2005级开题报告-邓岩ppt

硕士研究生开题报告 5 氮杂脱氧胞苷联合放疗对鼻咽癌RASSF1A基因甲基化和表达的影响 硕士研究生开题报告 研究生 邓岩 导师 姚运红副教授时间 2005年8月19日 02 硕士研究生开题报告 开题报告 一 立题依据与研究现状二 实验目的三 技术路线四 主要实验方法五 预期结果六 经费预算七 时间安排 03 立题依据 第一部分 04 硕士研究生开题报告 立题依据 RASSF1A基因RASSF1A蛋白RASSF1A基因的高甲基化与肿瘤5 氮杂脱氧胞苷 05 硕士研究生开题报告 RASSF1A基因 很早以来 医学研究人员就发现肿瘤患者3p染色体出现等位缺失的现象 常见肺癌患者 于是推测该区域可能存在某种抑癌基因 1998年 Sekido等在肺癌及乳腺癌细胞系的研究中发现3p21 3存在一个120kb长的最小纯合缺少区 2000年 Dammann等 4 使用酵母双相杂交筛选的方法自该区分离出一种能与DNA修补蛋白 XPA 相互作用的候选cDNA 互补DNA 其核苷酸序列的羧基端与鼠RAS效应蛋白Nore1和Maxp1高度同源 遂命名为RAS区域相关家族1 即RASSF1基因 06 硕士研究生开题报告 RASSF1A基因 Ras基因除了具有促进细胞生长 增殖的作用外还具有一个非常重要的功能 抑制细胞生长 促进细胞凋亡和衰老 RASSF1A基因可能是Ras激活信号传导通路中一个非常重要的负向调节基因 在肿瘤的发生 发展 预后等方面具有重要意义 该基因主要存在3种不同的转录本 共同编码与Ras相关的同源区 RalGDS AF26 RA 这三个转录本分别是 RASSF1A RASSF1B RASSF1C 07 硕士研究生开题报告 RASSF1A RASSF1A含外显子1 和2 其cDNA全长1873bp 含340个氨基酸的开放读码框 编码产物为相对分子质量为38800的蛋白多肽 其N端与富含半胱氨酸的甘油二酯或佛波酯结合区高度同源 也被称作蛋白激酶C保守区1 proteinkinaseCconservedregion1 PKCC1 在正常组织中都有表达 但在肺癌 乳腺癌 卵巢癌 鼻咽癌 肾癌等肿瘤中存在较高的表达缺失 08 硕士研究生开题报告 RASSF1B RASSF1B也含外显子2 但其外显子1 与转录本A不同 该转录本cDNA全长1664bp 可能仅编码Ras同源区 RA 主要表达于造血系统的组织细胞 在肿瘤中的表达缺失率不高 约37 13 09 硕士研究生开题报告 RASSF1C RASSF1C外显子起自1 无2 全长117kb 编码含270个氨基酸的蛋白 但不含PKCC1区 相对分子质量为32000 正常组织和肿瘤中都有较好的表达因此 RASSF1A基因可以成为一种研究的重要候选抑癌基因 表达产物是RASSF1A蛋白 10 硕士研究生开题报告 RASSF1A蛋白 RASSF1A蛋白作为Ras效应蛋白家族中的一员 主要以GTP依赖的方式结合Ras传导通路上游的Ras GTP而被激活发挥抑制细胞生长 促进细胞凋亡和衰老的功能 研究发现 RASSF1A蛋白的氨基酸序列除了包含RA区 PKCC1区外还包含了一个ATM ataxiatelangiectasiamutated 蛋白的磷酸化位点 ATM参与细胞周期调控 有丝分裂中染色体重组 端粒长度监测及DNA损伤细胞学反应 RASSF1A蛋白通过磷酸化ATM蛋白的PI3K位点活化来发挥抑制肿瘤的作用 11 硕士研究生开题报告 RASSF1A蛋白 1 RASSF1A蛋白通过抑制Ras激活生长效应信号的传导途径而发挥作用 另一种可能机制则是RASSF1A蛋白的失活导致Ras作用的失衡 使其主要发挥促进生长的作用 2 RASSF1A蛋白可能是细胞周期蛋白D1 cyclinD1 的抑制蛋白 cyclinD1对RASSF1A蛋白的活性非常敏感 活化RASSF1A蛋白能明显的抑制cyclinD1在细胞内积聚从而抑制细胞由G1期进入S期 对细胞增殖起负性调节作用 12 硕士研究生开题报告 RASSF1A蛋白 3 RASSF1A蛋白在分裂间期分布在细胞微管 在有丝分裂期分布在细胞中心体和纺锤体 并最终通过细胞分化周期调控蛋白20 celldivisioncyclecontrolprotein20 cdc20 作用到促后期复合物 anaphasepromotingcomplex APC 上 抑制APC磷酸化活性使细胞有丝分裂停滞在中后期 13 硕士研究生开题报告 RASSF1A基因高甲基化与肿瘤 现已明确RASSF1A基因在肺癌等癌症中表达失活的机制是由于其启动子区CpG岛的特异性高甲基化所致 虽然抑癌基因的失活还可由突变所致 但对该基因的研究结果表明 RASSF1A基因的突变率在肺癌中还不及10 而RASSF1A启动子区发生高甲基化的比率在小细胞肺癌 非小细胞肺癌系中分别高达100 和63 非恶性肺组织中无一例发生甲基化 研究表明 