（细胞生物学专业论文）rljrgd3抗角叉菜胶诱导的大鼠混合血栓形成的实验研究.pdf

1 q ，+ 一 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：喇 一一 指导教师签名：冶州7 签名日期： 年 月日 辽j 。师范大学硕十学位论文 摘要 目的r l j r g d 3 抗角叉菜胶诱导的大鼠混合血栓形成的实验研究 方法测定r l j r g d 3 抗角叉菜胶诱导的大鼠尾血栓形成长度及形成比率，通过测定模型 及正常大鼠凝血时间参数( t t 、p t 、a p t t ) 、血液流变学，血小板聚集、t x a 2 和p g l 2 水平检测受试药物对大鼠凝血系统、血黏度、血小板聚集等的影响。大鼠腹腔注射受试 药物r l j r g d 3 ( 2 5 、5 0 、7 5 9 9 k 9 1 ) 连续注射5 d ，于第3 天除正常组均采用脚趾( s c ) 注射2 角叉菜胶5 0ul ( 1 0 0 9 ) d 复制血栓模型，末次给药1 0 m i n 后检测上述指标。 j 下常大鼠舌下静脉注射r l j r g d 3 ( 1 2 5 、2 5 、5 0 、1 0 0 9 9 k 9 1 ) ，给药1 0 m i n 后检测上 述指标。研究中分别设相应阳性对照药( 肝素( h e p a r i n ) 、赖氨匹林( l a s ) 和己酮可 可碱( p e n t o x i f ) r l l i n e ) ) 。 结果 1 r l j r g d 3 抗角叉菜胶诱导大鼠尾血栓的形成 与生理盐水模型组相比，r l j r g d 32 5 、5 0 、7 5 9 9 k 茸抑制百分率分别为3 2 5 0 ( p 0 0 5 ) 、4 4 6 3 ( p 0 0 1 ) 和6 4 9 4 ( p o 0 1 ) ，血栓形成比率分别为1o 1 0 、6 1 0 、 4 1 0 。并呈现剂量依赖性。肝素4 0 0i u k 9 1 与赖氨匹林( l a s ) 1 8m g k g - 1 抑制百分率分 别为3 8 0 6 、4 0 3 1 ，血栓形成比率分别为9 1 0 、8 1 0 。 2 r l j r g d 3 对大鼠凝血时间参数的影响 r l j r g d 3 对j 下常大鼠凝血时间参数t t 、p t 、a p t t 无影响，r l j r g d 3 高剂量组对 血栓型大鼠a p t t 作用明显( p o 0 5 ) ，延长百分率为1 9 6 0 ；r l j r g d 3 各剂量组对 血栓型大鼠p t 作用显著，延长百分率分别为1 7 8 0 ( p o 0 5 ) 、2 8 2 8 ( p o 0 1 ) 、 4 7 8 1 ( p o 0 5 ) 、1 9 9 0 、1 8 3 9 ( 胶原诱导) 以及3 1 5 7 ( 肾上腺素诱导，r l j r g d 3 高剂 量组) ，阳性对照组l a s 作用显著，抑制百分率为3 1 0 8 、2 2 4 9 ；r l j r g d 3 ( 1 2 5 、 2 5 0 、5 0 0 、1 0 0 0 9 9 k g 1 ) 对正常大鼠体内血小板聚集的影响，与生理盐水组相比，a d p 诱导各给药组抑制百分率分别为2 5 0 、4 1 3 、5 5 9 和6 5 8 ，r l j r g d 3 抑制胶 原诱导的血小板聚集，低剂量组无作用，其他剂量作用显著并呈现剂量依赖性，抑制百 分率分别为1 2 3 5 、1 6 4 0 、3 4 6 8 ，肾上腺素诱导血小板聚集r l j r g d 3 低剂量组无 作用，其他剂量组显著抑制血小板聚集，抑制百分率分别为9 8 6 、2 5 0 7 、4 7 。8 7 ， 阳性对照组l a s 抑制百分率分别为3 9 6 l 、2 1 0 5 ：r l j r g d 3 终浓度为6 2 5 0 、9 0 9 1 、 1 1 7 6 5 9 9 m l 。1 对a d p 诱导大鼠体外抑制百分率分别为1 8 0 0 、2 5 3 2 、5 2 2 3 ， r l j r g d 3 终浓度为1 4 4 9 、2 8 5 7 、4 2 2 5 i r t g m l o 对胶原诱导大鼠体外血小板聚集抑制百 分率( p o 0 1 ) 分别为1 9 2 0 、4 1 7 0 、5 5 6 4 ，r l j r g d 3 终浓度为2 7 7 8 、5 4 0 5 、 7 8 9 5 1 x g m l 1 对肾上腺素诱导大鼠体外血小板聚集抑制百分率分为6 8 3 、1 5 5 9 、 2 6 5 3 ，呈现较好的量效关系，阳性对照l a s 抑制百分率分别为7 8 4 9 、3 0 5 3 。