（内科学专业论文）prdm1与rb相互作用对细胞周期调控的影响.pdf

南开大学学位论文使用授权书 j u li ii ii ii i ii ii i iiiiii y 1813 8 0 8 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位 获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文 ( 包括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论 文，并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将 公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检 索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向 教育部指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和 中国学术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文 数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答 辩；提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 錾值 2 0 1 0 年6 月9 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目p r d m l 与r b 相互作用对细胞周期调控的影响 2 0 1 0 年5 月2 4 姓名张倩学号 0 3 1 1 2 0 5 答辩日期 日 论文类别博士口学历硕士口硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系所 医学院专业临床医学 联系电话 1 3 8 1 1 7 5 2 0 9 9e m a i l n a n k e d o u d o u 1 2 6 c o m c n 通信地址( 邮编) ：北京市海淀区复兴路2 8 号解放军总医院血液科实验室1 0 0 0 8 5 3 备注：是否批准为非公开论文否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位 获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 5 0 k d 的可以选用3 5 0 m a ，小片段的可以用2 5 0 m a ) ( 转印后，凝胶上应不残留或残留很少的蛋白。可以在转印后进行染色进行检测。 转移出凝胶的蛋白应该仅在接触凝胶的膜的一面可见。如果有怀疑，在转印时 使用第二个“支持膜”，你可以在转膜后染色，以检查是否有穿膜的迹象。) 五免疫检测 1 、封闭： 一般在室温下2 h 就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶， 因为牛奶中含有生物素，用b s a 效果更好。 2 、一抗与靶蛋白的结合 封闭的膜用p b s t ( t b s t ) 漂洗2 3 次。 将加样槽洗涤干净，用蒸馏水润洗，晾干，将膜用一次性手套覆盖好，按标 记和实验设计切下膜条( 一般为3i l l m 宽左右) 按顺序置于加样槽中，作好实验 记录，加入相应的一抗约l m l ，注意保证膜的所有部分同溶液接触。 室温下于摇床孵育2 h 或4 过夜。 弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2 3m l p b s t ，上摇床洗涤洗涤 5 1 0 m i n ，换液，反复4 次。 3 、酶标记二抗与一抗的结合 根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度( 用含0 5 脱脂奶粉的 p b s 稀释) ，每个加样槽中加入二抗l m l 左右室温下于摇床孵育1 h 或4 。c 过夜， 注意保证膜的所有部分同溶液接触。 弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2 3m l p b s t ，上摇床洗涤洗涤 5 1 0 m i n ，换液，反复4 次。 2 6 研究方法 六、显影： 1 、将a 和b 两种试剂在保鲜膜上等体积混合；l m i n 后，将膜蛋白面朝下与此 混合液充分接触；l m i n 后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入x 光片夹中。 