除了a u 、g c 配对外，g u 也 第1 章绪 论 可以配对【3 l 】。在细胞中，根据r n a 结构功能的不同，主要分三类，即t r n a ，r r n a ， m r n a 。m r n a 是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的d n a 所转录；t r n a 是 m r n a 上碱基序列( 即遗传密码子) 的识别者和氨基酸的转运者；r r n a 是组成核 糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所【3 。 研究表明，不少r n a ，如i 、i i 型内含子，r n a s ep ，h d v ，核糖体大亚基 r n a 等有催化生化反应过程的活性，即具有酶的活性，这类r n a 被称为核酶 ( r i b o z y m e ) 。2 0 世纪9 0 年代以来，又发现了r n a i 等现象，证明r n a 在基因 表达调控中起到重要作用。 近些年在植物中陆续发现一些比病毒还小得多的浸染性致病因子，叫做类病 毒。类病毒是不含蛋白质的闭环单链r n a 分子。此外，真核细胞中还有两类r n a ， 即不均一核r n a ( h n r n a ) 和小核r n a ( s n r n a ) 。自1 9 6 5 年，酵母丙氨酸t r n a 的碱基序列确定以后，r n a 序列测定方法不断得到改进【3 4 1 。 r n a 纯品为白色粉末，有酸味，溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，具有吸收 紫外光性质。r n a 还是一种两性电解质，含有大量的酸基，因而它的等电点处在 强酸性【3 3 】。 1 2 2r n a 的应用 r n a 是一类生命活动中极其重要的生物大分子，在生命中基因表达和蛋白质 的生物合成起着不可或缺的作用，并且还能促进细胞的诸多生理功能。随着科学 技术以及生命科学的不断发展，人们对r n a 的研究也越来越多，从刚开始的表面 现象已经到了一些极其复杂的分子机理水平上。 r n a 在医药卫生、保健、农业生产、食品加工等行业的应用前景十分广阔。 ( 1 ) 医药行业的应用 免疫r n a 是动物体内一种生物大分子，它具有转移免疫性功能。2 0 世纪6 0 年 代，a l e x a n d e r 3 5 】等人对小白鼠进行免疫实验，研究并证明t r n a 具有免疫功能； 2 0 世纪8 0 年代，肖夫副3 6 】等研究人员把从羊肝中获得的免疫r n a 进行实验，发现 其对肿瘤细胞也具有明显的抑制作用。虽然国内外在临床医学上都已经应用到 r n a 的免疫作用，但是其作用机理仍然不是十分的明了，其活性测定等方面还存 在一定的问题【3 7 1 。 r n a 除直接用于临床医学药物外，还是其它许多药物的前体【3 8 舶1 。近年来， 反义r n a 的研究也引起了人们的广泛关注，大量的研究表明：反义r n a h 匕。够准确 高效地应用于靶细胞，有效的控制癌细胞的复制，应用自订景广泛m l 。 ( 2 ) 卫生保健行业的应用 随着人们年龄的不断增加，合成r n a 的能力也会逐渐随之减弱。因此，人体 内r n a 以及组织结构成分的不足，就会使人产生各种衰老症状，身体容易疲劳， 4 山东轻工业学院硕士学位论文 皮肤松弛，精神容易劳累等等一系列的现象，进而会引起机体免疫力下降，严重 时会造成不可想象的后果【4 1 4 2 1 。 ( 3 ) 食品工业的应用 r n a 在食品行业也有广泛的应用，能够增强人的体质，延长寿命。九十年代 初期，我国北方的一些大城市也开始研究核酸类的食品，成为跨时代的新产品 4 3 - 4 4 o ( 4 ) 环境保护方面的应用 在环境保护方面，r n a 也具有举足轻重的作用。r n a 及其衍生物可以作为抗 菌剂，是一种用来防治植物病毒的农药，这些农药对人体没有危害，对环境也没 有污染。在环境问题同益敏感的今天，该药的开发和利用将会具有重要的社会价 值和环境效益【4 5 1 。 1 2 3r n a 的提取 从酵母细胞中提取r n a 的方法很多，有食盐法、弱碱法、酶法、机械破壁法、 氨法、超声波法、酶法、去污法、表面活性剂法等【蚓。 浓盐法提取改变酵母细胞的渗透压，使细胞自身破裂而释放r n a ；碱法将酵 母细胞壁的d 葡聚糖层溶解到弱碱中，从而破坏了酵母的细胞壁结构，使构成细胞 壁的蛋白质、脂肪及糖的化合物得到水解，从而使r n a 易于提取；苯酚法通过使 i a 能够溶解到苯酚层从而分离出来【删；高压均质法提取r n a ，是通过改变酵母 细胞的渗透压使其膨胀，破坏酵母细胞壁结构而释放r n a ；氨法，提取时间短， 温度低，氨需要量少，对酵母有选择性，并且对人体有较大的刺激性；机械破壁 法提取，所需要的时间也比较短，适用于工业化生产，但是纯度比较低【4 7 】。 