（环境科学专业论文）农药荧光光谱特性的理论与实验研究.pdf

采用密度泛函( d m 方法对各化合物的几何结构进行了全参数优化。在振动分析 的基础上用单激发组态相互作用方法( c i s ) 方法计算了它们的荧光光谱，所得 结果与实验值基本一致。从量子化学角度阐释了产生荧光的机理特征，并从理 论上分析探讨了毗虫啉水解反应易于发生的可能构象。为进一步研究农药荧光 分析技术提供了一种新的理论方法，为农药降解作用的基础研究提供了有用的 信息。 关键词：农药荧光分析荧光光谱量子化学 t h e o r e t i o a ia n de x p e r i m e n t a is t u d i e so n fiu o r e s c e n c es p e c t r ao fp e s ticid e s m a j o r e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e p o s t g r a d u a t e ：z h a n gs h u t u t o r ：s h u o w e il i 硼1 ea p p l i c a t i o no fp e s t i b i d ep r o m o t e dt h ed e v e l o p m e n to fm o d e r na g r i c u l t u r e h o w e v e r tw i t ht h ei n c r e a s i n gl mo f p e s t i c i d e s e r i a lp r o b t c m si nu a t u r ce n v i r o n m e n t a n dh u m a nh e a l t hc o u r s e db yt h ep e s t i c i d er e s i d u ab e c o m e sm o r ea n dm o r e o u t s t a n d i n g , c o u r s i n gw i d e l yi n t e r n a t i o n a la t t e n t i o n s oh i g h - s e n s i t i v i t yd e t e c t i o n m e t h o db e c o m e sg r e a t l yi m p o r t a n tt ot h ep e s t i c i d er e s i d u aa n dt h e i rm e t a b o l i t e s 豇堵t r a d i t i o n a la n a l y s i sm e t h o d sf o rp e s t i c i d er e s i d u e s , s u c ha st h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( t ic ) 。g a sc h r o m a t o g r a p h y ( c - c ) ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n db i o l o g i c a la n a l y s i s ，h a v et h ed i s a d v a n t a g e si n c l u d i n g c o m p l i c a t e ds a m p l ep r e p r o c o s s i n g , c o n s u m i n gm o r er e a g e n ta n dm o r et i m ee t c t h u s ，i ti si m p o s s i b l et oc a r r yo u taf a s ta n dg r e e nd e t e c t i o nw i t ht h et r a d i t i o n a l m e t h o d s n cf l u o r e s c e n c ea n a l 姆sm e t h o dh a sa d v a n t a g e so f h i g hs e n s i t i v i t y , l i t t l e s a m p l i n g ，f a s td e t e c t i n ga n ds i m p l eo p e r a t i o n , a n ds h o w su n i q u es u p e r i o r i t yi n e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g i nt h i sp a p e rt h et e c i m o l o g yo ff l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y i sa p p l i e dt ot h o o r e t i c 4 da n de x p e r i m e n t a ls t u d yo f p e s t i c i d er e s i d u ad e t e c t i o n s t a r t i n gw i t ht h eb a s i cp r i n c i p l eo ff l u o r e s c e n c em e a s u r e m e n t , t h ef e a s i b i l i t yo f f l u o r e s c e n c eo r i g i no f s o m ec o m m o np e s t i c i d e s , s u c h 觞c a r b a m a t e , b e n z o y l u r e aa n d f u n g i c i d ei sa n a l y z 。