以 上血小板聚集实验，阳性对照l a s 对肾上腺素诱导血小板聚集无抑制作用。 5 r l j r g d 3 对大鼠血浆t x a 2 和p g l 2 水平及含量比值的影响 与生理盐水模型组相比，r l j r g d 32 5 、5 0 、7 5 1 t g k go 各组对模型大鼠血浆t x b 2 与 6 - k e t o p g f l a 含量影响显著( p o 0 1 ) ，t x b 2 6 k e t o p g f l 仅比值的分别为1 2 3 4 - 0 0 7 、 0 7 6 4 - 0 0 2 、0 4 8 + 0 0 3 ( p 0 0 1 ) ，呈现显著的量效关系；阳性给药组h e p a r i n 4 0 0 i u k 9 1 对t x b 2 与6 - k e t o p g f i a 含量及比值( p o 0 1 ) 分别为2 6 1 9 5p g m l 、4 5 4 4 4p g m l o 及0 5 8 4 - 0 0 6 ；与生理盐水组相比，山- r g d 31 2 5 1 x g k g i2 5 1 x g k 9 1 、5 0 9 9 k 哲1 及1 0 0 9 9 k 9 1 对正常大鼠血浆t x b 2 与6 - k e t o p g f i a 含量影响显著( p o 0 1 ) ，t x b 2 6 k e t o p g f l a 比值分别为0 7 8 4 - 0 0 3 、0 6 1 4 - 0 0 2 、0 4 8 + 0 0 3 、0 2 7 4 - 0 0 1 ( p o 0 1 ) ，呈现显著的量效 关系；阳性给药组h e p a r i n 2 0 0 i u k 9 1 对t x b 2 与6 - k e t o p g f l0 【含量及比值( p o 0 1 ) 分别为2 0 8 7 8p g m l 、6 8 2 。3 8p g m l q 及0 31 4 - 0 0 2 。 结论r l j r g d 3 具有强大的抗大鼠混合血栓形成、模型下大鼠血液流变学改善、抑制血 小板聚集、降低大鼠血浆t x a 2 和p g l 2 水平及含量比值的作用。 关键词；r i _ j - r g 0 3 ；抗血栓形成；角叉菜胶；大鼠 辽j 叫币范人学硕+ 学位论文 e x p e r i m e n tr e s e a r c ho fr l j r g d 3o na n t i t h r o m b o s i si nr a t s i n d u c e db y c a r r a g e e n a n a b s t r a c t o b j e c t i v e t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fr u - - r g d 3o na n t i t h r o m b o s i si nr a t si n d u c e db y c a r r a g e e n a n m e t h o d s t t ，p t ，a p t t ，h e m o r r h e o l o g y , p l a t e l e ta g g r e g a t i o na n dt h el e v e lo ft x b 2a n dp g l 2 w e r ed e t e r m i n e dt oe x a m i n ee f f e c to fr l j - r g d 3o nn t i - t h r o m b o s i si nr a t si n d u c e db y c a r r a g e e n a n t h ea b o v eb l o o dp a r a m e t e r sw e r em e a s u r e da f t e r p a d m i n i s t r a t i o no f r l j r g d 3 a tl o w ( 2 5 ) ，m i d d l e ( 5 0 ) a n dh i g h ( r t g k 百) d o s e st or a t si n d u c e db yc a r r a g e e n a n a n da f t e ri va d m i n i s t r a t i o no f r l j - r g d 3a tl o w ( 1 2 5 ) ，m i d d l e ( 2 5 ，5 0 ) a n dh i g h ( 1 0 0 p g k g ) d o s e st or a t si ne o m p a t i s o nw i t hp o s i t i v e ，h e p a r i n ，l a sa n dp e n t o x i f y l l i n e r e s u l t s 1 e f f e c to fr l j r g d 3o na n t i - t h r o m b o s i si nm o u s et a i lt h r o m b o s i si n d u c e db yc a r r a g e e n a n i nc o m p a r i s o nw i t hn s + cg r o u p ，t h es u p p r e s s i o np e r c e n t a g eo fr l j r g d 32 5 、5 0 、 7 5 9 9 k 岔1w e r e3 2 5 0 ( p o 0 5 ) ，4 4 6 3 ( p 0 0 1 ) a n d6 4 9 4 o 0 0 1 ) ，t h r o m b o s i s r a t i of o r10 10 ，6 10 ，4 10r e s p e c t i v e l y s u p p r e s s i o np e r c e n t a g eo fh e p a r i n4 0 0i u k g 。a n d l a s1 8m g 。k g - 1w e r e3 8 0 6 ，4 0 3 1 a n dt h r o m b o s i sr a t i of o r9 1 0 ，8 1 0 ，r e s p e c t i v e l y 2 e f f e c to f r l j r g d 3o nc o a g u l a t i o nt i m ep a r a m e t e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tr l j r g d 3c o u l dn o tp r o l o n gd o s e - d e p e n d e n t l yt t ，p ta n d a p t tc o a g u l a t i o nt i m ei nn o r m a lr a t s r l j r g d 3c o u l dp r o l o n gd o s e - d e p e n d e n t l yp tw i t h c o r r e s p o n d i n gp e r c e n tl e n g t h e n i n go f c o a g u l a t i o nt i m eb e i n g1 7 8 0 ( p 0 0 5 ) ，2 8 2 8 ( p o 0 1 ) ，4 7 8 1 ( p 0 0 5 ) ， 18 3 9 19 9 0 ，31 5 7 ( r l j - r g d 3a n dh i g hd o s eg r o u p ) ，l a ss i g n i f i c a n t l yp o s i t i v ec o n t r o l i i i r l j r g d 3 抗角义菜胶诱导的人鼠混合血栓形成的实验研究 3 1 0 8 ；t h es u p p r e s s i o np e r c e n t a g eo f r l j r g d 3 ( 1 2 5 ，2 5 0 ，5 0 0 ，1 0 0 0 9 9 k g ) w e r e2 5 0 ，4 1 3 ，5 5 9 a n d 6 5 8 ，p l a t e l e ta g g r e g a t i o ni n d u c e db ya d p 1 0 wd o s eg r o u ph a dn o e f f e c to np l a t e l e ta g g r e g a t i o ni n d u c e db yc o l l a g e n ，o t h e r sh a ds i g n i f i c a n t l yd o s e r e s p o n d e n t ， 1 2 3 5 、1 6 4 0 、3 4 6 8 ，w i t ha d r e n a l i n e i n d u c e dp l a t e l e ta g g r e g a t i o n ，r l j - r g d 3l o wd o s e g r o u ph a dn oe f f e c t ，o t h e rd o s eg r o u p so fs i g n i f i c a n ti n h i b i t i n gp l a t e l e ta g g r e g a t i o n ，i n h i b i t i o n