（纺织工程专业论文）再生柞蚕丝素多孔材料的制备及其结构[纺织工程专业优秀论文].pdf

申n 。盘鲐采参彳l h 科的制祷段搀结构 摘婴 摘要 研究了柞蚕丝素纤维的溶解途径和再生丝素溶液的性质，指出硝酸钙和硫氰 酸锂的浓溶液是柞蚕丝素纤维的良溶剂，再生柞蚕丝素的分子量为2 0 k d a t 0 2 4 k d a 。硝酸钙对丝素大分子的破坏程度比硫氰酸锂大。水溶液中再生柞蚕丝 索蛋n 质的分子构象是无规卷曲、a 一螺旋结构0 一折番结构共存。随着溶液洲 值纳增大，柞蚕丝素形成凝胶所需的时间也随之增加，溶液浓度的增大以及环境 温度的升高有利于凝胶纯的发生。形成凝胶后丝素分予结构中出现人量的b 一折 箍结构。采用冷冻干燥法可以制备柞蚕丝索蛋白多孔材料，通过改变工艺条件卅。 以制得平均孔径为7 5 2 6 0 p m 、孔隙率为7 0 9 6 9 0 的多孔材料。当丝索蛋白溶 液的浓度较低，或采用较齑的冷冻温度时，经冷冻干燥后所制得的多孔丝索蛋自 材料内部的孔隙率较大，平均孔径较大。孔密度较小。多孔材料内部柞蚕丝素的 结构是无规卷曲与a 一螺旋结构共存，较高的冷冻温度下制得的多孔材料内部n 一 螺旋结构较多、热水溶失率较小：使用较低浓度的丝素溶液所制得的柞蚕丝素多 孔材料的表观密度和拉伸断裂强度较小。 关键词：柞蚕，丝素。多孔材料 作 者：陶伟 指导教师：李明忠 坐：! ：堡垒竺茎兰垫丝垫塑型堡塾! ! 壁塑 塑 竺 p r e p a r a t i o na n ds t r u c t u r eo fr e g e n e r a t e d a n t h e r a e ap e r n y i s i l kf i b r i o np o r o u sm a t e r i a l s a b s t r a c t t h es u i t a b l em e t h o dt 0d i s s o l v ea n t h e r a e ap e m y is i l kf i b r o i nf i b e r sa n dt h e c h a r a c t e ro fr e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i ns o l u t i o nw e r ei n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r i t c o n c l u d e dt h a tc a l c i u mn i t r a t ea n dl i t h i u mt h i o e y a n a t ed e n s es o l u t i o nw e r eg o o d s o l v e n tf o ra n t h e r a e ap e m y is i l kf i b r o i nf i b e r s t h em o l e c u l a rw e i g h to fr e g e n e r a t e d a n t h e r a e ap e r n y is i l kf i b r o i nw a s2 0 k d at o1 0 2 4 k d a t h ed i g e s t i o no fc a l c i u m n i t r a t ew a sg r e a t e rt h a nt h a to fl i t h i u mt h i o c y a n a t et os i l kf i b r o i nm o l e c u l a r t h e m o l e c u l a rc o n f o r m a t i o no f g c n e 随叫爿n t b e r a e ap e m y is i l kf c o r o i ni na q u e o u s s o l u t i o nw a sc o - e x i s t e n c eo fr a n d o mc o i l ，a - h a l i xm a d 昏酶瞰s t r u c t u r e w i t ht h e i n c r e a s eo fs o l u t i o np hv a l u e ，i tw o u l dt a k em o r et i m ef o ra n t h e r a e ap e m y is i l k f i b r o i nt of o r mg e l a t i n t h ei n c r e a s eo ft e m p e r a t u r ea n ds o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n f a v o r e dt h eg e l a t i o n al a r g en u m b e ro f 争s h e c ts w d c l u r ef o r m e di ns i l kf i b r o i na f t e r g e l a t i o n a n t h e r a e ap e