di nt h e o r y , a n dt h e f l u o r e s c e n c ep r o p e r t yo fc u r b u r y l ， m c t o l c a r b ，p i r i m i c a r b ，i s o p r o c a r b ，i p r o d i o n e ，i m i d a c l o p r i d ，a c e t a m i p r i dw e r e e x p e r i m e n t a ls t u d i e d t h e r e l a t i o n s h i p sb e t w e e n t h ec h a r a c t e r i s t i c so fn a t u r a lf l u o r e s c e n c ea n d m o l e c u l a rs t m c t u r e sw e r ea l s or e s e a r c h e d a sw e l la st h ee x c i t a t i o na n de m i s s i o n s p e c t r ao ft h e s ep e s t i c i d e sa n dt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao fb a c k g r o u n ds o l v e n t m o r e o v e r , t h e i ro p t i m u me x c i t a t i o nw a v e l e n g t ha n de m i s s i o nw a v e l e n g t ha r c s t u d i e da n dc h o s e n t h ef l u o r e s c e n tp r o p e r t yo fc a r b a r y la n dm e t o l c a r bi nd i f f e r e n t p h w a ss t u d i e d , a n dt h ew o r k i n gc u r v ew a se s t a b l i s h e da c c o r d i n gt ot h eo p t i m i z e d e x p e r i m e n tc o n d i t i o n t h es t a n d a r dp e s t i c i d e sa n dt h ep e s t i c i d er e s i d u e si nr i c e ，v e g e t a b l e sa n dw a t e r s a m p l eh a v eb e e ns t u d i e db y t h ef l u o r e s c e n c em e a s u r e m e n ts y s t e m t h e i r f l u o r e s c e n c es p e c 缸 aa n dt h ea n a l y t i c a lp a r a m e t e ro ft h i ss y s t e m ，s u c ha st h e d e t e c t i o nl i m i t , r e c o v e r ya r ea c h i e v e ds u c c e s s f u l l y t h er a t i o n a l i t ya n dp r a c t i c a b i l i t y o f t h i ss y s t e ma n dt h em e a s u r e m e n tm e t h o dw e r ev a l i d a t e d t h em e t h o do fq u a n t u mc h e m i s t r yw a su s e df o rs m d y i n gt h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r ao ft h r e eo o m m o t lp e s t i c i d ec o m p o u n d s f i r s t l y , t h eg e o m e t r i e so ft h e s e t h r e ec o m p o u n d sw 钉ef u l l yo p t i m i