p e r c e n t a g ew e r e9 8 6 ，2 5 0 7 ，4 7 8 7 ，r e s p e c t i v e l y ，l a sh a d3 9 6 1 a n d 2 1 0 5 ；r l j r g d 3e n dc o n c e n t r a t i o nf o r9 0 9 1 ，6 2 5 0 ，11 7 6 5 i t g m l qi nv i t r or a t sp l a t e l e t a g g r e g a t i o ni n d u c e db ya d p i nv i t r or e s p e c t i v e l y ，i n h i b i t i o np e r c e n t a g ew e r e1 8 0 0 ，2 5 3 2 ， 5 2 2 3 r l j r g d 3e n dc o n c e n t r a t i o nf o r14 4 9 ，2 8 5 7 ，4 2 2 5 1 t g m l qp l a t e l e ta g g r e g a t i o ni n v i t r or a t si n d u c e db yc o l l a g e n ，i n h i b i t i o np e r c e n t a g e ( p 0 01 ) w e r e19 2 0 ，41 7 0 ，5 5 6 4 ， r e s p e c t i v e l y r l j - r g d 3e n dc o n c e n t r a t i o nf o r2 7 7 8 ，5 4 0 5 ，7 8 9 5 9 9 m l h a di n h i b i t e d p l a t e l e ta g g r e g a t i o n ，i n h i b i t i o np e r c e n t a g ew e r e6 8 3 ，15 5 9 ，2 6 5 3 i nv i t r or a t sp l a t e l e t a g g r e g a t i o ni n d u c e db ya d r e n a l i n ei nv i t r or a t s ，i n h i b i t i o np e r c e n t a g eo fl a si n h i b i tp o s i t i v e c o n t r o lw e r e7 8 4 9 ，3 0 5 3 r e s p e c t i v e l y a b o v ep l a t e l e ta g g r e g a t i o ne x p e r i m e n t ，t h e p o s i t i v ec o n t r o lo fl a s d i d n th a v ei n f l u e n c eo np l a t e l e ta g g r e g a t i o na d r e n a l i n e - i n d u c e d 5 e f f e c to f o f r l j r g d 3o np l a s m av a l u e so f t x a 2a n d6 - k e t o - p g f l 。 r l j r g d 3c a ne f f e c t i v e l yr e d u c et h er a t st x a 2a n dp g l 2l e v e la n dp l a s m ar a t i oo f c o n t e n t r 巧一r g d 32 5 、5 0 、7 5 p g k g 。，t x b j 6 - k e t o - p g f l aw e r e1 2 3 4 - 0 0 7 、o 7 6 + 0 0 2 、 0 4 8 4 - 0 0 3 ( p 0 0 1 ) ，h e p a r i n 4 0 0 i u k g - i , t x b 2 6 一k e t o - p g f l a ( p 0 0 1 ) w e r e o 5 8 4 - 0 0 6i n m o d e lr a t s ； r l j - r g d 31 2 5 9 9 k g , 2 5 9 9 k g 1 , 5 0 1 t g k g - 1 a n d l o o g g k 9 1 ( p 0 0 1 ) ，t x b 2 6 k e t o p g f ) a w e r eo 7 8 + 0 0 3 、0 6 1 4 - 0 0 2 、0 4 8 + 0 0 3 、0 2 7 4 - 0 0 1 ( p 0 0 