r n y is i l kf i b r o i np o r o u sm a t e r i a l sc o u l db ep r e p a r e db y f r e e z e r d r y i n g b yc h a n g i n gt h et e c h n i c a lc o n d i t i o n s ，w ec o u l dp r e p a r e t h ep o r o u s m a t e r i a l sw i t ht h ea _ 、! e r a g ep o r er a d i u so f 7 5t o2 6 0uma n dt h ep o r o s i t yo f7 0 t o 9 0 w h e nt h es i l kf i b r o i ns o l u t i o ne o n c e n u a t i o nw a sl o w e ro rt h ef r e e z i n g t e m p e r a t u r ew a sh i 【g h e r , t h ep o r o s i t ya n da v e r a g ep o r er a d i u so fp o r o u ss i l kf l b r o i n m a t e r i a lw e r eb i g g e ra n dt h ep o r ed e n s i t yw a ss m a l l e r t h es d l x t e t u r eo fp o r o u ss i l k f i b r o i nm a t e r i a lw a sc o - e x i s t e n c eo fr a n d o mc o l la n d h e l i xk f f l l t u r e t h ea m o u n t o fa h e l i xs t r u c t u r ei na n t h e r a e ap e r n y is i l kf i b r o i np o r o u sm a t e r i a l sw a sm o l ea n d t h es o l u t i o nl o s i n gp e r c e n t a g ei nh o tw r e i w 弱s m a l l e ri f p r e p a r e di nh i g h e rf r e e z i n g t e m p e r a t u r e t h ea p p a r e n td e n s i t ya n dt h et e n s i l es t r e n g t ha tb r e a ko fa n t h e r a e a p e r n y is i l kf i b r o i np o r o u sm a t e r i a l sw e r es m a l l e ri ft h ep o r o u s m a t e r i a l sw e l e p r e p a r e di nt o w e rs o l u t i o nc o n e e n t r a t i k e y w o r d s ：a n t h e r a e ap e m y i ；s i l kf i b r o i n ；p o r o u sm a t e r i a l s w r i t t e nb yw e it a o s u p e r v i s e db ym i n g z h o n gl 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人j l | j 重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究_ 作所 取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或 撰，j 过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材 料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人乐 担本声明的法律责任。 研究生签名：蛆日期：超生j = 牡且坦日 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、制司 社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，叮以采 f i f 影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电f 文档的内容和纸质沦文的内容删 致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，u j 以公布( 包括刊登) 沦 文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：l ；j 墼 期：硅苎聋生旦也日 导师签名：垒煎墨l l 期：超堕叠! 