2 、在暗室中，将l 显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出x 一光片， 用切纸刀剪裁适当大小( 比膜的长和宽均需大l c m ) ；打开x 光片夹，把x 一光 片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上x 光片夹，开始计时；根据信号的 强弱适当调整曝光时间，一般为l m i n 或5 m i n ，也可选择不同时间多次压片，以 达最佳效果；曝光完成后，打开x - 光片夹，取出x 光片，迅速浸入显影液中显 影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1 一- - 2 m i n ( 2 0 - - - 2 5 ) ， 温度过低时( 低于1 6 ) 需适当延长显影时间；显影结束后，马上把x 光片浸 入定影液中，定影时间一般为5 1 0 m i n ，以胶片透明为止；用自来水冲去残留 的定影液后，室温下晾干。 ( 应注意的是显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶 片，否则会对结果产生影响) ( h l 冲标记的二抗孵育完后用t b s t 充分清洗，然后加e c l 试剂，包好后压片， 一般如果你能够看到荧光的话，压片5 m i n 以内就可以看一下，如果看不见的话， 直接压半小时吧。暗室中压片，压片完后显影、定影、水洗，就可以了。要是 对曝光时间没有把握，可以一次叠两张胶片，相当于做个梯度。) 2 7 研究方法 实验结果 第三章实验结果 第一节s i r n a 的细胞转染率和对r b 基因的敲除效率的测定 运用q i a g e n 公司的h i p e r f e e tt r a n s f e c t i o nr e a g e n t 转染试剂，向生长状态良 好的h e l a 细胞中转染含f i t c 黄绿色荧光标签的无关s i r n a 双链寡核苷酸 ( s i n s f i t c ) ，未经转染的h e l a 细胞作为阴性对照，4 8 小时后回收细胞，用流式 细胞仪检测细胞的f i t c 阳性标记率，用以判断s i r n a 对该细胞的转染效率， 如图3 1 所示，无关s i r n a 的转染效率可达7 9 3 。符合实验所需转染率。 将特异性针对r b 基因的s i r n a ( s i r b ) 转染至生长良好的h e l a 细胞内， 4 8 小时后回收细胞，用蛋白裂解液裂解细胞后行w e s t e r nb l o t 蛋白电泳观察r b 蛋白的敲除率，如图3 1 所示，在w e s t e r n 电泳结果上显示s i r b 对r b 的敲除 效果显著。 o 猫瑚湖鼬锕， f 3 瀚嘲 e o n t r o is i - n ss r b 麴鳜鳓缓鳜荔溉渤；自鳜r b v 绷绷_ 觏_ 黔硼- 懒t u b u l i n 图3 1s i r n a 的细胞转染率和对r b 基因的敲除效率的测定。 实验结果 第二节p r d m lq 与p r d m l1 3e d n a 表达质粒在细胞中的转染效率 l的测定 i 以q i a g e n 公司的e f f e c t e n et r a n s f e e t i o nr e a g e n t 试剂，分别向生长良好的 h e l a 细胞中转染含g f p 荧光蛋白标签的空载体、含g f p 荧光蛋白标签的p r d m l qe d n a 表达载体、以及含g f p 荧光蛋白标签的p r d m lbc d n a 表达载体，4 8 小时后回收细胞，用流式细胞仪进行检测g f p 阳性率，用以判断其转染效率， 如图3 2 所示，含g f p 荧光蛋白标签的空载体的转染效率为7 2 9 9 ，含g f p 荧 光蛋白标签的p r d m lq 质粒转染效率为5 6 0 3 ，含g f p 荧光蛋白标签的 p r d m l1 37 0 9 9 。质粒转染效率均符合本实验所需转染率。 n e g a t i v e l v e c t o r - g f p l a g f p b - g f p 图3 2p r d m iq 与p r d m l1 3 表达质粒在h e l a 细胞中的转染效率的测定。 第三节r b 基因敲除后p r d m lq 对细胞周期调控的影响 分别在长势良好的肼h e l a 细胞中转入无关s i r n a 和s i r b ，4 8 小时后再 向上述两种细胞中分别转染p r d m lqe d n a 表达载体以及空载体，3 6 4 8 小时 3 0 昭匾弱? 匾 玉剖， 昏戥蜊t铡引m 8导跽2。 昌导嚣暑。 囡_囡_园。囫一 实验结果 后回收细胞，p i 染色，流式细胞仪检测细胞周期变化。结果显示：r b 未敲除组 ( s i n s 组) 中，转入空载体的细胞g 1 期比例约占4 9 3 3 ，转入p r d m lqc d n a 表达载体a 的细胞g 1 期比例约占6 6 1 0 ；在i 曲敲除组( s i r b 组) 中，转入空 载体的细胞g 1 期比例约占4 5 4 6 ，转入p r d m lqe d n a 表达载体a 的细胞g 1 期比例约占3 6 5 5 ，进行4 次独立的重复试验，取平均值和标准差，将g 1 期 的细胞比例变化做柱状图分析，如图3 4 所示。