1 ) ；h e p a r i n 2 0 0 i u k g - 1 ，t x b 2 6 k e t o p g f l a ( p 0 0 1 ) w e r e0 31 + 0 0 2i nn o r m a lr a t s c o n c l u s i o n r l j - r g d 3h a ss i g n i f i c a n te f f e c t so na n t i - t h r o m b o s i s ，i m p r o v i n gh e m o r r h e o l o g yi nr a t s i n d u c e db yc a r r a g e e n r l j r g d 3h a ss i g n i f i c a n te f f e c t so ni n h i b i t i n gp l a t e l e ta g g r e g a t i o na n d c a l le f f e c t i v e l yr e d u c et h er a t st x a 2a n dp g l 2l e v e la n dp l a s m ar a t i oo fc o n t e n t k e yw o r d s ：r l j - r g d 3 ；a n t i - t h r o m b o s i s ；e a r r a g e e n a n ；r a t i v 辽。j 。师范人学硕十学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i i j ；l言1 1 以整合素为作用靶点的精氨酸甘氨酸天冬氨酸模体毒素研究进展。2 1 1 整合素的结构与功能3 1 1 1 整合素胞外aa 结构3 1 1 2a v d 3 胞外晶体结构3 1 1 30 【b p 3 跨膜结构域4 1 1 4 整合素的生物学功能一4 1 2 整合素作为潜在的药物靶点5 1 2 1 整合素与血栓形成5 1 2 2 整合素与肿瘤转移5 1 2 3 整合素与肿瘤血管生成5 1 3 整合素与配体交互作用的结构特征6 1 4r g d 毒素蛋白的结构特征7 1 4 1r g d 毒素蛋白的结构7 1 5 以整合素为靶点的抗血小板药物8 1 6 以整合素为靶点的抗肿瘤及其他药物l o 2 腹腔注射r l j r g d 3 对血栓模型大鼠的影响1 l 2 1 材料。ll 2 1 1 药品1l 2 1 2 试剂一ll 2 1 3 动物l l 2 1 4 仪器11 2 2 方法与结果1 2 2 2 1 造模12 2 2 2 指标测定方法1 2 2 2 3 数据处理1 4 2 2 4 大鼠尾血栓长度及形成比率1 4 2 2 5r l j r g d 3 对血栓大鼠t t 、p t 和a p t r 的影响1 5 2 2 6 r l j r g d 3 对血栓大鼠血液流变学影响l 7 一v 一 r l j r g d 3 抗角义菜胶诱导的人鼠混合血- 栓形成的实验研究 2 2 7r l j r g d 3 对血栓大鼠血小板聚集的影响1 8 2 2 8r l j r g d 3 对血栓大鼠血浆t x a 2 和p g l 2 水平的影响。2 0 3 静脉注射r l j r g d 3 对正常大鼠的影响2 1 3 1 材料2 l 3 1 1 药品2l 3 1 2 试剂2 1 3 1 3 动物21 3 1 4 仪器2 l 3 2 方法与结果2 2 3 2 1 指标测定方法2 2 3 3 2 数据处理2 2 3 3 3r l j r g d 3 对正常大鼠1 t 、p t 、a p t t 的影响2 2 3 3 4r l j r g d 3 对正常大鼠血液流变学影响2 4 3 3 5r l j r g d 3 对正常大鼠体内血小板聚集的影响2 5 3 3 6r l j r g d 3 对j 下常大鼠体外血小板聚集的影响2 7 3 3 7r l j r g d 3 对j 下常大鼠血浆t x a 2 和p g l 2 水平的影响2 8 4 讨论3 0 4 1r l j r g d 3 对血凝参数的影响3 0 4 2r l j r g d 3 对血液流变学影响。3 0 4 3r l j r g d 3 对血小板聚集的影响3l 4 4r l j - r g d 3 对血浆t x a 2 和p g l 2 水平的影响3 l 5 结论3 3 参考文献3 5 攻读硕士学位期间发表学术论文情况。4 0 致谢4 l v i 辽j ：师范人学硕j f ：学位论文 引言 日本七鳃鳗( l a m p e t r aj a p o n i c a ) 属圆r 3 纲( c y c o s t o m a t a ) 、七鳃鳗目、七鳃鳗 科、七鳃鳗属，是迄今发现的最古老的无颌脊椎动物。