（高分子化学与物理专业论文）碳酸乙烯撑酯类新型聚合物载体固定化研究.pdf

南开大学硕士论文ab s t r a c t ab s t r a c t f u n c t i o n a l c y c l i c c a r b o n a t e g r o u p s c a n r e a c t e a s i l y w i t h a m i n o g r o u p s u n d e r m i l d c o n d i t i o n s w i t h o u t a c t i v a t i o n . e x c e p t t h a t , c y c l i c c a r b o n a t e g r o u p s a r e s t e a d y i n p h n e u t r a l w a t e r s o l u t i o n s o r i n t h e a ir . t h u s p o l y m e r s u s e d a s s u p p o rt s w i t hg r o u p s f o r e n z y m e s . w i t h t h e c y c l i c g r o u p s c a n b e mo r e o v e r t h e i mmo b i l i z a t i o n f o r e n z y m e s i s v e ry e a s y a n d c o n v e n i e n t w h e n u s e t h i s k i n d o f s u p p o r t s b e c a u s e p v c a i s v e r y h y d r o p h o b i c a n d i t w i l l m a k e e n z y m e s i m m o b i l i z e d o n t o s u p p o rt s t o b e i n a c t i v a t e d o r d e n a t u r e d . a c t u a l l y , v i n y l e n e c a r b o n a t e ( v c a ) i t s e l f i s n o t s u i t a b l e a s s u p p o r ts f o r e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n a n d t h e r e f o r e a tt e m p t s w e r e m a d e t o i n c r e a s e t h e h y d r o p h i l i c it y c o p o l y m e r i z a t i o n o f v c a w i t h w a t e r - s o l u b l e m o n o m e r s w i l l h a v e g o o d e ff e c t s o n t h e h y d r o p h i l i c i t y . i n t h i s a rt i c l e , w e c h o o s e 2 - h y d r o x y e t h y l m e t h a c ry l a t e ( h e m a ) a n d 3 - h y d r o x y p r o p y l a c ry l a t e ( h p a ) a s t h e c o m o n o m e r s t o b e c o p o l y m e r i z e d w i t h v c a i n p a r a ff i n o i l b y t h e m e a n s o f a n t i - p h a s e e m u l s i o n p o l y m e r i z a t i o n a n d t w o k i n d s o f s u p p o r t s w i t h d i ff e r e n t s t r u c t u r e s w e r e p r e p a re d . k i n e t i c s o f t h e c o p o ly m e r s a m i n o l y s i s i n d m f s o l u t i o n b y b a , e a a n d d e a d o e s n t a g r e e w i t h t h e m o d e l c o m p o u n d - e c , t h e r a t e o f t h e c o p o l y m e r s a m i n o ly s i s d u r i n g t h e i n i t i a l s t a g e is c o n s i d e r a b l y h i g h , t h e n t h e