盐法和碱法，操作方法简单，且易控制，提取后的废水中不含有毒物质，不 会产生二次污染，可以循环使用或用于生产酵母；产品质量有保证，提取r n a 后 的菌渣经过烘干等工艺后仍然可作为饲料。 1 2 4r n a 的纯化 1 2 4 1 核蛋白的去除方法 蛋白质的沉淀一般常采用以下几种方法：等电点沉淀蛋白法、有机溶剂萃取 法、三氯乙酸沉淀法、硫酸铵沉淀蛋白法以及添加蛋白酶等方法。 1 2 4 2r n a 的纯化方法 超离心法 有两种超离心，一种足根据不一j 的密度分子分佰在不同密度层溶液中的原理， 而建立起来的密度梯度超离心。另一种是根据不同相对分子质量的分子在离心时 有不同的沉降速度，而建立起来的速度超离心。因为d n a 、r n a 、蛋白质的分子 5 第i 章绪 论 量和密度的不同，所以也可以用超离一t l , 将他们彼此分开，或者把不同的r n a 分子 分开，达到纯化专一核酸的目的【4 引。 凝胶电泳 用于纯化核酸的凝胶电泳，主要是琼脂糖凝胶电泳( a g e ) 和聚丙烯酰胺凝 胶电泳( p a g e ) 。一般电泳速度取决于分子量、带电荷数和分子形状三个因素， 但凝胶电泳中，还取决于凝胶的浓度。凝胶电泳可以把不同的核酸分开，甚至可 把碱基顺序相同，而长度之差一个核苷酸的单链核酸片段彼此分开。它的高分辨 力优点，已在分子生物学研究上作出重要贡献【4 9 1 。 柱层析 近年来，二乙胺乙基( d e a e ) 一纤维素离子交换层析，琼脂糖( s e p h a r o s e ) 4 b 分子筛层析，寡聚脱氧胸甘酸一纤维素亲和层析，寡聚尿嘧啶核苷酸一琼脂 糖分子杂交亲和层析等新技术和新方法，均可以用来分离纯化某些特定的d n a 片 段、或者专一性r n a 分子，以供给高科技的实验需用【5 0 1 。 1 2 5r n a 的测定 嘌呤碱和嘧啶碱都具有共轭双键，所以核糖核酸、核苷酸都有吸收2 4 0 2 9 0 n m 紫外光的特性。d n a 和r n a 紫外吸收性质无明显差别，最大的吸收峰都在2 5 8 n m ， 最小吸收峰都在2 3 2 n m 。不同碱基的紫外吸收特性不同，同一种碱基在不同的p h 条件下，不同波长下，紫外吸收值也不同，根据这些特性可对核糖核酸类物质进 行定性和定量测定。 r n a 的相对分子量较小，一般在1 1 0 万，成品一般为白色粉末。r n a 易溶于 水，其钠盐在水中的溶解度可达到4 ，难溶于有机溶剂，所以常用乙醇做沉淀剂， 使其从溶液中析出。 1 2 5 1 定磷法测定r n a 含量 r n a 为含磷化合物，在测定过程中，浓硫酸与r n a 共热使其转变为无机磷， 无机磷与定磷试剂中钼酸在酸性条件中反应生成磷钼酸铵，在还原剂的作用下被 还原成深蓝色的钼蓝，钼蓝在6 5 0 n m 左右有最大吸收峰，且在一定磷浓度范围内， 蓝色的深浅与磷含量成正比【5 l 】。 1 2 5 2 紫外吸收法测定r n a 含量 r n a 具有吸收紫外光的性质，其最大的吸收峰在2 6 0 n m 处。因此，在2 6 0 n m 下， 每毫升含1 微克的r n a 溶液的吸收值为0 0 2 2 。故测定未知浓度的r n a 溶液的2 6 0 n m 下的吸光值，即可计算出其中r n a 含量。 该方法操作起来敏度高，简单易控，对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫 外光物品，测定误差较小【5 2 1 。 6 山东轻工业学院硕士学位论文 1 3r n a 的发展前景 r n a 不仅在基因表达和蛋白质的生物合成中起着不可或缺的作用，而且还能 促进细胞的诸多生理功能。随着社会的发展以及生命科学的快速研究，使得人们 对r n a 的结构与功能的认识越来越清楚。各个方面的研究不断深入，r n a 在医药、 卫生保健品、环境保护以及农业等各个方面都具有十分广泛的应用。因此，研究 r n a 均有重要的现实意义。 1 4 本课题研究目的意义 目前我国共有大小味精厂约2 0 0 家，年产味精1 1 0 万吨。每生产1 吨味精要 生产2 0 多吨高浓度的有机废水，可从中提取干菌体蛋白2 5 0 k g ，过去均随同废液 排于江河，使水体发臭变黑，严重破坏了水域的生态环境，造成公害。如果全国 的味精厂充分的回收菌体，每年就可生产2 2 万吨左右饲料，可以为我国开辟新的 蛋白质资源，在一定程度缓解我国蛋白资源缺乏的状况。并且废液经提取菌体后， 其中悬浮