虽堕日 i - 17 盘始采 扎劓科加= i ；4 符歧j 结构 引言 1 蚕丝蛋白的结构与性能 桑蚕丝和柞蚕丝是蚕丝的两大主要品种。我国柞蚕丝的产：肇占i j j = 界总产鼙的 9 0 以b 柞蚕丝纤维作为纺织材料具有质地柔软、光泽优雅、穿着舒适等优点。 幸1 ；蚕丝由丝素和丝胶组成，丝胶包覆在丝素纤维的外围，丝胶含量比桑蚕丝少， 约为1 2 1 5 。柞蚕丝素是柞蚕五龄后期合成并分泌的。种蛋白，由2 6 3 9 个氨 毖酸组成，序列高度重复，在1 7 3 2 6 0 0 氨基酸之间共有7 9 个雨复。丙氨酸、 廿氨酸和丝氨酸是组成柞蚕丝素蛋白的三种主要氨基酸，分别占4 3 0 8 、2 7 2 8 和l1 2 5 。柞蚕丝素中的酸性氨基酸( 天门冬氨酸和谷氨酸) 和碱性氨基酸( 赖 氨酸、组氨酸和精氨酸) 残基的含量较高，酸性氨基酸残基的含量为8 6 6 ，碱 性氨基酸残基的含量为7 4 2 ，具有极性侧链的氨基酸残基总量约为3 7 ，因此 柞蚕丝索的化学活性较强“1 。 桑( 家) 蚕丝是复合蛋白质由h 链( 约5 1 1 2 个氨基酸残基，分子量3 5 0 k d a ) 、 l 链( 约2 4 4 个氨基酸残基，分子最2 5 8k d a ) 及p 2 5 糖蛋白( 2 0 3 个氨基酸残 鉴，分子晕2 3 5 5k d a ，另加3 个寡糖链) 组成，三者比例为h ：l ：p 2 5 = 6 ：6 ： l 。h 链和l 链由各自c 末端的二二硫键相互连接，形成复合体h l ，p 2 5 糖蛋白以 非共价的相互作用参加h l 复合体中。因此，家蚕丝素蛋白的基本单位是 ( 6 h + 6 l + i p 2 5 ) ，分子量约2 2 8 6k d a l ：ijo 家蚕丝素主链中结晶区域和非结晶区域 交鱼排列，家蚕丝素蛋白的结晶形态主要有s i l ki 型和s i l ki i 型两种。s i l k i 酗是介于a 一螺旋和b 一折叠之间的一一种中间形态。呈曲柄型立体构象。s i l ki i 型是反平行8 一折叠层结构，肽链链段排列整齐，抵抗外力拉伸的能力强，难溶 于水。 桑蚕和柞蚕丝素都主要由甘氨酸和丙氨酸两种氨基酸残基组成。柞蚕丝素中 丙氨酸的含餐比家蚕丝素要高。这是导致两种丝蛋白结构和性能有较显著差异的 主要原因之一。家蚕丝素蛋白的结晶区中主要含有重复序列一( 甘氨酸一x ) ， 其。px 为丙氨酸、丝氨酸或酪氨酸。而柞蚕丝素蛋白结晶区中含有大量的一( 丙 氨酸) n _ 乖复序列。组成非晶区的火部分是较火侧链和极性的氨基酸残牡，这在 柞_ 蠡丝索蛋n 的j # 晶区更为突j 。结晶区与非晶区氨基酸组成和结构的差异使得 牛件盘甜嚣善扎利辜： 的制矫垃j e i 掏 家企和柞蚕丝纤维的理化性质有较显著差异。柞蚕丝强伸度很好，存天然纤维中 烈度仪次于麻，伸长率仅次于羊毛。柞蚕丝耐水、耐酸及耐碱性比桑蚕丝好，吸 湿性比桑蚕丝大。柞蚕丝纤维受紫外线照射后，大分子中酪氨酸的酚羟基被氧化， 分f 鼙f 降虽然会导致强伸度下降，刚性增加，机械性能恶化，但恶化的程度 比桑蚕丝小。柞蚕丝还具有很高的比电阻值，是很好的绝缘材料。 2 蚕丝蛋白在生物医学领域的应用 生物医用材料是类与生命系统相作用，用以诊断、治疗、修复和替代人体 病变或损伤的组织、器官，或增进其功能的材料。目前，正在研究及已得到应用 的生物医用材料很多，例如硅橡胶、甲壳胺、胶原蛋白、尼龙、聚酯等，各 有其特点，但很多生物材料存在不同程度的不足“”，例如部分合成材料的生物相 褡性1 i 足，部分天然材料提纯较困难、价格昂贵。 蚕丝具有优良的柔韧性、吸湿性、透气性和优雅的光泽已被人们所熟知。长 期以来，人们习惯于将蚕丝作为纺织原料，而随着材料科学、纺织科学与技术和 生命科学各学科的广泛交叉和渗透，蚕丝蛋白研究也逐渐向分子水平发展，并产 生了蚕丝蛋白用作生物医学材料的新研究领域通过对蚕丝蛋白的分析研究，人 们发现它与人体细胞和组织具有良好的亲和性而且可以制成各种目的形态。蚕 丝蛋白用于生物材料还有以下杰出的特性：蚕丝由蚕儿吐丝结茧得到，容易获得 且价格便宜；蚕丝通过脱胶、溶解、透析。易于得到比较纯的丝素蛋白溶液；蚕 丝蛋白在乙醇等溶剂中难溶，因为这种溶剂对活组织无害，故此特性有助于蚕丝 蛋白用于生物材料：利用非晶区中有化学活性的部位，可以根据需要对蚕丝蛋白 进行化学改性。 家蚕丝素纤维已欧期用作外科手术缝合线，基本不引起不良反应。近年来， 蚕丝蛋白用作生物材料已得到长足发展。将家蚕丝素溶解、提纯后，用流延法所 制得的再生丝素膜，无毒性、无刺激作用，具有良好的生物相容性，且对成纤维 细胞、皮肤表皮细胞的粘附性相当好1 “。闵思佳等“用再生家蚕丝素溶液制备 了多孔丝素水凝胶，用其包埋药物，实验结果表明多孔丝索水凝胶具有一定的药 物透过性，作为药物缓释载体具有一定程度的p h 响应性。 当人体皮肤囚烧伤或创伤而缺损时体液会太景流火，刨面容易受到感染， 严砸的会危及生命。因此，需要及时地将受伤刨蛳覆盖以防体液流火和创1 f l f 受 牛杓虫神采# 扎十寸料的制蔷硬j 结构 到感染。吴徽。手等”研制的丝素创面保护膜，具有良好的柔韧性、透水性、透 汽性、与创i f | ：的粘附性以及与人体的生物相容性，具有保护创i f i i 的作用，消毒、 保存及使用方便。 