r a t e t u r n s d o w n r a p i d l y a ft e r t h e c o n v e r s a t io n r e a c h e d s o m e d e g re e . t h e n t h e s e r e a c t i v e , m i c r o s p h e r i c b e a d s w e r e u s e d a s m a t r i x f o r i m m o b i l i z a t i o n o f a m y l o g l u c o s i d a s e a n d e x h ib i t e d g o o d p r o p e r t i e s . ke y w o r d s : s u p p o r t , i m m o b i l i z e dv i n y l e n e c a r b o n a t e , a m i n o l y s i s , 2 - h y d r o x y e t h y l m e t h a c ry l a t e , 3 - h y d r o x y p r o p y l a c r y l a t e , a m y l o g l u c o s i d a s e 南开大学硕士论文 前言 一前 言 酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化功能的且活性可调节的一类蛋白 质。生物体内的新陈代谢，其大部分的化学变化都是在酶的参与下进行的。酶 蛋白结构 ( 包括一级、二级、三级及四级结构)决定了酶作为一种天然的高分 子催化剂，具有:催化效率高;专一性强;反应条件温和;反应易于控制等优 点1 然而，酶的这些良 好性能只适于在生物体内进行催化反应，作为一般催化 剂应用于工业等领域，远远不够理想。影响酶应用的最重要因素是: ( 1 )酶是 由蛋白质组成的，一般情况下对热、强酸、强碱、有机溶剂等物质不稳定，即 使在最适于酶反应的条件下，也会很快失活，随着时间的延长，反应速度便逐 渐下降; 1 )，同样，随着致孔剂含量的增加，载体溶胀性均有所提高。 5 .2 . 1 . 2共菜成体与洛 液醉的 偶 联反 应 图 i 中 ( 1 )、 ( 2 )分别为v c a - h e ma共聚载体和v c a - h p a - h e ma共 聚载体与酶分子偶联后的红外谱图。与未经偶联的载体的红外谱图相比， 1 8 1 1 . 1 4 c m - ， 处标志着环碳酸醋基上c = 0的特征峰几乎完全消失， 证明聚合物上 的 环碳酸酷基发生了开环反应，并以 共价键的形式与酶分子进行偶联。此外， 对固定化酶载体进行多次洗涤和重复使用 5次后，进行元素分析 ( 见表 3 )， 发现载体上含有 n元素。由于多次洗涤和重复使用，以物理吸附的形式残存在 南开大学硕士论文五碳酸乙 烯撑酌类聚合物的性能测试 载体上的酶分子几乎脱落，只有以共价键形式结合在载体上的酶分子才能保留 下来，故元素分析中的 n元素含量可近似地认为是共价结合在载体上的酶分子 中n元素的含量。 表3 固定化酶后载体的元素分析 c( %)n( %)h( %) 固定化酶后的载体5 0 . 8 7 0 . 8 36 . 0 5 淆矛又学 吸附 分离 功能高 分子 材料国 家 重点实 验室 电话: ( 02 ) 2 3 5 0 6 1 7 5传离: ( 0 2 2 ) 2 3 5 0 2 7 4 9 e m e il : w r p s u n .n e n k n i . e d u .c n 丫 b07060印4030 3 5 0 0 3 0 0 0 _l _ _ 2 5 0 0 w a v e n u mb e r2 0 0 q 吸 c m- 3 ) 1 5 0 0 1 0 0 0 图1 ( 1 ) v c a - h e m a共聚载体固定化酶后的红外谱图 南开大学硕士论文 五碳酸乙 烯撑酷类聚合物的性能测试 一 曰滩耽。 。、. 50:40)一刻 落 犷黔外1。 3 5 0 03 0 0 02 5 0 0 2 0 0 0 wa v e n u m b e r ( c m - 1 ) 1 5 0 0 1 0 0 0 图1 ( 2 ) v c a - h p a - h e m a共聚 载体固 定化 酶后的 红外谱图 5 .2 . 1 .3单体配比 及交联度对共染载体偶联反应及固定化醉活力的 形响 以 v c a - h e m a类聚合物为例，本文研究了单体配比和交联度对共聚载体 偶联反应及固定化酶活力的影响。由表 4可以看出，当载体的交联度、致孔剂 含量等相关条件一致时，固定化酶的偶联效率和活力回收随单体配比的变化而 变化。当v c a i h e ma为4 l 3 时， 偶联效率和活力回收均达到最大值。 产生这种 现象的原因是由于随着碳酸乙烯撑酷单体结构单元数的减少，亲水性共聚单体 的含量增加，共聚载体的亲水性也随之增加。由载体的溶胀性能表也可发现， 载体的溶胀性随碳酸乙烯撑醋单体含量的增加而呈下降趋势。