其为海洋洄游性鱼类，其成体生活 在海洋，经常用吸盘附在其它鱼体上吸食其血与肉，营半寄生生活。同本七鳃鳗的这种 独特生活习性暗示着其口腔腺中必定具有强效生物活性物质。为了寻找同本七鳃鳗口腔 腺中独有的特化基因或新基因，研究其功能及其在生物技术制药领域的应用，本课题组 针对f 1 本七鳃鳗口腔腺进行了功能基因组学与蛋白质组学的深入研究。本课题组已先期 完成了日本七鳃鳗口腔腺c d n a 文库的构建工作，所构建的库容量为2 1 x 1 0 6 p f u m l 一。 随机挑选单克隆单向测序后，共得到1 2 8 1 条有效e s t 序列。对其进行生物信息学分析 和m r n a 全长测序后发现了一条能翻译出三个r g d ( a r g g l y - a s p ) 模体、含有一对半胱 氨酸且与其它已知蛋白非同源的丌放阅读框。 r g d 毒素肽将成为抗血栓类药物的主力军，这是因为：r g d 模体能专一性地与血小 板纤维蛋白原受体细胞膜糖蛋白g p i i b i i i a 结合，竞争性地拮抗纤维蛋白原与血 小板的结合，防止血小板的活化和g p i i b i i i a 受体构象的改变，阻断受体与多种配体 的结合，抑制血小板聚集的最终共同通路，阻断血栓的形成。 以基因工程手段对来源于同本七鳃鳗e l 腔腺的上述r g d 毒素肽基因l j r g d 3 进行 了基因克隆、蛋白质的诱导表达与纯化，表达产物r l j r g d 3 被命名为鳗溶素。本论文 针对鳗溶素的抗血栓功能进行实验研究， r l j - r g d 3 抗角义菜胶诱导的人鼠混合血栓形成的实验研究 1 以整合素为作用靶点的精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸模体毒素研究进展 整合素为一细胞表面异源二聚体家族，由a p 亚单位组成，为一组跨膜糖蛋白。过 去认为，整合素家族共有2 5 个成员，分别由1 9 种仅亚基和8 种b 亚基构成【l 】。而近年 来已在人类基因组中鉴定出2 4 种a 亚基和9 种d 亚基，这说明又有5 种0 【亚基和1 种 p 亚基被发现【2 】。整合素通常通过精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸( 舡g g l y - a s p ，r g d ) 序列识 别细胞外基质( e c m ) 蛋白，从而介导细胞对细胞外基质的黏附。影响细胞黏附的e c m 分子包括纤连蛋白、v o nw i l l e b r a n d 因子、玻连蛋t 兰t ( v i t r o n e c t i n ) 、血小板反应蛋白、腱 糖蛋t 兰t ( t e n a s e i n ) 、胶原蛋白、层粘连蛋白、骨桥蛋白和其他未鉴定的分子。 r g d 序列最初在纤连蛋白中被发现是主要的细胞整合素识别位点，该识别位点位于 纤连蛋白的p ( p l ，1 3 2 ，p 3 ) 亚基上。接下来r g d 序列被发现存在于多种e c m 分子中，且与细 胞黏附有关。整合素与配体的结合对不同的生理和病理现象非常重要，如：细胞黏附、 细胞增贿、细胞迁移、骨重建、伤口愈合。整合素也与某些疾病的产生及发展有关，包 括血栓形成、动脉硬化、肿瘤侵入、血管生成、肿瘤转移、致病微生物的感染和免疫功 能障碍。 整合素配体的相互作用产生的复杂过程涉及整合素和配体构象变化。一个主要的 因素是整合素的亚单位组成，a 亚基包含一额外的v o nw i l l e b r a n d 因子a 型结构域( a a 结构域或i 结构域) ，1 3 亚基存在与a a 结构域相似的p a 结构域。第2 个主要因素是存 在配体上的整合素识别序列，整合素结合配体需要整合素从低亲和力向高亲和力状态的 快速改变，该事件与受体三、四级结构的改变有关，从而触发信号事件影响细胞的功能 【l 】 o 去整合素( d i s i n t e g r i n s ) 是一类含r g d 或l y s g l y - a s p ( k g d ) 模体并富含半胱氨酸的蛋 白质，广泛分布于蝰科和蝮科毒蛇的毒液中，能有效抑制血小板聚集和整合素介导的细 胞黏附。r g d 模体是一类含有精氨酸甘氨酸一天冬氨酸的短肽序列，是细胞表面某些整 合素的特异性配体之一【3 】。除蛇毒去整合素外，水蛭d e c o r s i n 和o m a t i n 毒素蛋白、硬蜱 v a r i a b i l i n 毒素蛋白均含有r g d 模体【4 卅。另外一些金属蛋白酶，如p i i i s v m p s l 7 1 、 a d a m 射、a d a m t s 9 、a d a m t s l 1 0 1 、蛋白中均含有类去整合素结构域，并含有r g d 模体。