m i n o u r a 等研究了小鼠结缔组织成纤维细胞l - 9 2 9 在丝索膜l 8 q 粘附和增 殖特性，证实了丝素用作哺乳动物细胞培养基质的可行性。甲斐丰健等进行了人 体肝细胞在丝索膜。 二的体外培养。在丝素膜上播种肝细胞2 4 h 后，用相砻显微镜 t | j 观察到细胞沿基质表面和内部的网状结构作多重结构的粘附。谷一苯转氨酶和 符丙转氨酶检验结果显示，接种卜7 天问，丝素膜上附着的j 卜 = 细胞的谷一苯转氨 酶和谷丙转氨酶活性值几乎没有变化。丝素膜上培养的肝细胞的氨处理能力和肝 细胞蛋白分泌能力也不低于目前最好j h = 细胞培养基胶原。因此，如果用添加 交联荆等方法控制细胞的粘附和增殖性，丝素膜可被用作人体细胞的培养基质 i7 o 刘向阳等“将致密丝素膜和多孔丝素膜进行复钙试验、溶血试验、血小板粘 附试验。结果表明，丝素膜具有良好的血液相容性，致密丝索膜有一定的抗凝特 性。 3 问题的提出 现有的蚕丝蛋白用于生物材料领域的研究和应用中，基本上都是以家蚕丝素 为原料。而作为世界稀有、我国特有的柞蚕丝蛋白却基本未涉及。 与家蚕丝索相比，柞蚕丝素含有特殊的精氨酸一甘氨酸一天门冬氨酸( r g d ) 三肽序列，这种氨基酸组成和序列有助于细胞粘附。同时还含有一定量带正电荷 的氨基酸，因此柞蚕丝素蛋白对细胞的亲和性比家蚕丝素更强”。通过用哺乳动 物细胞在丝素膜上的粘附增殖实验和比较，细胞在柞蚕丝索膜上的粘附和增殖率 远高于家蚕丝索膜。“，显示了柞蚕丝索蛋自优良的生物学性能。 由此我们可以预见，如果能用柞蚕丝素蛋白制备生物医用材料，则有可能在 保持家蚕丝素蛋白材料良好生物相容性的同时，具备更加出色的生物学性能。 组织工程是生物医学工程领域中一个快速发展的新兴学科，其基本原理和方 法是将体外培养的高浓度组织细胞，吸附扩增于一种生物相容性良好并可被人体 逐步降解吸收的生物材料上，形成细胞一生物材料复合物。该生物材料为细胞提 f j 个生存的_ _ = = 维空问，有利于细胞获得足够的营养物质，进行营养物交换，并 牛”鱼舯采# 扎“科的：纠赫，6 乏j e 结构 能排除废物，使细胞能在按照预先设计的三维形状支架卜生长。然后将此细胞一 生物材料复合体植入机体组织病损部位。种植的细胞在生物支架逐步降解吸收过 榉j | ，继续增殖并分泌基质，形成新的具有与自身功能和形态相应的组织和器官。 纠织工程支架材料是当前生物医用材料的研究前沿和热点。 以组织工程为应用目的的生物材料，应具备三维结构，且材料的孔隙率要大， 能够为细胞再生提供足够的空间。如果能用柞蚕丝素蛋白制备多孔材料并应用于 组织工程支架，则将能为组织工程提供一种具备良好生物相容性和生物活性的新 材料。但首先必须解决两个关键问题：( 1 ) 如何制备再生柞蚕丝豢蛋内溶液? ( 2 ) 女l l f j 制各柞蚕丝索蛋白多孔材料? 4 再生柞蚕丝素蛋白及其材料的研究进展 目前，家蚕丝素的再生方法已经比较成熟，用碳酸钠脱去蚕丝或茧层上的丝 胶后，再用氯化钙、溴化锂、硫氰酸锂等盐的浓溶液可将丝素纤维溶解，经透析 除盐后就可容易地得到再生丝素水溶液。j 。这样再生所得到的丝素，由于溶剂 的作用而使得丝素大分子链部分断裂，分子量比天然丝素的分子量有所降低，极 性氨基酸的含量也有所减少。 但是，国内外对柞蚕丝素纤维溶解和丝素蛋白再生的研究报道很少。柞蚕丝 素纤维的主要构象是反平行一折叠结构，- c = o 和一n i 基团之间形成氢键结合，一 ( a l a ) ，侧基之间形成密集的疏水相互作用。链段间的这类相互作用力阻止了 分子的解离，因此，柞蚕丝素纤维不易被化学溶剂溶解。仅有的国外少量报道表 明，柞蚕丝素纤维可被硝酸钙溶解”。k w e o n 等1 将脱胶后的柞蚕丝素纤维放 入熔融的四水合硝酸钙中1 0 5 溶解5 小时，将溶液透析提纯后得到了再生柞蚕 丝索蛋白溶液。在溶解柞蚕丝素的过程中发现硝酸钙的浓度对柞蚕丝素的溶解影 响很大。在同样的温度下，硝酸钙浓度为5m o l l 或更低时柞蚕丝素纤维几乎不 溶，6m o l l 时只能溶解2 0 w t 左右，而在? t o o l l 即熔融状态下却能1 0 0 溶解。 当溶解条件剧烈时，柞蚕丝素蛋白会发生降解。溶液颜色会由淡黄色逐渐变为深 褐色。 m a s u h i r ot s u k a d a 等的研究结果表明，再生柞蚕丝素膜比家蚕丝素膜显 示了史高的热稳定性，玻璃化转变温度较高。h a e y o n gk w e o n 等i ”的研究结果表 i 扎热处理的温度和时间会影响丝素的分子构象，经热处理后无规卷曲结构向b 噜个柞虫蜉菇多扎材料n 勺制薪段l ；- # i 构 一折祷结构转变，柞蚕丝索膜结晶区的a 一螺旋结构稳定小变。用甲醇溶液对杵蚕 丝豢膜进行处理后。丝素膜结构会发生显著变化。甲醇溶液的浓度以及处理时间 对丝紊膜的结构有很大影响。用4 0 6 0 9 6 的甲醇溶液处理丝素膜五分钟后，分子 构象由无规卷曲向1 3 一折稿结构转变。而当甲醇溶液浓度增大到接近1 0 0 时，不 会发生分子构象的转变。 以卜国外关于再生柞蚕丝索膜的研究，为本课题的开腰提供了定的可行性 依赫；i 。 