由于酶的固定化 是在水溶液中进行的，亲水性好的载体在水中可充分溶胀，其分子链比较松散， 孔结构也比较疏松， 不仅有利于酶与载体上活性基团的偶联，在酶促反应过程 中，同样也有利于大分子的淀粉底物向载体内部的扩散，故而表现为偶联效率 南开大学硕士论文 五碳酸乙 烯律酷类聚合物的性能测试 和活力回收均较高。另一方面，当v c a结构单元的含量过低时， 载体上能与酶 发生偶联反应的活性基团一 环碳酸酷基数目 减少，故偶联效率和活力回收也随 之减小。由此可见， 选择单体配比适中的载体进行固定化，中和亲水溶胀性和 活性基团数目 两方面的影响，可获得最佳效果。 表4 不同v c a / h e ma配比对偶联反应及固定化酶活力的影响 v c a / h e m a 偶联效率( % ) 活力回收( % ) 相对活力( % )生成葡萄糖量 ( m o l / m o l )( m g / g b e a d ) 2 / 1 2 5 . 2 0 5 . 1 5 2 0 . 4 4 6 . 0 1 2 5 . 8 1 3 4 . 8 4 6 . 3 39 . 6 4 勺汽 了了甘. 内j通岭 2 / 32 0 . 0 0 6 . 6 1 6 . 1 9 2 4 . 5 3 1 8 . 9 7 3 0 . 9 5 1 0 . 5 1 9 21 固 定 化条 件: 干 燥的v c a - h e m a 载 体0 .0 3 0 0 g , 偶联 用 酶 溶 液 活力1 6 u / m l , p h 值5 .4 0 , 偶联反 应2 4 h r ; 反 应条件: 淀 粉底物浓度4 % ( v n) , p h值4 .6 0 ， 水 浴4 0 反 应3 0 m i n , 表5交联剂含量对偶联反应及固定化酶活力的影响 vca / he ma ( mo l / mo l ) 交联剂 含量 ( %) 偶联效率 ( %) 活力回收 ( %) 相对活力 ( %) 生成葡萄糖 量 ( m g / g b e a d ) 8 . 4 2 8 21 1 9 . 2 0 1 8 . 7 2 1 4 . 5 4 1 6 . 0 9 1 5 . 4 4 5 . 3 06 . 4 4 61016 /2/2/2 凡j斑j丙 固定 化条件: 千 燥的v c a - h e m a载体0 .0 3 0 0 g ， 偶联用酶溶 液活力1 6 u / m l , p h值5 .4 0 , 偶联 反应3 6 h r ;反 应条 件: 淀粉底物 浓度6 % ( v / v ) , p h值5 . 8 0 。 水 浴5 5 反 应3 0 m in . 表 5为不同交联度对酶偶联反应及固定化酶活力的影响。可以看出，交联 度为 6 %和 1 0 % 的共聚载体的偶联效率、活力回收相差不大; 但当交联度增 加至1 6 % 时，偶联效率和活力回收则明显下降。总体来说， 酶分子的偶联效率 南开大学硕士论文五碳酸乙烯律酷类聚合物的性能测试 与固定化酶的催化效果随载体交联度的升高而降低。这一现象与交联度升高导 致共聚载体溶胀性下降的结果相吻合。载体的溶胀性下降，使得溶液酶分子不 易与载体上的活性基团进行偶联，故而使偶联效率和活力回收有所下降。 5 .2 . 1 .4不同 固 定 化时间 对偶 联反 应 及固 定 化醉活力的 形响 表6不同固定化时间对 v c a - h p a - h e ma共聚载体偶联反应及固定化酶活力的 影响 固定化时间偶联效率活力回收相对活力生成葡萄糖量 ( h r )( %)( %)( %)( m g / g b e a d s ) 2 0 2 1 . 2 9 . 6 7 4 5 . 6 1 1 9 . 9 4 1 0 . 1 0 1 0 . 1 0 4 3 . 3 5 2 4 . 1 1 2 1 . 2 6 2 1 . 2 6 内jee ，4 月峥nu 内乙气 3 6 5 8 . 9 6 . 1 2 1 0 . 3 9 9 . 0 0 固定 化条件: 干 燥的v c a - h p 人 一 h e m a ( 2 / 1 / 1 ) 载体0 .0 3 0 0 g ， 偶联 用酶溶 液活力2 4 u / m l , p h 值5 .4 0 : 反应条 件:淀 粉底物浓度6 % ( v / v ) , p h值5 .8 0 ， 水浴5 0 反 应4 5 m in . 表6 为不同固定 化时间 对v c a - h p a - h e m a类共聚载体的 偶联反应及固定 化酶活力的影响。如表所示，随着固定化时间的延长，酶偶联效率逐渐增加， 而固定化酶的活力回收却在达到最大值 ( 1 0 . 1 0%) 后有所下降。这主要是因为 延 长固 定 化时间 有 利于酶分 子与 载体 充分 接 触， 从 而与 载体 上的 活性 基团 发 生 共价偶联， 而当载体偶联的酶量逐渐增大时， 载体网 络上酶分子之间较为拥挤， 在酶促反应过程中，不易与大分子淀粉底物充分接触，故而使得酶整体的活力 回收有所下降。 5 .2 . 1 .5 p h 值 对俩 联 反 应 及固 定 化醉 活 力的 影 响 p h 值 对两 类 共 聚 载体 偶 联 反 应及固 定 化 酶活 力的 影响 见 表7 和表8 。 