结果：p r d m lq 可以阻滞细胞 周期于g 1 期，转入无关s i r n a 后p r d m lq 对细胞周期g 1 期的阻滞作用几乎 没有影响，转入s i r b 敲除r b 后p r d m la 对细胞周期g 1 期的阻滞作用消失。 n s - - v e c t o r n s - a l p h a s j r b - v e c t o r s i r b - a l p h a 图3 3 流式细胞仪( p i 染色法) 检测r b 基因敲除前后，p r d m ld 对h e l a 细胞周期的影响 3 1 实验结果 碧黼“锎懒_ _ 愀蝴麟洲”确删a e t i a va v a v 俚 w ts j - n ss i - r b 图3 4r b 基因敲除前后，p r d m lq 对h e l a 细胞的g 1 期比例的影响 第四节r b 基因敲除后p r d m l1 3 对细胞周期调控的影响 分别在长势良好的r b + h e l a 细胞中转入无关s i r n a 和s i r b ，4 8 小时后再 向上述两种细胞中分别转染p r d m l1 3c d n a 表达载体以及空载体，3 6 4 8 小时 后回收细胞，p i 染色，流式细胞仪检测细胞周期变化。结果显示：r b 未敲除组 ( s i n s 组) 中，转入空载体的细胞g 1 期比例约占4 9 3 3 ，转入p r d m lqc d n a 表达载体a 的细胞g 1 期比例约占6 6 1 0 ；在r b 敲除组( s i r b 组) 中，转入空 载体的细胞g 1 期比例约占4 2 0 9 ，转入p r d m lqc d n a 表达载体a 的细胞g 1 期比例约占4 5 0 1 ，进行4 次独立的重复试验，取平均值和标准差，将g 1 期 的细胞比例变化做柱状图分析，如图3 4 所示。结果：r b 基因敲除前后，p r d m l 1 3 在h e l a 细胞中的表达均不导致细胞周期g l 期的阻滞。 3 2 实验结果 n s - v e c t o rn s - b e t a o “ # o ” 瓣掣“一 j乏一 霸q 讳特铭气 乙彳 s i r b - v e c t o r s i r b - b e t a 抛口，0 张孵# ， h 。】 图3 5r b 基因敲除前后，p r d m i1 3 对h e l a 细胞周期的影响 黝黪獭瓣渤鳜鞘麟 、，：贴 c * ：麟瓣麟蝴蠓瓣l a c t i n v 1 3 w ts i - n s s i - r b 图3 6r b 基因敲除前后，p r d m l1 3 对h e l a 细胞的g 1 期比例的影响 3 3 实验结果 第五节p r d m l 对r b 蛋白磷酸化的影响 分别在长势良好的r b + h e l a 细胞中转入含空载体的质粒，含p r d m lqc d n a 的质粒和含p r d m l1 3c d n a 的质粒，w e s t e r nb l o t 蛋白电泳法检测r b 蛋白的磷 酸化状态。结果显示：p i m m lq 的表达可诱导非磷酸化r b 蛋白即活化状态r b 的增加，而p r d m i b 无上述作用，迸一步揭示了p r d m la 和r b 相互作用参与 细胞周期调控的分子机制。 v e c t o r a l p h a b e t a 彩印垆秒秽矿7 獬钟伽矿：一篇缈：一：“缈r 掣一吖笮鳃鼍 鳓掣妒弼紫絮锈 i 黼彬瓣| 一4 - r b p r b # 帮j ：u 秒j ? ? 。 ”。”? 。锄1 ”“r j 8 鼍 勃绷嬲麟嬲黼，。瓣纩锄嬲獭鳓黼嘲嬲嘲a c t i n j 锰。i i 。j 。j 。? 磊 图3 7p r d m l 对r b 蛋白磷酸化的影响 讨论 第四章讨论 第一节p r d m l e t 与p 蛋白结构的差异决定了他们功能的差异 p r d m l 蛋白是b 细胞向浆细胞分化过程中最重要的转录抑制因子之一。最 初p r d m l 蛋白首先在b 细胞系中发现并且被认为是b 细胞终末分化过程中的 关键调控子。后来研究发现，p r d m l 在多种细胞的终末分化过程中都扮演了重 要角色。p r d m l 蛋白共有3 个主要的结构域。其中，p r 结构域是在所有p r d m 家族成员中的保守位点。p r d m l 基因所在的p r d m 家族的成员有一个共同特 征，就是可以表达两种蛋白产物，一种含有p r 结构域，一种不含p r 结构域。 有证据表明这种结构的差异和相关肿瘤的发生发展关系密切。我们的实验解释 了在p r d m l 的两种蛋白产物中这一结构差异可能带来的影响。 4 1 1p r d m l 的表达与主要靶基因 p r d m l 蛋白是b 细胞向浆细胞分化过程中最重要的转录抑制因子之一。它 是一种具有转录抑制因子功能的含锌指结构蛋白。它由p r d m l 基因编码。 最初p r d m l 蛋白首先在b 细胞系中发现并且被认为是b 细胞终末分化过 程中的关键调控子。在体内，p r d m l m r n a 表达在所有的长寿命和短寿命浆细 胞和一种表达浆细胞标记的生发中心b 细胞亚型中 8 】。