存本文完成前，我们未见国内有再生柞蚕丝索蛋白材料的研究报道，受未见 i 雪内外有柞蚕丝素蛋白多孔材料的研究报道。 5 本研究的目的和内容 家蚕丝素蛋白用作生物材料的成功和前人对柞蚕丝素蛋白结构、性能的研 究，为柞蚕丝素生物材料的研究打下了良好的基础。本研究的目的是：在国内外 已有的工作基础上，选用不同溶剂、在不同条件下分别溶解柞蚕丝素纤维，寻找 制备再生柞蚕丝素蛋白的较可行方法；研究再生柞蚕丝素蛋自溶液的分子构象及 其变化规律：进一步，制备柞蚕丝素多孔材料，从理论上分析和探讨制备工艺条 件与多孔材料豹结构、理化性能之间豹关系，获得控制多孔材料结构、性能的方 法，为后续的应用研究提供理论和实验依据，为组织工程支架、药物控制释放载 体等生物材料的研制和开发提供一种新的途径。 对于生物医用多孔材料。除了其化学性能外，多孔材料的物理性能如孔隙 牢、孔尺寸、比表面积等也非常重要。目前。有很多成孔方法，如纤维粘结法、 三维印刷法等，但它们都有各自的缺点。如纤维粘结法不能调：铃孔的尺寸和孔隙 率，三维印刷法限制了支架对生物活性物质的加载。 冷冻干燥法是一种较为温和的干燥和材料制备方式，它是利用冷冻后溶剂的 减压升华的原理而制备多孔材料的一种方法。这种成孔方法有利于减小蛋白质的 变性程度，而且能够获得结构巯松，内部孔相互贯通的多孔材料，并且可以通过 改变工艺条件来控制孔结构参数，因此冷冻干燥法是制备柞蚕丝素多孔材料的可 行手段。 围绕奉课题的研究目标，本文第一章首先对柞蚕丝素纤维的溶解特性进行研 究，力求：i 找溶职柞蚕丝豢纤维的合适途径。第二章对再生柞蚕丝索溶液的性质 i i 川+ 1 盘蝣艏9 4 l 利利的制赫及j t 甜构 进行：f j ) 究，探讨卡1 ；蚕丝索纤维溶解前后的大分子结构变化情况，为制备杵蚕丝索 蛋i ，i 多孔材料打f 基础。第三章在不同的工艺条件f 采用冷冻f 燥法制备柞蚕丝 豢多孔材料，研究冷冻温度以及溶液浓度等工艺条件对多孔材料形态结构及凝聚 念结构的影响，为控制多孔材料的结构参数提供依据。第四章对一i 同工艺条件卜 制备的卡1 ：尘丝索多孔材料的理化性能进行测试和分析，探讨制备工艺条件与多孔 材料理化性能的关系。 6 牛柞盘蝗索多孔榭料的制蔷及j e 结构；尊柞盘鳇索纤维的溶解 第一章柞蚕丝素纤维的溶解 一、材料与方法 1 实验材料 无水碳酸钠，无水氯化钙，无水乙醇，网水合硝酸钙，氢氧化锂，硫氰酸铵， 虢酸等，均为分析纯。 柞蚕生丝购自辽宁省丹东市。 2 实验器材 k q 一8 0 0t d e 型高频数控超声波清洗器、c s i o 卜2 e b 电热鼓风干燥箱、8 卜2 掣 磁力恒温搅拌器、医用氧气包等。 3 实验方法 3 1 丝素纤维脱胶 将l o o g 柞蚕生丝放入2 5 9 l 的碳酸钠溶液中，9 8 1 0 0 2 2 处理三次，前两 次用自来水，每次处理3 0 m i n ，第三次用去离子水，处理4 5 分钟。脱胶后洗净、 拉松，烘1 二备用。 3 2 柞蚕丝素纤维含水率的测定 精确称量脱胶后柞蚕丝素纤维的重量，1 4 0 1 4 5 c 烘至恒重，称得于餐，依 式( 1 ) 计算得到纤维含水率为1 4 5 。 含槲咖堕絮煞箱笋圳。 3 3 柞蚕丝素溶液的制备 3 3 1 氯化钙溶解柞蚕丝素纤维 配制1 l m o l l 的氯化钙溶液，分别于t 0 0 、7 0 c 、4 0 c 溶解柞蚕丝素纤维， 浴比l ：3 5 ，l 小时后取出，滤出未溶解的残留柞蚕丝素纤维，1 4 0 。c 烘至恒重， 称得干最，依式( 2 ) 计算得到柞蚕丝素纤维的溶解率。 溶解和，= 墅警掣圳。 豫干量( 2 ) 3 3 2 氯化钙和乙醇的混合溶液溶解柞蚕丝素纤维 在1 l m o l l 的氯化钙溶液中，按氯化钙和乙醇的摩尔比分别为1 ：l 、1 ：2 、 1 ：3 加入乙醇，于7 0 c ，浴比l ：3 5 ，溶解柞蚕丝索纤维1 小时。滤未溶斛 牛仆盘封采多扎柯科的：f d 桥驶“ 构讹 0 柏盘种射纤维的浒斛 的柞虫丝索纤维。1 4 0 烘至恒重，称得千量，依式( 2 ) 计算得到柞蚕丝素纤维 的溶解牢。 3 3 3 硝酸钙溶解柞蚕丝素纤维 将明水合硝酸钙熔融，分别在1 0 0 、7 0 c 、4 0 c 溶解柞蚕丝索纤维，浴比 l ： 5 ，l 小时后取j u ，滤出末溶解的柞蚕丝索纤维，1 4 0 ( 2 烘至恒重，称得，f ：晕 依( 2 ) 计算得到柞蚕丝素纤维的溶解率。 3 3 4 硫氰酸锂溶解柞蚕丝素纤维 往1 0 m o t 的氧氧化锂中加入1 0 m o l 的硫氰酸铵，并加入1 0 0 9 过昂的硫氰酸 饺，7 0 cf 搅拌6 小时，然后将液态的反应产物倒入烧瓶中，1 2 0 。cf 氮气保护， 蘸馏6 小时，冷却后得到的产物在本文中作为硫氰酸锂试剂使用。 配制刁i 同浓度的硫氰酸锂溶液，调节p h 值至7 8 ，4 0 c 下溶解柞蚕丝素纤 维l 小时，浴比1 ：3 5 ，滤出未溶解的柞蚕丝素纤维，1 4 0 ( 2 烘至恒重，称得干量， 按式( 2 ) 计算溶解率，并绘制溶解率一时间曲线。 选择溶解率较小的硫氰酸锂浓度，将纤维放入硫氰酸锂溶液中，用超声波处 理4 i 同时间后再溶解，研究超声波处理对柞蚕丝素纤维溶解的影响。 