z e du s i n gd e n s i t yf u n c t i o n a lt h e o r y ( d f t ) m e t h o d a f t e rv i b r a t i o n a l a n a l y s i s ，t h e f l u o r e s c e n c e s p e c t r a o ft h et h r e e c o m p o u n d sh a v eb e e ns t u d i e db yc o n f i g u r a t i o ni u t e m c t i o nm e t h o d ( c l s ) t h e r e s u l t so fc a l c u l a t i o na r ei nb e t t e ra g r e o m c n tw i t ht h ee x p e r i m e n t a lv a l u e s t h e m e c h a n i s mo ff l u o r e s c e n c ee m i s s i o nh a sb e e ns t u d i e d t h e o r e t i c a l l y t h e c o n f o r m a t i o nw h i c hi sf i tt h eh y d r o l y s i sr e a c t i o no f i m i d a e l o p r i dw a sa l s o a n a l y z e di nt h e o r e t i c a la s p e c t t h er e s u l t sp r o v i d e dan e wa n dt h e o r e t i c a lm e t h o d t o s t u d yt h ef l u o r e s c e n c ea n a l y s i so fp e s t i c i d ec o m p o u n d s t h e s er e s u l t sw i l l p r o v i d ep e s t i c i d ed e g r a d a t i o n w i t h 剐y f f l eu s e f u li n f o r m a t i o nf o rt h ef t h t h e r s t u d y k e y w o r d e ：p e s t i c i d ef l u o r e s c e n c e a n a l y s i s f l u o r 啪c es p e c t r u m q u a n t u mc h e m i s t r y 四川师范大学学位论文独创性及 使用授权声明 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师奎挝佳教援指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符而 引起的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥 有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学校规定提交印刷 版和电子版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索；2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文或解密后的学位论文 作为资料在图书馆、资料室等场所或在校园网上供校内师生阅读、浏览。 论文作者签名：张妹 0 7 年5 月1 8 日 础丁i 仞 农药荧光光谱特性的理论与实验研究 1 综述 1 1 引言 农药是指用于预防、消灭或控制危害农业、林业的病、虫、草和其他有害 生物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成物质或者来源于生物、其它 天然物质的一种或者几种物质的混合物及其制剂【l 】。农药的使用在农业生产防 治病虫害，保障人类所需农产品正常供给方面发挥巨大作用的同时，也给人类 健康和环境安全带来了许多负面影响，这在化学农药方面尤为突出 2 - 7 1 。 农药的使用可追溯到公元前1 0 0 年，在古希腊，已有用硫磺熏蒸害虫及防病 的记录。但作为农药太规模发展的历史，大致可从2 0 世纪4 0 年代来划分：在此 以前是以天然药物及无机化合物农药为主的天然和无机药物时代；从2 0 世纪4 0 年代开始进入有机合成农药的时代 s , g j ，其主要标志是具有选择性的苯氧乙酸除 草剂、有机氯和有机磷杀虫剂等进入商用化阶段1 1 0 , 1 1 】。 按照农药的主要防治对象、作用方式、来源和化学结构可以将农药分为图 1 - 1 所示的不同类型【1 2 】 到目前为止，地球人口已有6 0 多亿，预计2 0 4 0 年达到8 5 亿。在现有的地球 居民中，估计约有7 亿人处于营养不良状态，有1 3 亿人不能得到充分的、配置合 理的食物供应。要解决人类的食物问题，寄希望于耕地的扩大是不现实的，因 为扩大耕地的可能性有限，事实上世界上的耕地面积在逐年减少【1 3 1 。