可以 看出，不同p h值下酶与载体的偶联效率及固定化酶的活力回收有所不同。 对 于v c a - h e m a类共聚载体， 在p h值5 .3 8 处的固定化效果最好; 而对于v c a - 南开大学硕士论文 五碳酸乙 烯撑酩类聚合物的性能测试 h p a - h e m a类共聚 载 体 来说， p h值的 变 化 对固 定 化 酶活 力回 收的 影 响 不 如前 一类载体明显， 在p h值5 . 8 0 处的固定化效果最好。并且，由 表8 还可发现， 在 p h较低的 情况下， 酶的 偶联效率也较低， 这可能是由 于 葡萄糖淀粉酶的等 电点在4 .04 . 5 之间， 在p h值较低的 情况下， 酶分子上的一h 2 基团主要以 胺离 子 一 n h 3 + 的 形 式 存 在， 使 其 不 易 与 共 聚 载 体 上的 环 碳 酸 酷 基 进 行 亲 核 取 代 反 应。 另一方面， p h值偏高或偏低都会破坏酶分子中的高次结构而使部分酶分子失 活，即 使偶联效率 较高 ， 活力回收 也较低; 同时p h值偏高或偏低还会增加 环碳 酸酷基和偶联反应生成的氨基甲酸酷结构水解的可能性。由此可见，当溶液的 p h值略高 于 葡萄 糖淀 粉酶的 等电 点 时， 酶 分子 上的 一 n h : 基团能 更有 效 地与 载 体进行偶联;同时，由于我们使用的载体为中性载体，当葡萄糖淀粉酶不带电 荷或少带电荷时更有利于酶与载体之间亲水与亲水、疏水与疏水之间的相互吸 引，进而增加了酶分子与载体上活性基团发生共价偶联的几率。所以，只有选 择较为适中的p h值进行酶的固定化， 才能得到较好的催化效果。 表7 p h值对v c a - h e m a类共聚载体偶联反 应及固 定化酶活力的 影响 p h值偶联效率( % ) 活力回收( % ) 相对活力( %)生成葡萄糖量 ( m g / g b e a d s ) 3 . 7 8- - 一4 石1 1 1 . 1 4 4 . 3 4 4. 1 9 5 . 3 8 4 . 4 0 6 . 1 3 1 1 . 6 4 1 4 . 6 3 1 3 . 8 5 1 0 . 4 0 3 . 7 0 9 . 0 3 /，.l 内j4 5 . 7 8 6 . 2 6 2 7 . 0 4 4 . 6 3 . 7 4 4 . 6 4 1 . 6 6 4 . 4 4 固定 化条件:千 燥的v c a - h e m a ( 3 / 2 ) 载体。 .0 3 0 0 g ， 偶联用酶溶液活力1 6 u / m l , 偶联 反 应4 8 h r ; 反 应条科 : : 淀粉底物浓度4 % ( v / v ) , p h值4 .6 0 ， 水 浴4 0 -c 反 应3 0 m i n e 南开大学硕士论文 五 碳酸乙烯律醋类聚合物的性能测试 表8 p h 值对v c a - h p a - h e m a 类 共 聚 载体 偶联 反 应及固 定 化 酶活 力的 影响 p h 值偶 联效 率 ( % ) 活 力回 收 ( % ) 相 对活 力 ( % ) 生 成葡 萄 糖量 ( m g / g b e a d s ) 4 . 2 01 9 . 5 4 . 6 0 4 . 9 9 2 4 . 8 3 7 3 8 . 0 0 8 21 4 1 . 0 3 3 3 . 1 0 1 4 . 7 9 1 5 . 4 4 8 . 5 6 5 . 4 08 . 5 6 5 . 6 0 5 . 8 0 6 . 0 0 3 0 . 9 3 3 . 7 1 4.4 8 . 9 8 9 . 8 1 9 . 2 0 2 2 . 9 5 4 6 . 0 2 2 9 . 0 6 4 1 . 3 9 6 3 . 8 9 1 6 . 5 2 1 6 . 5 2 1 7 名1 2 0 . 3 7 1 8 . 4 9 固 定 化条 件: 干 燥的v c a - h p a - h e m a ( 2 / 1 / 1 ) 载 体。 .0 3 0 0 g ， 偶 联 用酶 溶 液 活力2 4 u / m l . 偶联反应2 4 h r :反应条件:淀粉底物浓度6 % ( v n) , u h值5 . 8 0 ，水浴 5 0 反应4 5 m i n . 5 . 2 . 1 . 6不同 醉活力对侧联反 应及固定 化醉活力的 形响 不同酶活力对偶联反应及固定化酶活力的影响如表 9 , 1 0所示。随着偶联 用酶活力的提高，偶联效率和活力回收均逐渐增加， 这是由于当溶液酶活力在 较 低 水平 上 逐 渐增 大时， 酶分 子 上的 一 n h , 基团 浓 度增 大， 可更 大 程 度 地与 载 体 上的活性基团发生偶联反应，生成更多的固定化酶，偶联效率和活力回收既随 之增加;当 溶液酶活力继续增大时，活力回收在达到某一最大值后呈下降趋势， 两类共聚载体的最佳偶联用酶活力均为3 2 u l m l 。产生这一现象的原因可能是由 于初始阶段当酶偶联效率增加时，活力回收也随之增大，当载体上结合的酶量 达到一定程度后，即使共聚载体上还能够偶联上更多的酶分子，但由于载体网 络上酶分子之间较为拥挤，一部分酶分子可能包埋另一部分酶分子而在某种程 度上使得酶分子自 身的构象可塑性减小，从而使得酶整体不能充分发挥其催化 功能。