s v m p 、a d a m 和m d c 中类去整合素结构域序列与蛇毒蛋白中的去整合素序列具 有同源性，a d a m t s 和a d a m t s l 的类去整合素结构域的功能尚不清楚，但认为这些蛋 白与整合素的连接至少部分与其去整合素类结构域有关。此外还发现了一些同源性毒素 蛋白，它们含有保守的d ( a s p ) 却不同于r g d 模体的m g d 、v g d 、w g d 和m l d g 模体 t l l l ( 表1 1 ) 。 一2 一 辽。j 。师范人学硕十学位论文 1 1整合素的结构与功能 整合素( i n t e g r i n ) 是细胞表面跨膜受体，由0 【d 异源二聚体非共价结合而成，两种整 合素亚基都是i 型跨膜蛋白，分别带有约7 0 0 - 一1 1 0 0 个氨基酸长度的胞外结构域和3 0 - - - , 5 0 氨基酸度的细胞质结构域，所有的整合素二聚体都可被离子去垢剂分解，说明整合素 亚基是非共价结合的。迄今为止已在人类基因组中鉴定出2 4 种a 亚基和9 种p 亚基。a 和b 亚基可有多种排列组合，构成整合素的多样性。 以d 1 为例，p 1 与1 2 种0 【亚基连接，如仅l p l 、a 2 p l 、a 3 j 3 1 、o , 4 1 3 1 、q 5 b l 、n 6 1 3 1 、a 7 1 3 1 、a 8 p l 、 ( 1 9 1 3 l 、0 【l o d i 、c t l l l 3 l 。a v 亚基与多种p 亚基连接如a v l 3 1 、c t v l 3 t 、a v 3 3 、c t v p s 、伍v p 6 和a v p 8 l 。 多数整合素通过与e c m 蛋白的结合而介导细胞与基底膜的粘附，一种整合素可以与 多种e c m 蛋白结合，而一种e c m 蛋白又可被多种整合素识别。r g d 序列已被公认为是 细胞外基质成分与整合素结合的位点，因为大部分整合素都能识另j j r g d 序列，而大多数 e c m 蛋白分子都含有r g d 序列。整合素识另i j r g d 序列中的天冬氨酸残基。整合素胞内 结构较短，但可通过a 辅肌动蛋白( q a c t i n i n ) 、踝蛋i 兰i ( t a l i n ) 和粘着斑蛋白( v i n c u l i n ) 与细 胞骨架连接，而r a p 1 诱导的整合素活化复合体一踝蛋白r i a m ( r a p l g t p i n t e r a c t i n g a d a p t o rm o l e c u l e ) 的形成，从而暴露裸蛋白上的整合素连接位点，导致整合素活化【1 7 j 。 1 1 1 整合素胞外qa 结构 依据结构差异，a 亚基可细分为2 类：第l 类仅l 、毗、a d 、a e 、a l 、q m 和q x ，a 亚 基上含v o nw i l l e b r a n d 因子型a 结构域；第2 类包括位3 、a 5 、o , 6 、伍7 、g t 8 、a b 和a v 亚 基，通过二硫键连接，无a a 结构域。所有的q 亚基都含同样的g f f k r 模体，该模体位 于跨膜结构域。a a 包含一中心结构，该结构由7 个a 螺旋包围p 折叠，在包含a a 结构 的整合素中a a 结构域顶部的位点为金属离子依赖黏附位点( m i d a s ) ，带2 价阳离子。 自然状态下的a a 结构存在两种构造，即“关闭( 低黏附) 和“开启( 高黏附) 心1 3 1 。 1 1 2a 。d 。胞外晶体结构 目前，关于a v b 3 胞外结构域x 射线晶体结构的研究最为明确，这为整合素结构和 功能的关系提供了依据。总体来讲，a v p 3 的2 个亚基组装成具有2 条“腿”的球形头部， 形成一个大的胞外结构域。 a 亚基头部结构n 末端有约6 0 个氨基酸的7 个同源重复的叶状的螺旋结构，q v 亚 基有4 个结构域：n 端7 叶状螺旋结构域、紧跟c 端i g 类“腿”结构域2 个类似p 三明 治结构域c a l f - 1 和c a l f - 2 。叭b 3 的晶体结构表明在o v 腿和c a l f - 1 结构域出现一短的二硫 键连接形成的发夹环。 r l j r g d 3 抗角义菜胶诱导的人鼠混合血栓形成的实验研究 p 亚基含约2 0 0 个氨基酸残基的高度保守区域，此区域与a a 结构相似。