基因靶向的方法分析显 示，从浆母细胞分化成为浆细胞到长寿命浆细胞( l l p c s ) 的过程中要求p r d m l 的水平相应的增长。非周期静止的脾脏和骨髓浆细胞显示最高水平的p r d m l 表 达 9 1 。这与p r d m l 在b 细胞终末分化过程中的重要作用是一致的。但是目前的 证据发现p r d m l 的表达不仅局限在b 细胞系内。p r d m l 蛋白也在t 细胞，粒 细胞，巨噬细胞，上皮细胞，视网膜神经细胞，生殖细胞，和肌肉细胞等终末 分化的细胞中都有表达 1 0 - 1 5 j 。这些证据显示p r d m l 在多种细胞的终末分化过程 中都扮演了重要角色。这提示很可能p r d m l 在发育与分化过程中更趋向于一个 关键的“守门者( 门基因) ”进而引起了全世界学者的兴趣。 我们的研究揭示p r d m l 蛋白很可能通过诱导细胞周期中与r b 通路相关的 一些关键的调控子抑制细胞增殖。这些研究可能会帮助我们了解更多在终末分 化过程中p r d m l 蛋白作用的逻辑细节，也提示我们缺少p r d m l 蛋白可能会引 起肿瘤形成过程中的细胞周期调节失控。 3 5 讨论 终末分化是一种，使细胞获得生物效应功能并最终退出细胞周期的多步骤 过程。已经有人对p r d m l 在b 细胞系终末分化中的作用进行了详细的研究。 早期研究显示了一批被p r d m l 抑制的直接靶基因，包括c m y c ， m h ci i 类反 式激活子( c i i t a ) ，p a x 5 1 1 6 - 2 0 l 。但是仅抑制这些基因难以解释p r d m l 引起的整 个浆细胞发展过程的活化。如，c m y e 基因是m y e 基因家族的重要成员之一，它 与多种肿瘤发生发展有关。但是c m y c 在细胞周期中的调控作用是有争议的， 在无限增殖化细胞中过表达c m y e 可以促进细胞增殖，而在原代培养细胞中过 表达c m y c 会引起细胞周期停滞。而且研究表明，c m y c 的缺失不足以阻滞细胞 周期，因为c m y e 阴性的细胞仍然可以迅速增值【2 引。 4 1 2p r 结构域和p r d m 家族 p r d m l 蛋白共有3 个主要的结构域，一个位于碳末端由5 个c 2 h 2 锌指位 点组成的锌指结构域，一个在锌指区的氮末端的脯氨酸富集区结构域，还有一 个在所有p r d m 家族成员中均具有的保守的p r 结构域。目前，p r d m l 每个结 构域的功能尚不清。头两个锌指结构域为序列特异性的d n a 绑定区。脯氨酸富 集区与诱导凋亡相关。p r d m l 还具有募集多种染色体修饰蛋白如g 9 a ，h d a e l ， h d a c 2 和转录共抑制子g - r o u c h o 的潜能，因此产生了在细胞分化中有基因沉默作 用的调控复合物【3 7 3 引。但是这些作用都与p r 结构域无关。 p r 结构域是在所有p r d m 家族中的保守位点。p r d m l 所在的p r d m 家族 的成员各自有着不同的生物学功能，也分享着一些共同特征。现在已知的p r d m 家族成员有1 6 个，所有已知成员的基因都定位在人类肿瘤经常被删除的染色体 区域。并且所有成员的蛋白都包含类似的k r u p p l e 型锌指结构域和正性调控( p r ) 结构域。锌指结构域如前所释是一个d n a 绑定位点 5 】。这个家族还有一个特点， 就是家族里的一些目前研究比较集中的成员，比如p r d m 2 和p r d m 3 都发现了 可以表达两种蛋白产物，一种含有p r 结构域，一种不含p r 结构域的截短型。 p r 结构域是由最早发现的两个同类蛋白命名的，即p r d i b f l 和r i z 。 p r d m 家族中的这一保守结构域，p r 结构域，属于s e t 结构域家族的一个分支。 s e t 结构域的失调控在肿瘤形成过程中有着重要作用 4 0 1 。s e t 结构域是组蛋白 赖氨酸甲基化转移酶家族中的重要保守结构域，许多含s e t 结构域的蛋白都具 有赖氨酸组蛋白甲基转移酶活性，并且刚z l 中的p r 结构域确实有甲基化转移 酶活性【2 5 1 。虽然b l i m p 1 中的p rd o m a i n 尚无可证实的甲基化转移酶活性，但它 讨论 可以募集g 9 ah m t 到i f n l 3 的启动子区。g 9 a 结合于组蛋白3 的赖氨酸9 上， 引起组蛋白抑制性结构改变 2 6 1 。 在p r d m 家族中，一系列的证据也表明，缺少p r 结构域的截短型产物过 表达与肿瘤的发生发展关系密切。目前关注比较多的家族成员是p r d m 2 和 p r d m 3 ，p r d m 2 有两个基因产物，含p r 的r i z l 和不含p r 的r i z 2 。在小鼠 中有意打断r z 1 但是不影响正常r i z 2 的表达引起了显著的多种组织内肿瘤形 成，而r i z l 在细胞中过表达可使细胞周期发生阻滞。与此一致的是，在人类恶 性组织和肿瘤细胞系中通常会发现过表达的r i z 2 ，和减少或不足的对z 1 f 2 7 2 9 1 。 