同时，由于酶促反应过程中存在着底物分子由 载体表面向载体内 部以 及 产物由载体内部向溶液的扩散过程，随着酶偶联效率的提高，在酶促反应过程 中，淀粉底物大分子受到的屏蔽作用增大，不易进入多孔载体的孔中与固定化 酶发生反应，故而使得固定化酶的活力回收有所下降。 南开大学硕士论文 五碳酸乙烯撑酩类聚合物的性能测试 表9 不同酶活力对v c a - h e ma类共聚载体偶联反应的影响 偶联用酶活力偶联效率( % )活力回收( % )相对活力( % ) 生成葡萄糖量 ( u / m l ) ( m g / g b e a d s ) 1 6 1 8 力5 . 0 1 2 7 . 8 3 5 . 5 8 2 0 . 05 石42 8 . 2 07 . 5 2 9 . 6 4 1 9 . 9 4 2 0 . 9 6 凡j.11u 0沙60 件一、1 内j月叶八， 1 8 . . 6 2 1 . 2 6 . 3 3 3 2 2 9 . 6 7 1 0 . 0 0 卜日月兮0八，乙 ，22八 4 0 5 1 . 3 7 . 1 0 1 3 . 8 4 1 2 . 0 2 固 定 化 条 件: 干 燥的v c a - h e m a ( 3 / 2 ) 载体0 .0 3 0 0 g ， 偶 联 用 酶 溶 液p h 值5 .4 0 ， 偶 联反 应2 4 h r ; 反 应条件: 淀粉底 物浓度6 % ( v n) , p h 值5 .8 0 ， 水浴5 5 反 应3 0 m in e 表 1 0不同酶活力对v c a - h p a - h e ma类共聚载体偶联反应的影响 偶联用酶活力偶联效率( % ) 活力回收( % ) 相对活力( % ) 生成葡萄糖量 ( u / m l ) ( m g / g b e a d s ) 1 6 3 0 . 1 1 2 74 2 . 1 9 2 9 . 2 8 2 0 2 5 . 8 1 5 .4 2 4 2 2 . 9 1 2 3 2 8 1 9 . 5 1 3 . 7 3 2 2 5 . 4 2 0 . 8 4 0 4 4 . 1 1 1 . 3 5 9 . 6 9 5 3 . 7 1 7 0 . 2 6 8 1 . 8 9 2 5 . 6 2 3 7 . 6 0 2 8 . 0 5 3 2 . 3 6 5 4 . 2 5 2 4 . 9 6 固 定 化条 件: 干 燥的v c a - h p a - h e m a ( 2 / 1 / 1 ) 载体0 .0 3 0 0 g , 偶 联 用 酶 溶 液p h 值5 .4 0 , 偶联反应2 4 h r :反应条件: 淀粉底物浓度6 % ( v n) , v h值5 . 8 0 ，水浴5 0 反应4 5 m i n 5 .2 . 1 .6不同 致孔剂对固定 化醉活力的 影响 不同致孔剂对固定于多孔聚合物载体上的葡萄糖淀粉酶活力的影响见表 1 1 和表 1 2 。 表 1 1 为不同致孔剂对 v c a - h e m a共聚载体固定化酶活力的影响。 从中可以看出，在本文所选的三种致孔剂中，以丙三醇的效果最好，且随着丙 南开大学硕士论文五碳酸乙烯抹酣类聚合物的性能测试 三醇含量的增加，活力回收增加。这种固定化酶活力的差别可能与不同致孔剂 所造成的载体不同孔结构有关。由第二章合成部分中的扫描电镜照片可以看出， 以丙三醇为致孔剂时，载体的孔结构相对比较均匀，比表面积较大，载体上可 供酶偶联的活性基团相对较多。同时，由载体的溶胀性也可发现，以丙三醇为 致孔剂的载体的溶胀性最好，载体经溶胀后孔结构比较疏松，这些均利于酶分 子在载体上的固定化。另一方面，孔结构均匀，平均孔径、比表面积适中的多 孔型载体在酶促反应中对大分子底物所产生的内扩散阻力和空间屏障较小，使 得淀粉在到达载体表面后更易向载体内部扩散，与固定化酶发生酶促反应。 如表 1 2所示，不同的致孔剂种类和含量对 v c a - h p a - h e ma类共聚载体 固定化酶活力也有一定影响。当致孔剂含量增大时，固定化酶活力回收均有所 升高。 对于这一类载体来说， 在本文所选的三种致孔剂中，以三甲 醇丙烷为致 孔剂的固定化酶的催化效果最佳。 不同 致孔剂对v c a - h e m a共聚载体固定化酶活力的影响 诬.bead) (mrt 表 1 1 vca/ he ma致孔剂 ( %) ( mo l / mo l ) 交联度 ( % ) 活力回收 ( % ) 无水乙醇 ( 1 0 0 %) 乙二醇 ( 1 0 0 %) 丙三醇 ( 1 7 %) 丙三醇 ( 3 5 %) 丙三醇 ( 8 7 %) 6 . 3 3 9 . 8 1 7 . 9 3 9 . 0 5 9 . 6 4 2 0 . 3 7 1 4 . 5 8 1 8 . 0 3 2 6 . 6 0 尹0尹nuu /2/2/2/2 j内、气j气j 3 / 21 1 . 8 3 反应条 件: 干 燥的 载体小 球0 .0 3 0 0 g 淀粉底 物浓度4 %( v / v ) p h值4 .6 0 ， 水浴4 0 反 应3 0 m i n . 