目前在用 农药情况下，全球仍有3 5 的农作物产量损失。根据联合国粮农组织( f a o ) 的 调查，全世界每年被病虫害夺去的谷物量为预计收成量的2 0 y 0 ，经济损失 达1 2 0 0 亿美元【”1 预计在2 l 世纪中叶之前化学农药仍是农药的主体，在我国尤 其如此 1 4 , 1 5 。因此，合理使用农药，已经成为增加粮食生产、改善人类食物供 应的一种重要手段。 我国拥有1 3 亿人口，发展农业保证以占世界7 的耕地面积养活占世界总 数2 2 的人口。是国民经济的首要任务，其主要措施就是通过化学农药不断提 高单位面积产量。我国农作物病虫草害常年发生，受害面积大约2 亿公顷，每年 需要生产和使用化学合成农药2 5 万吨( 有效成分) 如果不使用农药，每年农作 四川师范大学硕士学位论文 物产量将因病虫害损失3 0 左右。为了对付病虫害，每年全世界要生产农药2 0 0 多万吨，其中主要是化学农药。在工业发达国家，施用化学农药所挽回的粮食 损失占总产t 的3 0 - 3 5 i ：1 6 , 1 7 。 按 j 銎 阳 f 觜 l 妻 j 萎 i = 了芒 来 源 分 类 万酝磊品瓦aj i 抗生素i 圈1 - 1 农药的分类 f i g - 卜1o l a s s i f i c a t i o no fp e s t i c i d e 有机氯化合物 有机磷化合物 抑除虫菊酯 氨基甲酸酯 有机硫化合物 有机金属化合物 酰胺类化合物 杂环类化合物 苯氧羧酸类 酚类化合物 脲类化合物 醚类化合物 酮类化合物 三氮苯类 二氮苯类 苯甲酸类 脒类化合物 香豆素类化合物 其他 化学农药对保证粮食生产和推动农业的发展做出了不可磨灭的贡献。但是 长期大量地使用化学农药，对生态环境和人类身体健康造成了严重的危害【嘲。 因此首先要开发“超高效、无毒、无污染”的新型化学药剂，使农药的防治效 果可以提高几十倍甚至几百倍，并且这种药剂无致畸、致癌、致突变作用。 1 2 农药化学的研究现状与展望 农药化学的研究内容是吸取近代生物化学和分子生物学等的最新成就，用 2 农药荧光光谱特性的理论与实验研究 有机化合物来影响、控制和调整各种有害生物( 包括植物、动物、微生物) 的生 长、发育和繁殖过程，在保障人类健康和合理的生态平衡前提下，使有益生物得 到有效的保护，有害生物得到有效的控制，以促进农业现代化向更高层次发展 【嘲。农药化学也是有机化学与农药、生物学交叉形成的学科，研究有关农药的 设计、合成、分析、构效关系、降解、代谢等有关有机化学的问题【2 0 1 。 全世界通过大量的生物筛选系统，已在1 9 5 万个有机化合物中进行了筛选， 仅找出8 0 个有商品价值的有机农药品种。在研究农药化学的过程中，要涉及农 学、生物化学、环保学、医学等学科。因此，农药研究是一门复杂的系统工程【2 1 1 。 1 ，2 1 农药化学的研究现状 ( 1 ) 天然农药 在某种意义上讲，自然界是刨制新农药的最好设计师。一些植物( 已知有4 0 0 多种) 含有天然抗拒昆虫进攻的物质，且具有很低的温血动物毒性吲。这些来 源于植物的物质，结构多样、种类繁多，充分反映出植物与昆虫的相互制约， 相互依存。它们的活性往往是由某些分子或基团所致，如果对这些物质进行研 究，锁定它们的活性部位和活性结构，进而模拟活性结构进行全合成或半合成， 就可以得到高效、低毒、无污染的化学农药，起到事半功倍的效果所以今后 设计化学农药分子，应首选具有生物活性的天然产物或与其相似的合成化合物。 到目前为止，自然界具有农药活性的植物已发现不少；除虫菊酯是来源于 菊科植物除虫菊于花的提取物，是具有极强活性的6 个杀虫物质的总称【2 3 1 。这 类物质是通过菊酸部分的偕二甲基和醇部分侧链上的不饱和部分嵌入神经膜受 体的“锁眼”位置而起作用的，具有极高的生物活性在此类天然杀虫物质上 发展起来的拟菊酯类仿生农药，则已有近3 0 种投产，约占杀虫剂市场的1 8 嘣卅。 印楝素化合物是一种活性极好的新型昆虫拒食剂嘲。毒扁豆碱为毒扁豆中 剧毒物质，以此为先导化合物，合成了一大类氨基甲酸酯类杀虫剂，并发展成 了杀虫农药中的三大类之一【2 6 】 ( 2 ) 植物生长调节剂 植物激素是天然存在的生长调节物质，它包括吲哚乙酸、赤霉素、细胞激 四川师范大学硕士学位论文 动素、脱落酸及乙烯5 种，前3 种是植物生长的促进剂，后2 种的功能是加速衰老。 对以上3 个激素有拮抗作用【2 ”。植物的生长受生长促进剂和抑制剂共同控制， 不少人工合成的天然激素类物质，如2 ，4 一d 萘乙酸等早已在农业上得到应用 【2 8 1 。 ( 3 ) 昆虫信息素 昆虫信息素的主要化学成分为不饱和长碳链( c 1o c 1 2 ) 的脂肪醇、醛、酮 或乙酸酯及具有光学活性的萜类分子。经过2 0 多年的实践与探索，发现昆虫信息 素用于监察、调查虫情与消长，是一个非常简便有效的手段。鉴定及合成昆虫信 息素，通过调控昆虫的行动、交配、产卵、摄食及影响天敌等方面来达到防治害 虫的目的，这种从化学生态学出发研究新杀虫剂的方法可能为合成化学家提供 更多的结构类型去研制出优越性能的杀虫剂【2 9 】。 ( 4 ) 有机合成农药 有机磷化学曾在农药化学中占有重要的位置，人们学会利用昆虫和人体中 其它酶系的差异( 如人体中有羧酸酶，而昆虫体中没有等等) 设计出新的高效低 毒有机磷杀虫剡。