实验一 考马斯亮蓝G250染色法测定蛋白质含量.ppt

考马斯亮蓝g 250染色法测定蛋白质含量 环境学院汪松美 实验类型 基础验证型 实验目的掌握和学习考马斯亮蓝g 250染色法测定蛋白质含量的基本方法 一原理 考马斯亮蓝g 250染料 酸性溶液中 与蛋白质疏水区结合 青蓝色 595nm 在一定蛋白质浓度范围内 1 1000ug 蛋白质和色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质浓度成正比 故可用于蛋白质的定量测定 简便快捷 灵敏度高 稳定性好 二试剂 材料与设备2 1主要试剂1标准蛋白质溶液的配制 牛血清白蛋白 bsa 10mg 定溶于100ml0 9 nacl溶液 100 g ml的标准蛋白质溶液 2考马斯亮蓝g 250试剂的配制 考马斯亮蓝g 250 溶于50ml 加100ml 蒸馏水定容至1l 100mg 95 乙醇 85 的磷酸 3样品液的准备 牛血清白蛋白标准溶液 0 1mg ml 稀释至一定浓度的样品液 用0 9 nacl溶液 2 3主要仪器 722分光光度计 漩涡混合器 移液器 移液管 烧杯 吸耳球 擦镜纸 试管 三实验方法3 1标准曲线的绘制取6支试管按下表操作 摇匀 2 5min后在595nm下比色 1号管为对照管 作吸光度 蛋白浓度曲线 3 2样液的测定 干净试管 1ml样品液 595nm 读取吸光度 反查标准曲线 四注意事项 移液管的正确使用 分光光度计的正确使用 移液枪的正确使用 五思考 1 考马斯亮蓝g 250法测定蛋白质含量的原理是什么 2 测定蛋白质含量还有哪些方法 测定原理有哪些不同 量程的调节枪头 吸液嘴 的装配移液的方法移液器的正确放置维护保养时的注意事项 移液枪的使用方法 移液枪的结构 吊钩 手柄 枪杆 移液控制及调节旋纽 吸 枪头推出器 数字显示器 1 量程的调节 看清量程再调节 左手握枪柄 右手顺时针 调小 或逆时针 调大 旋动 千万不要将按钮旋出量程 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪 2 枪头 吸液嘴 的装配 将移液枪 器 垂直插入枪头中 稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合 切忌使劲地在枪头盒子上敲几下 退出枪头时 只需按一下枪头推出器即可 3 移液的方法 注意 吸取液体时 移液器保持竖直状态 将枪头插入液面下2 3毫米 切勿将整个枪头浸于液体中 在吸液之前 可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴 尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时 前进移液法 常用 1 按钮按下至第一停点 a b 2 慢慢松开按钮回原点 a 3 按钮按至第一停点 b 排出液体 稍停片刻 4 按按钮至第二停点 c 吹出残余的液体 松开按钮 前进移液法示意图 2 反向移液法 一般用于转移高粘液体 生物活性液体 易起泡液体或极微量的液体 原理就是先吸入多于设置量程的液体 转移液体的时候不用吹出残余的液体 1 按下按钮至第二停点 c 2 慢慢松开按钮至原点 a 3 按钮按至第一停点 b 排出设置好量程的液体 4 保持按住按钮位于第一停点 千万别再往下按 打出即为所需液体 取下有残留液体的枪头 弃之 4 移液器的正确放置 使用完毕 可以将其竖直挂在移液枪架上 但要小心别掉下来 当移液器枪头里有液体时 切勿将移液器水平放置或倒置 以免液体倒流腐蚀活塞弹簧 5 维护保养时的注意事项 如不使用 要把移液枪的量程调至最大值的刻度 使弹簧处于松弛状态以保护弹簧 最好定期清洗移液枪 可以用肥皂水或60 的异丙醇 再用蒸馏水清洗 自然晾干 高温消毒之前 要确保移液器能适应高温 722型分光光度计的使用及注意事项 1 插上插头 接通电源 打开暗箱盖 预热20min 先在暗箱盖开启状态下调节零点调节器 使读数盘指针指向t 0处 然后盖上暗箱盖 调节 100 调节器 使空白管的t 100 注意 分光光度计在接通电源而不用时 必须打开暗箱盖 以免光电管老化 暗箱 2 将选择选扭由 t 调至 a 此时读数应由 100 至 0 若不为 0 可