南开大学硕士论文五碳酸乙 烯撑酩类聚合物的性能测试 表 1 2 不同致孔剂对v c a - h p a - h e m a共聚载体固定化酶活力的影响 vca/ m/ he ma ( mo l / mo l / mo ll 交联度 ( %) 致孔剂 ( %)活力回收 ( % ) 3 八八 3 / 1 / 1 3 / 1 / 1 3 / 1 / 1 3 / 1 / 1 3 / l / l 乙二醇 ( 5 0 %) 乙二醇 ( 1 0 0 %) 丙三醇 ( 9 0 %) 三甲醇丙烷 ( 1 6 %) 三甲醇丙烷 ( 5 0 %) 三甲醇丙烷 ( 7 0 %) 5 . 9 8 1 0 . 7 9 6 . 8 8 1 1 . 6 2 1 3 . 1 5 1 2 . 2 3 生成葡萄糖量 ( m g / g b e a d ) 8 . 5 7 2 3 . 3 9 1 1 . 3 4 2 5 . 9 5 3 0 . 6 7 2 7 . 8 3 反 应条 件: 干燥的 载体小 球0 .0 3 0 0 g . 淀粉底物浓 度6 %( v n) , p h值5 .8 0 ， 水浴5 0 反 应 4 5 m i n . 本章重点讨论了不同单体配比、不同交联度、不同 致孔剂以及不同固定化 条件对酶偶联反应及固定化酶活力的影响。在此基础上，兼顾多方面因素，选 择一种单体配比、物理状态以及结构比较均一的共聚载体在最适固定化条件下 进行溶液酶的偶 联反 应， 并 通过改 变不同 的 酶促反 应条件 ( p h值、 温度、 反 应 时间、底物浓度等)对固定化酶的各方面性能进行了讨论。 5 .2 . 1 . 7固定化箱萄粉淀粉醉与洛液翎蔺箱淀粉醉的性能比 较 ( 一) 反 应p h值对醉活力的 影响 溶液葡萄糖淀粉酶和固定 化葡萄糖淀粉酶的 相 对活 性与 p h值 之间的关系 如图2所示。 由图 可知， 溶液酶和固定 化酶的 活性均受到 介质p h值的 影响， 且固定化酶对p h值的变化更为敏感。一般认为，介质的p h值会影响酶蛋白 分 子的 三次结 构 “ ，当p h值过高 或过 低 ( 强酸 或强 碱) 时， 构成酶蛋白 高次结 构的疏水键、氢键和离子键将被破坏，酶分子的活性中心也随之受到影响，甚 至 使酶失 活， 故而选择适宜的反 应 p h值对提高固定化酶活力相当 重要。 如图 所示， 溶液葡萄 糖淀粉酶的 最适p h值与文 献 s 卜 幻 1基本相 符， 在4 - 5 之间: 而 固定 化葡萄糖淀 粉酶的 最适p h 值有所偏离，以v c a - h e m a共聚物为 载体的固 南开大学硕士论文五 碳酸乙 烯撑酣类聚合物的性能测试 定 化酶的 最适p h值为5 .7 8 : 而以v c a - h p a - h e m a共聚物为载体的固 定 化酶 的 最 适p h值为5 .6 0 。 这 可能 是因 为 酶经固 定 化 后， 由 于 它自 身 与 环 碳酸 醋 基 发生了共价偶联反应，消耗了一部分氨基，使得酶分子在溶液中的解离平衡向 生成氨基的方向移动，造成酶蛋白分子的带电性有所变化，从而导致固定化酶 周围的 微环境也随之改变，故酶促反应的最适p h值与溶液酶相比 有所偏离。 / / 。 、 。 一。 ， ， 一 梢 100090 ， 工、 0 8 0- 4 o ._一 / 岁者aj七v少一苟10匡 二 已 0 已 5 5 0 丘h p 5 欢 0 峨 5 3 图2溶液p h值对酶活力的影响 o 溶液酶;. v c a - h e m a共聚物为载体的固定化酶 ， v c a - h p a - h e m a共聚物为载体的固定化酶; 南开大学硕士论文五碳酸乙烯挣酣类聚合物的性能测试 ( 二) 反应温度对醉活力的 影响 10009080 八u000 761匕4 承者一一乞v，一州.1。叱 内目八曰 3内l 3 0 4 0 5 0 6 0 t e m p e r a t u r e ( c) 图3反应温度对酶活力的影响 o 溶 液酶;. v c a - h e m a共 聚物为 载体的固定化酶; t v c a - h p a - h e m a共聚物为载体的固定化酶; 溶液葡萄糖淀粉酶和固定化葡萄糖淀粉酶的相对活性随反应温度的变化如 图3 所示。由图可知， 溶液酶的最适反应温度为5 0 c ， 对于以v c a - h e m a共 聚物为载体的固定化酶来说， 其最适反应温度较溶液酶偏高，为 5 5 0c 。当 温度 较低时 ( 11门1。匕 - 2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 d a y s 图7溶液酶与固定化酶的储存稳定性 o 溶液酶;. v c a - h e m a共聚 物为载体的固 定化酶; ， v c a - h p a - h e m a共聚物为载体的固定化酶; 南开大学硕士 论文 五碳酸乙 烯撑酷类聚合物的性能测试 5 . 2 .2碳酸乙 烯摊醋均聚物的性能 为了进行对比，本文考察了碳酸乙烯撑酷均聚物作为固定化酶载体的性 能。图8为反应p h值对固定化酶活力的影响。由图 可知， 酶促反应的最适p h 值为 5 . 