近年来，有机磷化学又在杀菌剂和植物生长调节剂中获得实 用，例如m o n - s a n t o 公司开发的除草剂草甘膦【3 0 】 d up o n t 公司推出了第一个有机硅杀菌索j n u s t a r ，具有高效、内吸、治疗和 广谱性的特点由于氟元素和氟基团导入分子后，其电子效应增强，在有机体 内的脂溶性、渗透性大大增强，生物活性有很大改进。著名的除草剂氟乐灵即 是1 例。氟氯氰菊脂则是一种新拟除虫菊酯杀虫荆。具有特殊性能的含氟农药正 在不断地出现。 1 2 2 化学农药的发展方向 开发高效低剂量、滞留期短、生物降解迅速、有选择作用、对人类和环境 安全的新农药是今后农药研究开发的方向3 。在此形势下，迫切希望有高效率 的手段来进行新药的筛选，其中最关键的是合理地进行分子设计，逐渐由过去 盲目的随机筛选向生物合理设计或推理设计方向发展，把注意力集中到以现有 知识为基础的方法上 4 农药荧光光谱特性的理论与实验研究 利用作用机制的知识来设计新的化合物已取得不同程度的成功。然而，这 一概念尚在发展初期，它要求合成化学家具各结构活性关系、计算机处理、统 计学基础、生物化学机理以及理论有机化学等方面的知识。实际上，农药与酶 或其它活性部位的相互作用可看成是一种复杂的化学反应，它们受反应疏水性、 电性及空间结构的影响。即使对作用机制不明，研究化学结构与活性的定量关 系，可以推导出与生物活性有关的诸因素，帮助寻找出最佳结构，这对于推断 结构这类药物的作用机制也可能是有用的。采用量子化学及分子力学的方法， 有助于充分认识药物三维结构对活性的影响，从而对推断与设计农药的结构是 十分有益的计算机辅助设计将可进一步提高设计的效率和正确性。生物测定 方法的改进。不断发现以微量化快速化为特征的新的生物测定模型，可将所得 信息尽快反馈到有机化学家的设计思维中去。这种从分子设计阶段就综合作用 机制、代谢途径、毒理学、环境科学、分子生物学的最新成就的方法无疑将在 未来的农药化学研究中占主导地位。 1 3 农药残留检测方法及其发展趋势 农药残留分析是一项对复杂混合物中痕量组分的分析技术，它要求精细的 微量操作手段，灵敏度高，特异性强。由于各类蔬菜食品样品组成成分复杂， 而且不同农药品种的理化性质存在较大差异。因而没有一种多组分残留分析方 法能够覆盖所有的农药品种。目前对农药残留分析的要求是多残留分析，回收 率高，重现性好，低检出限，操作简单易行。 近年来在农药残留分析领域所取得的重要进展或发展趋势主要有以下方 面：样品提取和净化方法的简单化、微型化和自动化农药残留测定之前，要 有适合于各种蔬菜食品和目标物化学性质的萃取、净化、浓缩等前处理步骤， 这些前处理过程在分析中起着决定的作用农药残留分析大多采用有机溶剂提 取目标分析物，但是溶剂提取存在二次污染问题。随着科学技术的进步，操作 简便、具有选择性萃取的新技术。高灵敏度的检测方法不断出现，如：超临界 流体萃取( s f e ) 、固相萃取( s p e ) 、凝胶渗透色谱法( g p c ) ，吹扫蒸馏、直接光谱 分析、毛细管电泳( c e ) 、免疫分析技术( i a ) 等 3 2 , 3 3 1 四川师范大学硕士学位论文 ( 1 ) 超临界流体色谱法( 简称s f c ) s f c 可以在较低温度下分析分子量较大、 对热不稳定的化合物和极性较强的化合物。l e h o t a y 等提出了在蔬菜水果多残留 分析的样品制备中应用h y d r o m a t r i x ( h n x ，一种小粒状硅藻土) ，解决了超临界 萃取要求样品的水分含量不能太高，样品用量小，以保证样品的均一性、代表 性和方法的准确度等问题【3 “。j o b l a s k a 和m u r u g a v c r l 等分别报道了用毛细管 s p f m c 测定有机氯及氨基酸酯类农药的残留【3 5 】，此方法为真正意义上的自动 化分离分析体系的建立提供了切实可行的技术基础。由于超临界流体萃取需要 一定的特殊设备，使目前广泛应用受到限制。 ( 2 ) 高效液相色谱法( 简称h p l c ) 及气相色谱( 简称g c ) 液相色谱( 简称l c ) 质谱( 简称m s 联用k l a u b c 建立了氨基甲酸酯的荧光测定法，检测限为5 5 0 p g 瓜g ，结果用m s 确证。m i y a h a r a 用s f e 净化。g c i t m s ( 离子肼的串联质谱) 测 定了蔬菜中五氯硝基苯及代谢产物，六氯苯的残创矧。a r g a u e r p 0 该方法测定了 2 6 个样品中的2 4 种氨基甲酸酯类农药，回收率为7 0 1 0 0 ”l 。 ( 3 ) 免疫分析法( 简称认) 免疫分析具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、 分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点。在农药残留分析中，使用最多的 是酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) ，k u a n f m a n 等先后综述了i a 在农药分析中的研 究和应用概况】。 ( 4 ) 直接光谱分析近红外衰减全反射光谱( n 1 a t r ) 和表面增强拉曼光谱 ( s e r s ) 使光谱分析灵敏度提高1 0 2 1 0 7 倍，快速、直接的光谱技术，只需要极 少量的样品，具有很大的应用潜力 3 9 - 4 2 1 。s e r s 法具有高的表面检测灵敏度以及 易于获得全波段振动光谱等优点，在农药残留分析上得到了广泛应用。 我国的农药残留分析技术始于2 0 世纪5 0 年代，那时的农药残留分析技术方 法仅限于化学法、比色法和生物测定法，检测方法单一，灵敏度也不高。随着 技术发展和对外改革开放，我国的技术人员也逐渐掌握了以上所述的多种农药 残留分析技术，并在实践中不断完善【9 a 3 , “i 。 在有机氯农药残留检测方面，采用薄层色谱法测定粮食蔬菜中有机氯农药 残留量，六六六的最低检测限为0 0 2 p g ，d d t 为0 0 6 l g 【4 习。采用微量化学法处 理样品，g c e c d 测定蔬菜酱中有机氯残留，回收率为8 0 0 9 2 5 ，r s d 1 0 m 。 6 农药荧光光谱特性的理论与实验研究 在有机磷农药残留检测方面，采用毛细管气相色谱法能够同时检测1 3 种不 同样品中的有机磷农药，检出限达o 1 2 0 n g t + 7 1 。采用酶抑制法检测食品和出口 冻肉中的有机磷农药，灵敏度可达0 3 m g k g 4 8 ) 。 在氨基甲酸酯类农药残留检测方面，采用国产c 1 8 柱提取生物体液中7 种氨 基甲酸酯类农药，用二极管矩阵检测器和多通道信号检测，最低检钡限为2 0 4 0 r i g t 4 ”。采用毛细管g c 、氮磷检测器测定蔬菜中6 种氨基甲酸酯类农药，最低 检测限为2 1 5 p 眺g 【删。对于血浆中氨基甲酸酯类农药，采用固相萃取( s p e ) 结合g c m s 的系统分析方法，其最低检测限达0 2 1 o g g m g1 5 i 】。 上述方法大部分可达到农药残留痕量分析的要求，并具有很高的精度和灵 敏度，可以根据所测对象的性质选择以上方法中的某一种进行测量。但是它们 都不同程度存在着操作复杂、费时费力、成本高等缺点。例如，气相色谱法和 液相色谱法存在着前处理繁琐、耗时长、试剂用量大等问题；试纸法和酶免疫 检测技术需要特制的进口试剂盒等随着人类生活质量水准的不断提高，对环 境和食品质量的要求也越来越高，对农药检测技术和手段也提出了更高的要求。 农药残留检测是一项对复杂混合物中痕量组分的分析技术，它要求精细的 微量操作手段，灵敏度高，特异性强。对大量资料研究表明，当前国内外农药 残留检测技术主要向着以下几个方向发展 4 3 , 4 4 ，5 2 , 5 3 - 锸1 ： ( 1 ) 应用简便、快捷的分析方法进行现场快速初测，低成本，结果准确可 靠 ( 2 ) 新的蔬菜食品残留检测下限必须低于各国( 地区) 的最大农药允许残留 量。 ( 3 ) 前期处理工作向着省时、省力、低廉、溶剂用量少、无环境污染、系 统化、规范化、微型化和自动化方向发展。各种在线联用技术可避免样品转移 的损失，减少各种人为的偶然误差，将成为农药残留分析方法研究的重点。 ( 4 ) 生物技术与现代理化分析手段相结合不断开发新的农药残留分析技 术 综上所述，结合现代科学技术开发新的农药残留检测方法是农药残留检测 发展的必然趋势【j 7 1 7 四川师范大学硕士学位论文 1 4 荧光法检测农药的国内外研究概况 荧光光谱法作为一种分析技术方法发展至今，已被广泛应用在工业、农业、 医药、卫生、司法鉴定和科学研究各个领域中。荧光分析法能提供激发光谱、 发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、荧光偏振等许多信息，工作曲线 范围宽，已成为一种重要的痕量分析方法。可以用荧光分析鉴定和测定的无机 物、有机物、生物物质、药物等的数量与日俱增1 5 硼。 荧光分析一般是由试样溶液受光激发所发生的荧光强度来测定试样溶液中 荧光物质的含量。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照 射强度及仪器的灵敏度有关。荧光分析的灵敏度一般都高过应用最广泛的比色 法和分光光度法。比色法及分光光度法的灵敏度通常在千万分之几，而荧光分 析法的灵敏度常达亿分之几，甚至有千亿分之几的。如果荧光分析法与纸层析 或薄层层析等方法结合进行，还可能达到更高的灵敏度。另外荧光分析法还具 有方法快捷，重现性好，选择性高，取样容易，试样需要量少等优点【5 9 1 荧光分析法也有它的不足之处。荧光分析法在农药化学研究方面的局限性 主要体现在已知的可以发出荧光的农药种类很少，多数农药加入某种试剂才能 达到荧光分析的目的，还需要广泛地研究。而所加试剂与农药之间的作用有时 比较复杂，研究起来有很大的难度。此外，对于荧光的产生和化合物结构的关 系，研究起来也有一定难度。目前，由于荧光分析法的限制，它在农药检测方 面的直接应用还不是很广泛，往往需要通过与其它方法联用来达到检测的目的， 如高效液相色谱仪一荧光分析法联用技术但是，对于那些本身具有很好的荧 光特性，并且被广泛大量使用的农药( 如氨基甲酸酯类农药西维因、速灭威等) ， 可通过直接测量其荧光强度来进行快速、准确测量。 在我国广泛使用的农药中，常见的并且对人类造成很大危害的主要有三种： 有机氯农药，有机磷农药和氨基甲酸酯类农药唧, 6 h 。