p r d m 3 的基因也有两种产物m d s l e v i l 全长型和e v i l 截短型，在急性髓 系白血病中发现有截短型e v i l 的过量表达 3 0 - 3 1 1 。但是没有进一步的功能分析， 解释p r 结构域是怎样造成这些差异的。 而最近一个p r d m l 蛋白的异构型( p i m 11 3 ) 在人类多发性骨髓瘤细胞 系中被发现了。这个异构型是由p r d m l 基因第4 个外显子上游2 0 5 b p 的一个内 部起始位点开始转录的，有一个断裂的p r 结构域( 见图1 1 ) ，并和先前发现的 p r d m l 蛋白( b l i m p q ) 相比缺少氨基末端的1 0 1 个氨基酸，这与p r d m 基因 家族成员p r d m 2 的致癌型基因产物r i z 2 非常相似【3 2 】。进一步的研究发现，纯 化的正常人源浆细胞中p r d m l1 3 的表达与从多发性骨髓瘤中分化出的浆细胞中 的p r d m l1 3 相比水平明显较低。在多发性骨髓瘤细胞系中，p r d m l l 3 表达量明 显高于0 t ，而在正常人源浆细胞中p r d m l a 的表达明显高于1 3 。细胞应激诱导 b l i m pq 而不是1 31 3 引。这些观察暗示，p r d m l 的两个蛋白型很可能有着相反的 功能，并在体内互相竞争。c a l a m e 的工作组建立了一个能部分证明这一观点的 模型。在该实验中，他们建立了稳定转染高或低水平p r d m l1 3 的u 9 3 7 细胞株。 通过p m a 诱导，内源性的p r d m la 在各种u 9 3 7 细胞中水平逐渐升高。空白对 照的u 9 3 7 细胞迅速进入生长停滞，而低水平表达p r d m l1 3 的细胞部分进入生 长停滞，而高水平表达p r d m l1 3 的细胞株仍然显著增殖【1 2 j 。这说明p r d m lq 和缺少p r 结构域的p r d m ld 有明确的可以控制细胞周期进展的能力。 4 1 3p r d m l a 与p 蛋白结构的差异决定了他们功能的差异 我们研究组的工作人员前期对这个问题进行了初步探索( 图1 3 ) 。分别转 染含p r d m lq 和1 3c d n a 质粒到h e l a 细胞中，用流式细胞仪检测细胞周期( p i 染色法) 发现转入含p r d m lae d n a 质粒的细胞，大部分被阻滞在了细胞周期 3 7 讨论 的g 1 期，而转入了p r d m l1 3 的细胞g 1 期阻滞现象不明显。这提示我们p r d m l q 与b 在细胞周期调控中的功能不同。 本次实验中，我们建立一过性敲除r b 蛋白的细胞模型，分别在敲除和未敲 除r b 的h e l a 细胞中分别转染p r d m l c d n a 和p i m m l1 3 表达载体或其阴性 对照空载体，观察对比在r b 去除前后p r d m lq ，p r d m lb 对细胞周期调控的 影响。发现：l 、在有r b 表达的h e l a 细胞系中p r d m l a 可以将大部分细胞阻滞 在g 1 期。在无r b 表达的h c l a 细胞系中p r d m l a 对细胞周期g 1 的阻滞功能 解除。2 、r b 基因敲除前后，p r d m i1 3 在h e l a 细胞中的表达均不导致细胞周期 g 1 期的阻滞。这提示我们：p r d m l a 可诱导部分肿瘤细胞阻滞在细胞周期g 1 期，此作用依赖于r b 蛋白的存在。而p r d m l l 3 不具有上述功能。 我们知道p r d m l l 3 是由p r d m l 基因第4 个外显子上游2 0 5 b p 的一个内部 起始位点开始转录的，有一个断裂的p r 结构域( 见图1 1 ) ，并和先前发现的 p r d m lq 相比缺少氨基末端的1 0 1 个氨基酸。而在p r d m 家族中一个显著地特 点就是，许多这个家族的成员都有一个拥有p r 结构域，和一个缺少p r 结构域 的两个不同的蛋白产物。完整型过表达引起细胞周期的阻滞，而截短型过表达 则是某些肿瘤发生发展的“帮凶” 2 7 - 2 9 】。因此我们推测，很可能是由于p r d m l q ，p r d m l1 3 这个与家族成员一致的在p r 结构域上的差异，决定了他们生物 学功能的差异。可能正是p r 结构域的缺失使得p r d m l1 3 失去了对细胞周期的 阻滞功能。最近的研究表明，在多发性骨髓瘤细胞系中，p r d m l d 表达量明显 高于a ，而在正常人源浆细胞中p r d m l a 的表达明显高于b 3 3 j 。这也暗示了很 可能p r d m l l 3 与多发性骨髓瘤的发生和进展有关。 第二节p r d m l a 通过与r b 相互作用而实现对细胞周期的抑制功能 细胞周期正常调控的维持和肿瘤的发生发展有着密切关系。一直以来，各 路学者就对认清细胞增殖、生长停滞、分化和凋亡之间的制衡关系，进而尝试 阻止组织细胞恶性增殖，抱以极大的兴趣。r b 是参与细胞周期g 1 s 限制点调 控的关键调控因子。我们的实验可能揭示了r b 参与细胞周期调控的一个新机制。 也进一步揭示了p r d m l 蛋白调控细胞周期的分子机制。 