8 0 ， 与以 碳酸乙 烯撑酪共聚 物为 载体的 固定化酶最适 p h值相近， 这可 能也是由于酶经固定化后，由于发生化学反应，造成酶蛋白 分子的高次结构有 所变化，故带电性也随之改变，导致反应的 最适p h值与溶液酶有所偏离。图9 为反应温度对固定化酶活力的影响。当体系温度为 5 5 时，固定化酶活力最 大。可见，葡萄糖淀粉酶经固定化后，其稳定性有所提高。底物对固定化酶活 力的影响见图 1 0所示。同样由于底物大分子的扩散受到阻碍，使得酶促反应 最适底 物浓度较溶液酶偏高， 为6 % ( v n) 。同 时， 本文 还对固 定 化酶的 储存稳 定性进行了测定， 发现固定化酶在储存2 1 天后， 活性仍保持7 8 .5 . 实验表明， 以碳酸乙烯撑醋类均聚物为载体的固定化葡萄糖淀粉酶，其性能与以碳酸乙烯 撑0 3 类共聚物为载体的固定化酶相似，但前者的活力回收却较后者偏大。图8中 相对活性1 0 0 % 处固定化酶的活力回收为2 1 .7 1， 图9 1 1 0 中相对活性1 0 0 处固定化酶的活力回收也较大，均为 1 8 . 1%。这可能是由 于与共聚物相比，均 聚物上可供偶联的环碳酸酷基更多，可固定上较多的酶分子进行催化反应。同 时，还由于以均聚物为载体的固定化酶是以粉末状的形式与底物溶液进行催化 反应，增加了 底物分子与固定化酶的接触面积， 在酶促反应中， 淀粉分子几乎 只受到宏观体系的外扩散阻滞，而在载体内部的内扩散阻力相对较小，故而活 力回收有所升.高。但另一方面，正因为均聚物载体一般均为粉末状，在操作过 程中， 存在着许多不便之处，同时也会给实验结果带来一定的误差。在工业生 产中，由于其缺乏一定的机械强度，更不利于装柱进行连续化操作。由此可见， 选择适宜的亲水性共聚单体，合成出化学、物理性能均好的固定化酶载体，对 于工业上的大规模生产较为有利。 南开大学硕士论文五 碳酸乙 烯撑酌类聚合物的性能测试 100a的80706050403020 承者侣v。口忆1。比 3 . 5 4 . 04 . 5 5 . 0 5 . 5 6 . 0 6 . 5 p k o 溶液酶;. p v c a均聚物为载体的固定 化酶 图 6 p h值对酶活 力的 影响 110100 9080706a50403020100 岁必一之七哎。一苟一。匡 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 7 5 t e m p e r a t u r e ( c) o 溶液酶; . 图 7 p v c a均聚物为载体的固定化酶 温度对酶活力的影响 5 8 南开大学硕士论文 五碳酸乙烯撑酩类聚合物的性能测试 厂|书厂| 10009080功605d4030 岁者一一1超。j妇el。比 2 0 -f-0 .0 00 . 0 2 0 . 0 4 0 .0 6 0 .0 8 0 . 1 0 c o n c e n t r a t io n o f s u b s t r a t e ( %v n) o溶液酶: .p v c a均聚 物为载体的固 定化酶 图8 底物浓度对酶活力的 影响 南开大学硕士论文 六结论 六总 结 本文选择两种亲水性共聚单体:甲基丙烯酸- s4 1 乙醋和丙烯酸轻丙酷与 碳酸乙 烯撑醋进行反相悬浮聚合，合成出一系列珠状共聚载体。对载体的胺解 行为进行了测定，并对其作为固定化葡萄糖淀粉酶载体的性能进行了研究，得 到以下结论: i .通过对碳酸乙烯撑酷与亲水性共聚单体的反相悬浮聚合的研究表明， 选择适宜的悬浮介质、引发剂、分散剂、交联剂及致孔剂是聚合反应得以 进行 的前提:控制一定的搅拌速度和升温速度是获得优质小球的关键所在。通过对 聚合产物的红外分析表明，聚合物上含有反应性环碳酸酩基和亲水性基团。与 此同时，对凝胶型和大孔型载体分别进行了扫描电镜和孔结构测试，结果表明， 对v c a - h e m a类共聚载体来说，以丙三醇为致孔剂时， 孔结构较为均一。 2 .碳酸乙烯撑酣类聚合物与丁胺、乙醇胺及二乙醇胺的胺解反应不符合 其小分子模型化合物碳酸乙撑酩相类似的反应动力学。表现为反应初期速度很 快，而当转化率达到一定程度后，反应几乎停止.胺解反应温度对反应速率有 一定的影响，升高温度，胺解反应速率加快:而在同一温度下，改变反应物的 初始浓度对胺解反应速度影响不大. 3 .碳酸乙 烯撑酷与甲基丙烯酸一 口一 轻乙醋悬浮共聚的产率高达 9 5 %以上 得到一系列浅黄色珠状载体.将此共聚物进行固载葡萄糖淀粉酶的实验，结果 表明， 载体的酶偶联效率和固定化酶的活力回收与载体的结构、组成以 及反应 条件有关。当v c a与h e m a的 配比为4 / 3 ， 交联度为b%时，固定化效果最 好。 葡萄糖淀粉酶固定化的 最适 p h值为 5 .4 0左右， 最适偶联用酶 活力为 3 2 u / m l 。 偶联反应制得的固定化葡萄糖淀粉酶的最适p h值比 溶液葡萄糖淀粉酶 偏高，为 5 .8 0 ;最适反应温度也较溶液酶略高，为 5 5 0c ;而最适反应时间却比 溶液酶便短:由于扩散限制，固定化酶的最适酶促反应底物浓度高于溶液酶。 对这一类载体来说，以丙三醇为致孔剂时，催化效果最好。