二、结果与讨论 由表1 可见，用氯化钙溶液溶解柞蚕丝素纤维，1 0 0 * c 时丝索纤维的溶解效 果相对较好，但也只有1 3 3 的溶解率，说明氯化钙溶液并不是柞蚕丝素纤维的 良好溶剂。 表l ：氯化钙在不同温度下对柞蚕丝素纤维的溶解率 表2 ：加入不同量乙醇的氯化钙溶液对柞蚕丝素纤维的溶解率( 7 0 c ) 氯化钙：乙醇( 摩尔比)1 ：l1 ：21 ：3 溶解率( )1 4 11 3 51 3 7 厶孵赴诤f l j n 速迁移试剂，能够促进溶剂向丝素大分r 问扩散、渗透。剥比 小柞鱼她糸# 扎村科的捌笛厦j e 结构 弧龋杓盘蝗采纤维f 仃蝌斛 表i 、表2 町见，在氯化钙溶液中加入乙醇后，柞蚕丝素纤维的溶解率增夫，说 叫乙静能促进丝素纤维的溶解，但促进的程度很有黻。氯化钙和乙醇雎尔比为l ： l | h 柞螽丝索纤维的溶解率最大，但其值仍很小，显然氯化钙和乙醇的混合溶液 也巧；是柞蚕丝素纤维的良溶剂。 表3 ：硝酸钙在不同温度下溶解柞蚕丝素纤维的溶解率 从表3 可以看出。温度对硝酸钙溶解柞蚕丝素纤维影响很大，温度越高则溶 解率越大，1 0 0 时纤维能够被全部溶解。 1 0 0 拿8 0 爵6 0 琏4 0 缝2 0 0 05 1 01 52 02 53 03 5 溶解时间( m i n ) 图1 ：硝酸钙1 0 0 c 溶解柞蚕丝素纤维的溶解率一时间曲线 图l 的溶解一时问曲线可以看出，纤维加入熔融硝酸钙的前五分钟溶解相对 较快，以后则溶解得相对平稳，3 0 分钟后纤维全部溶解。 表4 ：不同浓度硫氰酸锂溶液4 0 c 溶解柞蚕丝素纤维的溶解率 表5 ：1 6m o l l 的硫氰酸锂溶液溶解溶解柞蚕丝素纤维的溶解率 袭4 、表5 反映了硫氰酸镁浓度以及溶解温度对柞蚕丝素纤维溶解率的影响。 r 她，“1 硫氰酸镪浓度为1 6m o l l 时4 0 c 就能将柞蚕丝素纤维充个溶解，蜕明 9 个 1 全神采多f l 村科船制舒及j e 缔构讹 争枘盘地最 r 绁的浒辫 硫氰酸锂浓溶液能够有效地拆散柞蚕丝素大分子间的结合力。 表6 ：超声波处理对溶解率的影响 处理时间( 分) 溶解率( ) 0 4 3 1 1 5 4 7 。3 3 0 5 8 7 4 5 6 8 0 超声波等对面筋等蛋白具有增溶作用”“。将柞蚕丝素纤维放入1 2 5m 0 1 l 硫氰酸锂溶液中，用超声波处理不同时间后再放入磁力搅拌器中继续溶解溶解 结粜如表6 所示。随着超声波处理时间的增加，纤维在硫氰酸锂溶液中的溶解率 也随之增大，处理4 5 m i n 后溶解率由4 3 1 增大到6 8 o ，说明超声波处理确实 能够促进柞蚕丝索纤维的溶解。 ；1 ： 强 0 01 02 0 3 04 05 06 07 0 溶解时间( r a i n ) 图2 ：1 6m o l l 硫氰酸锂溶液4 0 溶解柞蚕丝素纤维的溶解率一时间曲线 圈2 是硫氰酸锂溶液溶解柞蚕丝素纤维的溶解率一时间曲线。与熔融硝酸钙 溶解相比，用1 6m o l l 硫氰酸锂溶液虽然完全溶解所需时间较长，但其溶解所 需温度较低，两者各有所长。 三、本章结论 1 、柞蚕丝索纤维的溶解受溶刹种类、浓度及溶解温度的影响较大。 2 、氯化钙及其与乙醇的混合溶液都不是柞蚕丝素纤维的良溶剂。 3 、硝酸钙和硫氰酸锂都能有效地溶解柞蚕丝素纤维，其中硫氰酸锂溶液在4 0 c 就能将柞蚕丝索纤维全部溶解。 4 、，噎声波处理能够在4 定程度 j 促进柞蚕丝紊纤维的溶解。 中h 盘鲐求# 扎村 ：| 的制格及j e 结丰句铘啦 l f m 柞盘蝉豢蚩i i j _ f 液的代质 第二章再生柞蚕丝素蛋白溶液的性质 一、材料与方法 1 实验材料 无水碳酸钠，网水合硝酸钙，硫氰酸锂，柞蚕丝素纤维 2 实验仪器 j 一7 1 5j 弘圆一：色仪( i _ 本j a s c om o d e l 公司) 、d m a x 一3 c 型全自动x 一射线衍 射仪( 1i 本理学电机株式会社) 、n i c o l e ta v a t a r i r 3 6 0 型傅立叶变换红外光谱 仪( 美吲n i c o l e t 公司) 、v i r t i sg e n e s i s2 5 一l e 型冷冻干燥机( 美国v i r t i s 公州) 、l k b 聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳仪( a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公 r 1 j ) 、l a b r a m 一1 b 型显微拉曼光谱仪( 法国d i l o r 公司) 、a v a n c e 核磁共振仪( 德 陶b r u k e r 公嗣) 3 实验方法 3 1 再生柞蚕丝素蛋白溶液的制备 将脱胶后的柞蚕丝素纤维放入熔融硝酸钙溶液中，浴比1 ：1 0 ，1 0 5 溶解5 小时，取出装入透析袋( 截留分子量1 4 0 0 0 ) ，自来水透析4 8 h ，去离子水透析 4 8 h ，即得浓度约3 的再生柞蚕丝素溶液。 将脱胶后的柞蚕丝素纤维加入1 6 m o l l 硫氰酸锂溶液中，浴比l ：1 0 ，4 0 。c 溶解l 小时，取出装入透析袋，自来水透析4 8 h ，去离子水透析4 8 h ，即得浓度 约3 的再生柞蚕丝素溶液。 