4 2 1 细胞周期与i 曲蛋白 无论是细胞终末分化还是肿瘤的发生发展，都与细胞周期的调控密切相关。 3 8 讨论 肿瘤共性的生物学特征是失控性生长，其主要分子机制是细胞周期紊乱导致细 胞增殖过多和凋亡过少。细胞周期通过两个限制点( g 1 s 期限制点和g 2 m 期限制 点) 保证细胞的忠实复制。当细胞受损时，通过控制限制点，分别导致细胞的g l 期延迟和或g 2 期延迟，可以使细胞有时间完成复制前和有丝分裂前的修复，以 保证细胞高质量地存活，当损伤超过细胞的修复能力时，则促使细胞进入凋亡。 因此细胞周期的正常运行在细胞增殖凋亡中的调控作用在维护基因组稳定性中 具有重要意义。细胞周期紊乱是基因组不稳定的一个中心环节，其结果使不稳 定细胞进一步癌变的可能性增高，从而参与肿瘤的发生发展。这种在细胞增殖， 生长停滞，分化和凋亡之间的制衡，和一个通路密切相关，这个通路就是r b 通 路。r b 是人类历史上第一个被确认的抑癌基因。最初报导是它在眼部恶性肿瘤 ( 视网膜母细胞瘤r e t i n o b l a s t o m a ) 发生中起作用，后来发现在大约1 3 人类的肿 瘤中r b 基因都存在缺失和突变。r b 是一个核磷蛋白，抑制在o i 至u s 期过渡越过 细胞周限制点( c e l l c y c l ec h e c k p o i n t ) 所需要基因的转录，因此引起了细胞周期在 g 1 期的停滞。细胞周期的停滞通过r b 蛋白和他的靶基因e 2 f 家族转录因子的相 互作用引起转录失活瞰】。i 的活性被c d k c y c l i n e 复合体负性调控，当细胞受到 生长信号刺激时，c y c l i n e 表达上调，激活相应的c d k ，导致r b 磷酸化，释放出 重要的核转录因子e 2 f ，从而引起一系列与s 期行进有关的靶分子的表达，促使 细胞完成d n a 复制，反之则r b 保持活性形式细胞周期无法越过g 1 s 期的限制点， 从而引起了细胞周期的停滞。在c d k - c y c l i n e 复合物的上游c d k 的抑制子们 ( i n k 4 家族和c i p k i p 家族) 可以抑制c d k 激酶活性，使r b 保持活性状态，进 而使细胞停滞在g 1 一s 过渡蝌3 5 - 3 6 】。 4 2 1p r d m l a 通过与r b 相互作用而实现对细胞周期的抑制功能 大量实验也提示了r b 通过直接或间接的与关键分化促进蛋白作用在细胞特 殊分化中有着重要功能，但是具体机制不明。在我们的实验中p r d m l 在具有r b 的人类细胞系中表达，以保证他们的蛋白构造像在体内一样正常表现。我们的 前期实验发现p r d m lq 在具有r b 的人类细胞中可以诱导细胞周期阻滞在g 1 期， 免疫沉淀结果提示p r d m lq 能与r b 形成复合物。而本实验又证明，转入s i r b 敲 除r b 后p r d m lq 对细胞周期g l 期的阻滞作用消失，转入了含p r d m l ac d n a 质 粒的r b + h e l a 细胞中可检测到活化型r b 表达，我们推测p r d m lq 优先与低磷酸 化的r b 结合，这可能加强了r b 在退出细胞周期及控制分化中的作用( 见图4 1 ) 。 3 9 讨论 如模式图所示，r b 被磷酸化后细胞越过细胞周期越过g 1 s 限制点，由g 1 期向s 期进展；p r d m la 优先与低磷酸化的r b 结合占据了磷酸化位点，阻止了r b 的磷 酸化，进而阻止了细胞周期由g 1 期像s 期进展。而当失去了r b 时p r d m lq 不能 单独发挥对细胞周期g 1 期的阻滞作用，因此细胞周期继续进展。 在本实验中r b 基因敲除前后，p r d m lb 在h e l a 细胞中的表达均不导致细胞 周期g 1 期的阻滞。p r d m l l 3 不具有使部分i 曲蛋白维持在非磷酸化即活化状态的 功能。这与我们之前讨论的p r d m la 与b 结构差异而带来的功能不同是一致的。 很可能p r 结构域的缺失使p r d m l l 3 无法与r b 相结合，也无法阻止其磷酸化失活， 导致细胞越过g 1 s 限制点，细胞周期继续进展。 而r b 在多发性骨髓瘤中的缺失率高达4 0 。那么很可能在r b 缺失的骨髓瘤 患者中p r d m lq 因为失去了作用伙伴而无法参与到对细胞周期的调控中去。 r 嘲耋搿酸化磊璺西香，绷触 g 囱s 期避震 与磁盘后，r 嘲嚆翻撇 诧因两持续傺持螽化垅态， 阻菊g 1 囱s 翔进展 失去了r b , 呒法发挥翱钠 律用，g 1 囱s 期避餍 图4 1 p r d m lq 和r b 对细胞周期的调节作用模式图。 而在多发性骨髓瘤中，p r d m l1 3 经常过表达，提示他可能与p r d m la 竞争， 通过降低p r d m la 在细胞中与r b 的绑定集合影响其功能的发挥，而阻止了分化 讨论 的过程。这些过表达p r d m lb 的细胞缓慢增殖，也为其他多发性骨髓瘤发生过 程中的基因改变提供积累的时间。 第三节临床意义与展望 p r d m l 是否具有肿瘤抑制子功能一直是一个争论不休的话题。