固定化酶还具有一 南开大学硕士论文 六结论 定的操作稳定性和储存稳定性， 在重复使用7 次后，活力保持8 0% 左右; 在储 存2 6 天后，活力仍保持 8 6 % 左右。 4 ,碳酸乙 烯撑酷与丙烯酸经丙醋及甲基丙烯酸渭 - 乙 醋三组分的 共聚产 物为浅黄色小球.产率为9 5% 左右.以此为载体的固定化葡萄糖淀粉酶的活力 同样与酶偶联反应的酶促反应条件有关。随着固定化时间的延长，酶偶联效率 增加， 但活力回收在固定化2 4 小时后不再增加。 偶联反应的 最适p h值为5 . 8 0 , 最 适 偶联 用酶活 力为3 2 u / m l o 固 定 化 葡萄 糖淀 粉 酶的 最 适p h值为5 .6 0 ， 比 溶 液酶偏高;最适反应温度和最适反应时间分别与溶液酶一致;同样由于底物受 到扩散限制，使得固定化酶的最适酶促反应底物浓度高于溶液酶。此类载体固 定化酶的储存稳定性明显升高，在储存2 2 天后，活力仍可保持9 4 % 左右。 5 .通过对 v c a均聚物载体固定化葡萄糖淀粉酶的研究表明，固定化酶的 最适p h值为5 .8 0 :最适反应温度为5 5 0 c ; 最适底物浓度为6% ( v n) 。 在储 存2 3 天后，活力保持7 3 %左右。 南开大学硕士论文七 致谢 七致 谢 本论文自 始至终是在黄家贤教授的悉心指导下完成的，黄先生严谨的治学 态度、渊博的学识、对科学的执着追求和坦诚的处事作风使我不仅在研究工作 中，而且在为人处世上都受益非浅。 论文工作过程中得到了李春荣教授的热心关怀和指导;朱常英教授和卜 显 和教授慷慨提供了紫外一 可见分光光度计，在此表示衷心的感谢。 博士生霍岩丽、本科生王亮始终与我密切合作，为本论文作了大量工作: 博士生张敏、梁媛媛给予了许多帮助和建议，硕士生蒋艳、晏苏学、郭蔚晖和 杨文英等同学也给予了无私的帮助。在此谨向诸位老师和同学表示衷心的感谢! 最后，对一直支持和鼓励我的家人表示深深的谢意! 李悦 二零零一年五月 南开大学硕士论文 八 参考文献 八 参考文献 李再资编著， 生化工程与酶催化， 广州: 华南理工大学出版社， 1 9 9 5 : 1 1 7 4 气乙 k e n n e d y , j .f . , c a b r a l , j .m. s ., s o l i d p h a s e b i o c h e m . , 1 9 8 3 , 6 6 罗九浦编， 酶和酶工程， 上海: 上海交通大学出版社， 1 9 9 6 : 2 5 4 z a n i n , g .m., k a m b a r a , l .m. , e t a l . , a p p l b l o c h . b i o t e c h . , 1 9 9 5 , 4 5 / 4 6 : 6 2 7 s i s o , m. i . g . , g r a b e r , m. , e t a l . , j . c h e m . t e c h . b i o t e c h n o l . , 1 9 9 0 , 4 8 : 1 8 5 u l b r i c h , r ., g o l b i k , r ., e t a l ， b io t e c h n o l . b i o e n g . , 1 9 9 1 , 3 7 : 2 8 0 蒋中华，张津辉主编，生物分子固定化技术及应用，北京:化学工业出版 社，1 9 9 8 : 1 - 2 0 11213叼516171 8 . e m n e u s , j ， g o r t o n , l . , a n a ly t i c a c h i m i c a a c t a , 1 9 9 3 , 2 7 6 : 3 1 9 9 1 . t o l d r a , f . , j a n s e n , n . b， t s a o , g .t , p r o c . b i o c h e m . , 1 9 9 2 , 2 7 : 1 7 7 1 1 0 ) . e m n e u s , j ., g o r to n , l . , a n a l . c h e m， 1 9 9 0 , 6 2 : 2 6 3 川. e m n e u s , j ., g o r t o n , l . , a n a ly t i c a c h i m i c a a c t a , 1 9 9 0 , 2 4 3 : 9 7 1 2 . j a n o w s k i , f . , f i s h e r , g . , e t a l ., j . c h e m . t e c h . b io t h c h n o l . , 1 9 9 1 , 5 1 : 2 6 3 1 3 1 . g o r t o n , l . , a p p e l q v i s t , r， e t a l . , j . c h e m . t e c h . b i o t h c h n o l . , 1 9 8 9 , 4 6 : 3 2 7 1 4 ) . k u r c z e w s k i , l