在这三类农药中，有机氯 未见有关荧光方法检测的报告，有机磷农药由于分子结构等原因，自身不能发 荧光，目前对其进行监测的方法还主要是色谱法( 包括薄层色谱法，气相色谱法 等) 。有机磷农药对胆碱酯酶有抑制作用，有机磷农药的浓度越大，对胆碱酯酶 的抑制越强，产生的b 萘酚越少，则荧光的变化值越小，从而判断是否存在有 机磷农药，李亮亮【配l 等人对此有相关报告。最低检出限达n o 0 2 5 嵋，m i o 氨基 农药荧光光谱特性的理论与实验研究 甲酸酯类农药在结构上均带有甲胺基团( - n i - i c h 3 ) ，它们的化合物在碱性条件下 加水分解生成甲胺，甲胺与衍生剂反应生成一种强荧光物质，可进行较高灵敏 度的荧光检测【6 3 1 。孙玲m 】等利用激光诱导荧光技术实际测量了虫胆威等5 种 农药的荧光光谱，对农药的荧光检测进行了初步定性的研究。除了氨基甲酸酯 类农药以外，还有苯甲酰脲类和吡虫啉类杀虫剂都具有很强的荧光特性。车仁 生【6 5 】等研制了一种监测毗虫啉农药的光纤光谱仪，该仪器利用氙灯作光源，光 纤传感探头传输并探测荧光，宽带滤光片选择荧光测量毗虫啉的荧光强度和浓 度，检测限达n p p m 级。这三类农药种类繁多，用量较大，是农产品及环境监 测中的一个重要项目。 国外的学者在荧光分析农药方面的研究始于上世纪9 0 年代，他们利用些 农药的天然荧光特性和借助一些荧光染料的作用已成功探测到几种农药的荧光 光谱，并与光纤传感技术相结合开发了多种分析仪例如，1 9 9 8 年r i c h a r dd h a r r i s 等用光纤荧光免疫检测法测定水中农药残留二氯苯氧基乙酸等，检测灵敏 度为6 8 x 1 0 s g g l 硒 ；g - e r dm a r o w s k - y 等研制了专用的荧光激发与测量的管线分 析仪，用于芳香烃类有机物浓度的检测【6 刀；s a l a hh a s s o o n 等研制了一种测量d d t 类农药的荧光探针，测定了土壤中的d d t 残留含量【醴】；1 9 9 9 年r e n e ed j 等研制 了野外便携式三维荧光光谱仪，实时测定了多环芳烃p a h s 的三维荧光谱图，测 量波长范围为2 2 0 n m 9 5 0 n m ，最低检测限达到了1 6 x 1 0 4 峙，l 渺】。可见，农药残 留污染检测已经引起了国内外科学工作者的广泛兴趣，把荧光法与光纤传感技 术、计算机信号处理技术相结合进行检测农药残留污染正在成为国际上的研究 热点。 9 四川师范大学硕士学位论文 2 荧光法测量农药残留的基本原理 2 1 荧光分析法的基本理论 如果物质的分子吸收了紫外和可见区电磁辐射后，它的电子能跃迁至激发 态，然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，本身又恢复到基态。如果吸 收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发 射的波长可以同分子所吸收的波长相同，也可以不同，这一现象我们称它为光 致发光。最常见的两种光致发光现象是荧光和磷光。 当用一种波长的光( 如紫外光) 照射某种物质时，这个物质会在极短的时间 内，发射出较照射光波长为长的光( 如可见光) ，这种光就称为荧光。对于荧光 来说，当激发光停止照射后，发光过程几乎立l l p ( 1 0 毋1 0 击s ) 停止【7 0 1 。 由于物质分子结构不同，所吸收光的波长和发射的荧光波长也有所不同。 利用这个特性，可以定性鉴别物质。同一种分子结构的物质，用同一波长的激 发光照射，可发射相同波长的荧光。若该物质的浓度不同，则浓度大时，所发 射的荧光强度亦强，利用这个性质可以进行定量测定。用荧光进行定性、定量 分析的方法称为荧光分析法，亦称为荧光分光光度法。 2 1 荧光的产生机理 荧光现象从本质上来说是一种光致发光现象。当物质的原子、分子吸收了某 一光谱区如紫外、可见光区电磁辐射时，它的原子、分子产生能级跃迁，跃迁 到高能态，然后又通过无辐射过程弛豫到一种激发态的最低振动能级，则最低 振动能级的原子回到基态时发射光子，这种光称为荧光。由于发射前后的振动 弛豫，荧光发射的光子能量总是小于所吸收的光子能量，因此荧光波长总是大 于激发光或吸收光的波长【7 l 】。 荧光产生机理如图2 - l 所示。该图显示了分子能级闻受激( 吸收) 和去活化 ( 辐射驰豫和热驰豫回到基态) 的物理过程当适当波长的激发光照射在分子上 时，该分子可能吸收光而被激发到某一能级( s l 或s 2 ) 若该分子不发生化学分 解，通常要迅速地回复到第一激发态的最低能级( 图2 - l 中s l 中的v o 能级) ， 这个过程不包含光的辐射处于s i ( v o ) 能级的分子仍然是不稳定的，还将失去 l o 农药荧光光谱特性的理论与实验研究 能量回复到基态s o 。回复到基态的过程一般有三种途径：( 1 ) 发生s l s o 的 辐射跃迁而伴随的发光现象称为荧光；( 2 ) 发生s 1 一s o 的内转化；( 3 ) 发生s l t l 的体系间窜跃，处于t i 电子态的最低振动能级的受激分子再辐射跃迁至基 态发出较荧光波长更长的磷光。三种过程往往是同时发生的，量子产率之和为 1 。这就是荧光发射时的物理过程【7 2 。7 5 1 。 s l l l j i j ： i c ： 。