p r d m l 定位 于人类染色体中一个在非霍奇金淋巴瘤中经常被删除的区域6 q 2 1 q 2 2 1 ，尤其是 在弥漫大b 细胞淋巴瘤d l b c l 和分期较晚的淋巴瘤中【4 3 1 。最近三个工作组分别 独立发现了p r d m l 在a b c 型弥漫大b 细胞淋巴瘤患者中的高频突变。令人惊奇 的是，大多数这些突变引起p r d m l 蛋白缺少p r 或者锌指结构域。但类似的 p r d m l 突变在b 或t 或粒细胞白血病，或在4 6 7 个常见肿瘤中均未发现 4 4 】。在目 前对d l b c l 最全面的一项研究中，p r d m l 在2 4 ( 3 4 个中有8 个) 的活化型b 细 胞样弥漫大b 细胞淋巴瘤( a b c ) 中被失活。但在生发中心b 细胞样( n = 0 3 7 ) 或未定类d l b c l ( n = 0 2 1 ) 没有发现这种情况 4 5 】。然而，一个表达b l i m p 1 的 d l b c l 亚型，不但缺乏浆母细胞或免疫母细胞改变，且展示了更具侵袭性的行 为，无事件生存期也更短闱。j o s 6 一f r a n c i s c og a r c i a 和他的同事们发现，有高 p r d m l 表达的d l b c l 表现更具侵袭性的行为。在单因素分析中，p r d m l 的表达 和短无失败生存期显著相关( p 0 0 5 ) 。同时p r d m l 阳性的患者的整体生存率和 无病生存率都有减少倾向( 1 ) 。这似乎给p r d m l 作为肿瘤抑制子的身份提出了 质疑。j o s s f r a n c i s c og a r c i a 的小组还发现正常的生发中心中p r d m l 阳性的细胞 与m u m l i r f 4 共表达而缺乏b c l 6 ，而这也是进一步诱导浆细胞分化所必需的。 在j o s 6 一f r a n c i s c og a r c i a d 、组对d l b c l 研究中，他们发现p r d m l 阳。i 生m u m l i r f 4 阴性或p r d m l 阴性m u m l i r f 4 阳性的病例。他们还发现许多p r d m l 阳性肿瘤 同时共表达b c l 6 蛋白。这些结果提示正常生发中心中b c l 6 ，m u m l i r f 4 和 p i m m l 三者平衡关系在d l b c l 中不复存在，而对这些蛋白的调控比现在已知的 要复杂的多【4 6 j 。我们的研究可能为p r d m l 是否具有肿瘤抑制子功能的问题做了 一个提示，很可能是因为p r d m lq 与1 3 结构的不同导致了他们的功能有着不同 表现，而p r d m lq 与t 3 在细胞中正常比例的倒置，与和其调控相关的调节因子 的突变与缺失，对p r d m l 表达相关的肿瘤的发生和发展负有责任。总之，关于 p r d m lq 及其变异型p r d m lb ，还需要更详细的在细胞周期中的功能分析来支 持是否p r d m lq 具有肿瘤抑制子功能。 4 1 讨论 终末分化是以细胞周期停滞为特征的，而肿瘤细胞失去了正常的细胞周期 控制导致他们不能完全分化。因此，刺激或强迫肿瘤细胞进入终末分化过程并 从而使其失去瘤细胞的特性，多年来一直是个诱人的话题。在对这一设想的众 多尝试中，最成功的一个就是临床应用全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血 病，促进早幼粒白血病细胞分化为成熟粒细胞。这一方法通常使患者可以获得 完全缓解。因此弄清恶性细胞的失控增殖形式向正常分化转换过程中的调控机 制，将有助于我们理性的选择治疗方案。我们的研究发现，p r d m l 可以通过其 在细胞周期中的调控作用，促进增殖中的细胞分化。虽然p r d m l 上游的调控机 制至今尚不清楚，以p r d m l 为靶点的促进细胞分化治疗方案在d l b c l 和m m 中仍前景可观。 结论 第五章结论 p r d m l a 可诱导部分肿瘤细胞阻滞在细胞周期g l 期，此作用依赖于r b 蛋 白的存在，而且该作用机制的分子基础之一是因为p r d m l a 可使部分r b 蛋白 维持在非磷酸化即活化状态。p r d m i i b 不具有上述功能。本研究结果提示 p r d m l a 和p r d m l l 3 具有不同的生物学功能，p r d m l a 可能具有抑癌基因的作 用，而p r d m l l 3 可能与肿瘤进展有关。 