3 2 电泳 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，测定硫氰酸锂和硝酸钙溶解所得再生柞蚕丝素 的分子量分布。采用碱性不连续系统，凝胶聚合采用过硫酸铵一t e m e d 倦化系统， 电极缓冲液为t r i s 一甘氨酸缓冲液( p h 8 3 ) ，以十二烷基硫酸钠( s d s ) 为解离 剂，考马斯亮兰r 2 5 0 染色，溴酚蓝( b p b ) 为前沿指示剂。电泳开始时电流 i o w a ，3 0 分钟后电流调高到3 0 m a 。电泳后轻轻将胶剥离，放入固定液固定3 0 6 0 分钟，然后放入染色液染色1 2 小时，再放入脱色液将底色完全脱去，即可清 晰霸到各条蛋1 质谱带。标准分子量样品溶液加2 0pl ，硫氰酸锂溶解的丝素溶 液加4 0 i l ，硝酸钙溶解的丝素溶液加l o ul ，每2 5 0ul 样品液中加l oul 前沿 指爪刺。分离胶聚合4 小时，浓缩胶聚合1 2 小时。各贮液配制荔i 卜所示： 巾柏：盘持求# 扎村科们制备及儿结构 第蠢“乍柞盘圭圣_ 求生fj 溶液的儿质 分离胶浓缩胶电极缓冲液 贮液配制体积比贮液配制体积比旷：液 l h c l4 8 m 1 l h c i4 8 m i t r i s3 6 3 9 1 2 5t r i s5 9 8 91 2 5 加i l o 到l o o m l加h “o 到l o o m l p h8 9p h6 7 t r i s6 9 a c r3 0 9a c r3 0 9甘氨酸 b i s0 8 92 5 0b i s0 8 9l 0 02 8 8 9 衄jh ! o 到l o o m l加也o 到1 0 0 m i加h 抑到l l s d s ( 1 0 )o 1 0s d s ( 1 0 )o 1 0 s d s ( 1 0 ) t e m e d 0 0 0 5 t e h i e d 0 0 0 5 p h8 3 h 到9 9 5h 2 0 7 5 4 a p ( 1 0 )o 0 5a p ( 1 0 )o 1 0 汁：t r is 为二二羟甲基氨基甲烷，f i c r 为丙烯酰胺b i s 为甲叉双丙烯酰胺 p 为过硫酸胺。 固定液染色液脱色液 三氯乙酸5 7 0 9考马斯亮蓝r - 2 5 01 2 5 9乙醇 1 5 0 0 m l 磺基水杨酸1 7 0 9甲醇2 3 0 m 1乙酸 s o o m l 甲醇 1 5 0 m l乙酸2 3 0 m i加也o 到5 0 0 0 m i 加h 扣到5 0 0 m l加h 如到 5 0 0 l n l 3 3 圆二色光谱 将硫氰酸锂、硝酸钙溶解的柞蚕丝素溶液分别稀释至0 0 1 w t ，用n - 色仪 测定远紫外区1 9 0 2 5 0 n m 的圆二色光谱灵敏度2 0 m d e g 。速度1 0 0 n m m i n 。 3 4 激光拉曼光谱 用显微拉曼光谱仪绘制拉曼光谱，激发光波k6 3 2 8 n m ，背散射方法，缝宽 1 0 0t tm ，固体样品扫描时间为2 0 0 秒，溶液样品扫描时间为8 0 0 秒。 3 5 核磁共振 j | j 核磁共振仪测定“c p m a s ( 固态交义极化魔角旋转技术) 核磁共振谱， 牛柞盘弹采g i l 4 科的：埘* 殷j 纠j 构挪啊卅l 塑堂氅堂出生堕丝塑丛竺 接触| 卜f 1 1 i l1 o m s ，脉冲蘑复时间2 s 。 3 6 凝胶化 3 6 1 凝胶化时间 配制4 i 同浓度的再生柞蚕丝素溶液( 硫氰酸锂溶解) ，凋节p h 值到7 0 ，住 4 i 嘲温度f 静置，研究凝胶时间与环境温度的关系。 将再生柞蚕丝素溶液调节到不同的p h 值，2 5 c 。f 静置，研究凝胶时间与p h 值的关系。 3 6 2 胶凝后结构的变化 3 6 2 1x 一射线衍射 将弭生柞蚕丝索溶液及其凝胶冷冻干燥2 4 4 8 h ，得到固态冻干膜和冻于粉 末。使用全自动x 一射线衍射仪，c u k 。射线，在管电压4 0 k y 、管电流4 0 m a 、扫描 速度2 。m i n 的条件下，记录得到2o = 5 。4 0 。问的衍射强度曲线。 3 6 2 2 红外吸收光谱 用傅立叶变换红外光谱仪，将样品反复剪碎，过筛选出粒径小于4 0 “m 的微 粒，k b r 压片制样，得到丝素溶液冻干膜和冻干粉末的红外吸收光谱。 二、结果与讨论 1 电泳 测量各种己知蛋白质以及前沿指示剂在泳道中的移动距离，即圳算m 相应的 r 值( 见式3 ) 。根据标准分子量蛋白质的r ，值可以得到r 。一l g ( m w ) 标准陆线。 测：最丝素蛋白质在凝胶柱中的移动距离，由一元回归方程即得分子量大小。 