亭 l v r v r 。 i1ij jl 上山山 一1 “ ii i 一 ， a t fl c p 壤c 1f ， 崔 ， rf 1 r1 ， r t a 1 a 2 吸收if 荧光lp 臻光li c 内转化li 体系同宵跃；v r 磋撞振动驰豫 图2 - 1 分子能级跃迁示意图 f i g 2 - 1d i a g r a mo fe n e r g yl e v e it r a n s f e ro fm o l e c u i l i t 2 1 2 荧光的激发光谱和发射光谱 2 1 2 1 荧光激发光谱 在某一固定的发射波长下，扫描激发波长而获得的观测荧光强度随激发波 四川师范大学硕士学位论文 长变化的光谱称为激发光谱。激发光谱反映了在特定发射波长上记录不同波长 激发时的荧光强度。可供鉴别荧光物质，在进行荧光测定时供选择适宜的激发 波长1 7 1 1 。 2 1 2 2 荧光发射光谱 在某一固定的激发波长下，扫描发射波长进行荧光测量所获得的荧光强度 随发射波长变化的关系曲线称为荧光光谱。它反映了在相同的激发条件下。物 质分子在不同波长上发射荧光的相对强度。可供鉴别荧光物质，作为荧光分析 时选择适当的测定波长或滤光片的根据【7 1 1 荧光光谱一般具有以下特征【7 卵6 l ； ( 1 ) 斯托克斯位移在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光的波长总是大于 激发光的波长，即在激发与发射之问存在着一定的能量损失。 ( 2 ) 荧光发射光谱的形状与激发波长无关荧光发射发生于第一激发态的 最低振动能级，与荧光物质分子被激发至哪一个能态无关，荧光光谱的形状通 常与激发波长无关。 ( 3 ) 与吸收光谱的镜像关系荧光物质的荧光发射光谱和它的吸收光谱之 间一般存在着“镜像对称”关系 2 1 2 3 荧光光谱特征的讨论 本文通过对荧光产生机制的介绍，明确了两点关于荧光光谱的特性：其一， 由于荧光辐射跨越的是从激发态的亚稳态到基态之间的能级差，斯托克斯红移 不仅是由于激发态分子的无辐射振动弛豫消耗了部分能量( 实际上振动损耗特 性也存在于有效激发态时的吸收过程) ，更重要的是较高的基态能级使得受激发 的分子未能以无辐射形式释放全部能量，所以斯托克斯现象的荧光谱红移程度 还直接与基态的能级结构( 及其微环境) 密切相关，红移不是线性平移。其二， 荧光物质的吸收特性在能量谱方面涵盖了荧光发射特性，能量转换过程不是双 向等价的，因而吸收特性和发射特性曲线不是完全对称关系。 还有一个关于荧光谱的特征就是“荧光发射光谱的形状与激发波长无关”。 这是针对具有简单能级结构的单原子分子而言的。对于单原子分子物质用不同 1 2 农药荧光光谱特性的理论与实验研究 波长激发光激发，确实可以观察到形状相同的荧光发射光谱。许多实际的实验 光谱曲线表明：复杂结构的大分子或混合物的荧光谱与激发波长有明显的关系。 只有在有限波长扫描范围内才与激发波长无关。诸如多环芳烃等有机化合物分 子的荧光谱的形状随着激发波长不同而变化，不同激发波长下的两个发射光谱 会有显著差别【删。其原因是复杂混合物中不同分子的吸收波长不同，使得混合 物整体对于不同的激发波长产生了不同的发射荧光谱结构。 2 1 3 荧光参量 2 1 3 i 荧光效率 发生荧光必须具备两个条件：一是物质的分子必须具有与照射光线相同的 频率；二是吸收了与本身特征频率相同的能量的分子，必须具有高的荧光效率。 许多能吸收光的物质并不一定发生荧光，就是由于其分子的荧光效率不高，而 将所吸收的能量消耗于与溶剂分子或其他溶质分子之间的相互碰撞。 荧光量子产率( 昂) 定义为荧光物质吸收光后所发射的荧光的光子数与所吸 收的激发光的光子数的比值。由于激发分子的去活化过程包括辐射跃迁和非辐 射跃迁，因而荧光量子产率还可表示为 y ，= ( 2 - 1 ) 式中：足r 为荧光发射的速率常数；k 为各种单分子的非辐射去活化过 程的速率常数的总和。 假如非辐射跃迁的速率远小于辐射跃迁的速率，即：k 0 0 5 e i 时，荧光强度不再增加，因为荧光物质发 射荧光必须先吸收能量。测定某一荧光物质时，及f 是确定的，c 增大时， 1 0 一“变小。当c 很小时，荧光强度，随溶液浓度c 的增加而增大，二者成线性 关系：当浓度继续增大，1 0 刮趋近于零，则式( 2 4 ) 变成，= 昂磊4 ，此时荧光强 度与溶液浓度无关。荧光物质浓度增大到某一限度后，溶液浓度再增大荧光强 度也不再增加1 7 8 】。 lr 图2 - 2 溶液的荧光 f i g 2 吨f i u o r e s c e n c eo fs o l u t i o n l t 2 1 5 2 环境因素对荧光的影响 荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影响，因此适当地选取实 验条件有利于提高荧光分析的灵敏度和选择性 ( 1 ) 温度的影响 农药荧光光谱特性的理论与实验研究 通常，随温度降低，溶液中荧光物质的荧光量子产率和荧光强度将增大， 并伴随光谱的蓝移。当温度升高时，荧光量子产率下降。这是由于当温度降低 时，介质的黏度增大，溶剂的弛豫作用大大减小。而温度升高时，碰撞频率增 加，使外转换的去激发概率增加。因此，选择低温条件下进行荧光检测将有利 于提高分析的灵敏度，