4 3 结论 参考文献 参考文献 【1 】k e l l e ra d ，m a n i a t i st i d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n b e t a - i n t e r f e r o ng e n ee x p r e s s i o n g e n e sd e v 1 9 9 1 5 ：8 6 8 - 7 9 【2 】t u r n e rc aj r , m a c kd h ，d a v i sm m b l i m p - i ，an o v e lz i n cf i n g e r - c o n t a i n i n gp r o t e i nt h a tc a l l d r i v et h em a t u r a t i o no fbl y m p h o c y t e si n t o i m m u n o g l o b u l i n - s e c r e t i n gc e l l s c e l l l9 9 4 7 7 ：2 9 7 - - 3 0 6 【3 】h u a n gs b l i m p - ii st h em u r i n eh o m o l o go ft h eh u m a nt r a n s c r i p t i o n a lr e p r e s s o rp r d i - b f l c e l l1 9 9 4 7 8 ：9 【4 】m o c kb a ，l i ul ，l e p a s l i e rd ，h u a n gs t h eb l y m p h o e y t em a t u r a t i o np r o m o t i n g t r a n s c r i p t i o n f a c t o rb l i m p l p r d i b f l m a p s t od 6 s 4 4 7o nh u m a nc h r o m o s o m e 6 q 21 一q 2 2 1a n dt h es y n t e n i cr e g i o no fm o u s ec h r o m o s o m e10 g e n o m i c s 19 9 6 3 7 ：2 4 - 2 8 【5 】k u ot c ，c a l a m ek l bl y m p h o c y t e i n d u c e dm a t u r a t i o np r o t e i n0 3 l i m p ) - l ，i f nr e g u l a t o r y f a c t o r ( i r f ) - l ，a n di r f - 2c a r lb i n dt o t h es a m er e g u l a t o r ys i t e s j i m m u n 0 1 2 0 0 4 1 7 3 ：5 5 5 昏石3 6 】c a n o t e d uy ，c a r l i n gt ，t i 锄f ，p e n gz ，h u a n gs n et u m o rs u p p r e s s o rg e n er i zi n c a n c e rg e n et h e r a p y ( r e v i e w ) o n c 0 1 r e p 2 0 0 2 9 ：5 7 - 6 0 【7 】h u a n gs ，s h a og ，l i ul 1 h ep rd o m a i no ft h er b - b i n d i n gz i n cf i n g e rp r o t e i nr i z ii sa p r o t e i nb i n d i n gi n t e r f a c ea n d i sr e l a t e dt ot h es e td o m a i n f u n c t i o n i n g i n c h r o m a t i n m e d i a t e dg e n ee x p r e s s i o n j b i 0 1 c h e m 19 9 8 2 7 3 ：15 9 3 3 - 3 9 【8 】a n g e l i n d u c l o s ，c ，g c a t t o r e t t i ，k i l i n , a n dk c a l a m e c o m m i t m e n to fbl y m p h o c y t e st o ap l a s m ac e l lf a t ei sa s s o c i a t e dw i t h b l i m p - 1e x p r e s s i o n i nv i v o j i m m u n 0 1 2 0 0 0 1 6 5 ：5 4 6 2 【9 】k a l l i e s ，a ，j h a s b o l d ，d m t a r l i n t o n , w d i e t r i c h , l m c o r c o r a n ，p d h o d g k i n , a n ds l n u t t p l a s m ac e l lo n t o g e n yd e f i n e db yq u a n t i t a t i v ec h a n g e si nb l i m p le x p r e s s i o n j e x p m e d 2 0 0 4 2 0 0 ：9 6 7 9 7 7 【10 】k a l l i e s ，a ，e d h a w k i n s ，g t b e l z , d m e t e a l f , m