r = 蛋白质的移动距离溴酚兰的移动距离( 3 ) 表7 ：标准蛋白质样品的分子量及其r 值 分了带( k 1 ) ) 2 0 01 5 01 2 01 0 08 57 0 1 9 ( m w ) 5 3 05 1 85 0 854 9 34 8 5 r ，0 1 5 0 1 9 o 2 4o ，3 l0 3 70 4 2 分j 7h t ( k d ) 6 05 04 0 ：j 0 2 52 0 l z ( m w )1 7 8d 7 04 6 04 4 81 1 04 ： 0 i o 5 2o 5 90 6 7o 8 70 9 3o 9 8 坐：生丛堡竺壅乡f l p 科的糊备及接结构第拳阿，拄丰l ：盘螋豢出rj 溶液的代质 5 5 75 盎 叠4 5 望4 3 5 00 20 40 50 8 1 r f 图3 ：r r _ l g ( m w ) 标准曲线 图4 ：再生柞蚕丝素蛋白质的电泳图谱 ( a ) 标准蛋白质样品，f e r m e n t a s 公司，分子量范围l o k d a 2 0 0 k d a ：( b ) 硝酸钙 溶解得到的柞蚕丝素蛋白质：( c ) 标准蛋白质样品，a m e r s h a mp h a r m a c i a b i o t e c h 公司，分子量范围1 4 4 k d a 9 7 k d a ；( d ) 硫氰酸锂溶解得到的柞蚕丝素 蛋门质。 “乍丰17 盘钟采多扎料纳：埘衙殷_ i l ；结构 第一冉卜杵盘缱采篮n 矫坡的悱赝 i 扯罔4 吖地，再生柞蚕丝素的电泳图谱在2 0 k d a 至t 0 2 4 k d a 之问其有连续 的潜带，表明再生柞蚕丝素由不同分子最的多肽组成据报道，直接从柞蚕后部 丝腺取 的天然丝素蛋白质的分子量为2 1 6 k d a “i 。可见，无论是用硝酸钙溶液 还足用硫氰酸锂溶液溶解柞蚕丝素纤维，都在一定程度j 二破坏了丝素蛋臼大分子 蕾：链的共价键，使丝素蛋白发生了一定程度的降解。硝酸钙溶解的再生丝索分f 颦在2 4 4 k d a 和4 6 4 k d a 存在相对密集的分布，而硫氰酸锂溶解的再生丝索溶液 分f 量则t 要分布在2 6 3 k d a 、4 5 3 k d a 和6 7 3 k d a 附近。因此，可以看出，硝 酸钙存溶解柞蚕丝索的过程中对丝素大分子破坏程度比硫氰酸锂人。 2 圆二色光谱 3 0 2 5 2 0 1 5 l o e 5 0 - 5 一l o 1 5 2 0 1 9 02 0 02 1 02 2 02 3 02 4 02 5 0 波长( m ) 图5 ：不同溶剂溶解所得的再生丝素溶液圆二色光谱 蛋白质的c d 光谱一般分为两个波长范围：1 7 8 2 5 0 n m 为远紫外区c d 光谱， 2 5 0 3 2 0 n m 为近紫外区c d 光谱。其中，远紫外区c d 光谱反映肽键的圆二色性。 存蛋1 1 质或多肽的规则二级结构中，肽键是高度有规律排列的，排列的方向性决 定了肽键能级跃迁的分裂情况。因此，具有不同二级结构的蛋白质或多肽所，“：生 c di = i ! 譬。淞的位置、吸收的强弱都不相同i 。 用硫氰酸锂和硝酸钙溶解的柞蚕丝素溶液c d 光谱相似，在2 0 7 n m 、2 2 1n m 附 i i 乍+ 1 ：盘神崇爹扎村科的捌箭及j e 纬构 第0 牛杵盘神求出i i 溶液的r i j 顷 近m 现负的强吸收峰，说明存在a 一螺旋结构。在2 1 5 n m 附近出现相对较弱的负 | 1 及收峰，说明存在1 3 一折裢结构，谢图中吸收峰的强度略有麓异。按圆：色光谱 经计算所得的蛋n 质构象百分组成如f ： 表8 ：不同溶剂溶解的柞蚕丝素蛋白构象的组成( ) l i s c n 溶解 c a 一唑! ! ：整缝 羔二堡蛑。旦二近量 。无姆鲞曲 3 1 2 2 8 2 2 6 1 2 7 9 4 2 8 4 3 9 从图5 和表8 可以看出，用硫氰酸锂和硝酸钙溶解的柞蚕丝素都含有无规卷 曲、o 一蝶旋和b 一折叠结构，且所占百分含量相差不大，用硝酸钙溶解的柞蚕 丝索a 一螺旋结构的含量略少。 3 拉曼光谱 激光拉曼光谱能够显示蛋白分子中肽键、主链骨架以及侧链的特征性振动， 根据肽键的特征拉曼峰可以分析蛋白质分子的构象特征i 。在激光拉曼光谱中， 1 7 0 0 c m 。以下各个酰胺特征峰与蛋白质的分子构象有密切的关系，下表为特定蛋 白质构象的拉曼谱带| 。 表9 ：蛋白质构象的酰胺拉曼特征谱带( c m 。) 酰胺i 1 6 6 5 一1 6 8 0 1 6 4 5 - 1 6 5 8 1 6 6 0 一1 6 6 6 1 3 一折砬 a 一螺旋 无规卷曲 其他炙敏蜂 1 0 2 0 一1 0 6 0 1 0 8 5 8 9 0 9 4 5 11 0 3 一1 1 0 8 ( a ) 1 6 一粥咖罴豢 i 耳乍件盘钟最多扎村抖的橱挤腱结构 第：尊冉小柞盘始崧生i7 i 溶澉的竹质 ( b ) ( c ) 图6 ：激光拉曼光谱( a ) 柞蚕丝素纤维( b ) 硫氰酸锂溶解( c ) 硝酸钙溶解 柞蚕丝素纤维( a ) 在1 0 4 8 1 3c m 。、1 2 3 5 8 0c m 、1 6 6 6 8 3c m 、1 6 7 7 7 5 c m 处的峰说明具有大量b 一折叠结构，在9 0 3 9 2c m l 、9 4 6 1 8c m - 、1 3 0 5 0 7c m - 、 1 6 5 3 4 8c m1 处存在峰，说明具有n 一螺旋结构。用硫氰酸锂溶解后的图谱上， 1 2 5 2 9 9 c m 、1 2 6 1 6 6 c m 处的峰说明山现了无规卷曲结构。用硝酸钙溶解后的 心小柞鱼神索茹扎村料的；埘貉殷j c i i i 构