p 亚基胞外 结构由8 个结构域组成：p a 结构域、p s i 结构域、i g 类杂合型结构域、与杂合型结构域 相连接的4 个e g f 类结构域和新发现的p 尾结构域( p t d ) 【1 2 , 1 3 1 邛亚基上有一r g d 模体 识别位点，识别连接蛋白的r g d 序列，发夹环r g d 序列在p a 与螺旋之间，需2 价阳 离子( 图1 1 ) a b 图1 1 整合素o t v p 3 胞外晶体结构1 1 4 】a ：无配体结合的a v l 3 3 胞外结构，b ：高黏附c r g d 连接 的a v l 3 3 胞外结构。 1 1 3a i i b d 。跨膜结构域 异源二聚体整合素黏附受体为i 型跨膜蛋白，通过跨膜结构域调节细胞信号事件。 利用化学和计算机方法研究整合素0 【i l b p 3 的跨膜结构，发现0 【亚基跨膜结构中螺旋 g f f k r 模体的甘氨酸位点存在一转角，该转角将g f f k r 模体上的2 个苯丙氨酸带入a 和p 连接界面，p 跨膜结构上的赖氨酸残基在g t 和p 亚基跨膜结构连接界面中起重要作 用。a 胁和d 3 亚基跨膜片段是细胞信号事件的中心，它们的连接与解离影响细胞 “o u t s i d e i n ”和“i n s i d e o u t 信号事件。整合素0 【i l b p 3 跨膜复合体结构的独特性及高保 守性使细胞信号事件合理化【1 5 , 1 6 】。 1 1 4 整合素的生物学功能 整合素与e c m 相互作用，具有多种生物功能，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生 理活动，在细胞外间质和细胞骨架之间提供了生理上的连接。整合素黏附分子在止血、 血管形成、肿瘤、骨形成中都起重要作用。整合素的生物功能受整合素相关的信号通路 的调节，包括调节细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移等。目前研究最为详尽的整合素相关 联的信号蛋白为粘着斑激酶( f o c a la d h e s i o nk i n a s e ，f a k ) ，相对分子质量为1 2 5 k u ，f a k 与整合素受体连接，在细胞表面信号蛋白聚集成粘着斑复合体的过程中起着关键的作 用。此外，整合素相关的信号蛋白分子还包括蛋白激酶c ( p c k ) 、整合素连接激酶、整合 素相关蛋白等【1 8 】。 - 4 - 辽j 叫币范人学硕十学位论文 1 2 整合素作为潜在的药物靶点 整合素作为细胞表面黏附受体，是细胞与细胞，细胞与e c m 之间作用的重要介导成 分，可以作为潜在的药物靶点。 1 2 1 整合素与血栓形成 血栓形成依赖血小板的活化及血小板凝结的级联反应，血栓形成的关键是血小板细 胞表面整合素的活化，这其中起关键作用的整合素是0 t i i b l 3 3 。纤维蛋白原与血小板表面糖 蛋白a b p 3 的结合在血小板聚集过程中起重要作用，s r c 和r a c 的活性及肌动蛋白的聚合对 q i i b d 3 与低密度纤维蛋白原的连接起重要作用，而p k c 磷脂酰肌醇- 3 - 激酶( p 1 3 k ) 激酶则 有助于q i i b b 3 在高密度纤维蛋白原上的级联作用【1 9 】。除0 【b 1 3 3 外，血小板细胞表面还表达 有其他的受体，如0 t v p 3 、毗b i 、a 5 p l 、a 6 p l 、a l p l 等，它们均调节血小板的功能。最新研 究显示，整合素b 3 亚基是血栓形成的关键“控制点”，如果能对它及其相关信号的转导通 路进行有效控制，就将有助于防治血栓性疾病。 1 2 2 整合素与肿瘤转移 肿瘤转移是一个多步骤、连续的主动过程，包括原发灶肿瘤细胞突破基底膜侵入问 质、肿瘤细胞在问质中移行并接触脉管及肿瘤细胞突破血管内皮及内皮下的基底膜进入 血流，并在血液中存活。整合素与肿瘤转移密切相关，整合素在肿瘤细胞上的表达影响 肿瘤细胞的转移，而整合素在肿瘤细胞表面上的分布也影响肿瘤细胞的转移潜能。 通过免疫组化的方法检测整合素与子宫内膜黏附和迁移的关系，结果发现整合素如 毗p l 、a 5 p i 、0 【6 p i 均参与癌细胞的转移有关【2 0 1 。- 自；i n 腺癌细胞系d u l 4 5 中，整合素a s l 3 1 的表达与e g f 信号通路相关，研究表明，e g f 促进前列腺癌细胞的迁移，主要是通过上 调d l 亚基的表达，从而活化m a p k 信号通路，该调节作用于整合素m r n a i 均转录过程【2 。 同j 下常肠上皮细胞相比，直肠癌细胞不表达a 5 d l ，而是利用h e r 2 信号通路进行癌细胞 的增殖，产生致癌作用，a 5 b l 再表达可消除致癌作用。研究发现整合素a s l 3 1 与h e r - 2 相互 作用，抑铝i j h e r - 2 信号通路，a 5 b i 可控制h e r 2 的表达【2 2 1 。抑制整合素a 5 的表达，可降 低p 1 3 k 的