不表达RASSF1A蛋白的A549肺癌细胞系经甲基化抑制剂处理并重新表达RASSF1A蛋白后 可减少其细胞克隆形成 抑制非贴壁性细胞生长 而表达RASSF1A蛋白的裸鼠移植肿瘤较对照组的肿瘤生长明显减慢 14 硕士研究生开题报告 RASSF1A基因高甲基化与肿瘤 邵康 赫捷 程邦昌 等RASSF1基因不同转录本在肺癌组织中的转录表达及临床意义 中华肿瘤杂志 2003 25 2 1492153 研究还发现RASSF1A与淋巴结转移及TNM分期相关 伴淋巴结转移者或病期较晚的病例癌组织者RASSF1A的表达缺失均显著高于无淋巴结转移者 P 0 05 及病期较早者 P 0 01 15 硕士研究生开题报告 5 氮杂脱氧胞苷 DNA甲基化修饰有多种方式 其中DNA胞嘧啶C 5位甲基转移酶 DNA甲基化酶 识别DNA的5 CG 3 序列 CpG 把S腺苷甲硫氨酸 SAM 的甲基转移到胞嘧啶的5位 生成5甲基胞嘧啶 5mC 2 DNA甲基化抑制剂能逆转甲基化效应 包括防止甲基化CpG的突变 重激活因甲基化抑制的基因等 16 硕士研究生开题报告 5 氮杂脱氧胞苷 这些抑制剂及其作用靶点较多 其中胞苷类似物5氮杂脱氧胞苷的作用机制已很清楚 目前已进入临床实验阶段 用于白血病治疗 其他化合物大多停留在临床前实验阶段 5 氮杂胞苷 5 氮杂脱氧胞苷和胞苷结构类似 它们能与DNA甲基化酶共价结合 降低酶的生物活性 但此类化合物体内体外实验均有细胞毒和致突变作用 17 鼻咽癌是一种多因素参与的多基因遗传性疾病 然而 研究RASSF1A基因的甲基化与鼻咽癌的转移关系的文章不很多 因此 本研究旨在从一个新的角度反映鼻咽癌的本质 研究现状 18 硕士研究生开题报告 研究现状 LoKW KwongJ HuiAB etal HighfrequencyofpromoterhypermethylationofRASSF1Ainnasopharyngealcarcinoma CancerRes 2001 61 387723881 分析了4例鼻咽癌移植瘤标本 4株鼻咽癌细胞系和21例原发性鼻咽癌标本 发现RASSF1A基因5 CpG岛的完全甲基化率在移植瘤中为100 4 4 在鼻咽癌细胞系中为75 3 4 在原发性鼻咽癌中为66 17 14 21 在正常鼻咽上皮没有甲基化 基因突变只在原发性鼻咽癌中发现2个 19 硕士研究生开题报告 研究现状 在有高度甲基化的细胞系和移植瘤中发现有RASSF1A基因的高表达缺失 在用甲基化抑制剂5 氮杂脱氧胞苷 5 2aza22 deoxycytidine 处理后 RASSF1A基因重新表达并显著抑制细胞的生长和增殖 Chow等将野生型RASSF1A基因转染到RASSF1A基因缺陷型的鼻咽癌细胞C66621中 发现重新表达RASSF1A蛋白的鼻咽癌细胞C66621能显著减少其细胞克隆形成 抑制非贴壁性细胞生长 20 以上资料表明 1 RASSF1A基因是鼻咽癌的一个非常重要的候选抑癌基因 启动子区的高度甲基化至少是其失活的主要机制之一 当然 基因缺失的作用不可忽视 2 RASSF1A基因表达低下是鼻咽癌的晚期转移的重要事件 可能是伴随性改变 甚至是鼻咽癌发生转移的主导因素 21 第二部分 实验目的 22 实验目的 1 RASSF1A基因的高甲基化和RASSF1A基因的表达在鼻咽癌转移方面有无统计学意义 23 实验目的 2 通过5 氮杂脱氧胞苷联合放疗对RASSF1A基因的表达的影响 研究该药物 放疗各自的疗效和联合疗效 24 第三部分 技术路线 25 鼻咽癌细胞系接种裸鼠 RASSF1A基因甲基化水平及其在鼻咽癌细胞系表达 5 氮杂脱氧胞苷处理 检测RASSF1A基因甲基化水平 分析比较其差异性 RASSF1A基因及蛋白表达 放疗 空白对照 5 氮杂脱氧胞苷联合放疗 鼻咽癌组织 正常组织 免疫组织化学检测RASSF1A蛋白 26 主要实验方法 一 甲基化特异性PCR MSP MSP法原理 单链DNA的胞嘧啶 C 可被亚硫酸氢盐脱氨基转变为尿嘧啶 U 而5甲基胞嘧啶 5mC 则不能被修饰 仍保持为5甲基胞嘧啶 5mC 根据5甲基胞嘧啶与胞嘧啶修饰后的不同 发生甲基化与未发生甲基化DNA的上游引物之间的差别为胞嘧啶 C 变为胸腺嘧啶 T 下游引物的差别为鸟嘌呤 G 变为腺嘌呤 A 据此设计甲基化 p16m 等位基因特异引物和非甲基化 p16u 引物 用这两对引物对同一模板进行扩增来检测待扩增片段的甲基化状况 能用p16m引物扩增的 说明了该扩增片段已发生了甲基化 能用p16u引物扩增的 说明了该扩增片段没发生甲基化 如用两对引物都能扩出 则说明了该扩增片段存在部分程度的甲基化 本研究所扩增的片段位于启动子和第一外显子 其引物序列见表 27 硕士研究生开题报告 一 甲基化特异性PCR MSP 引物引物序列bpp16m 上游 5 TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC3 150p16m 下游 5 GACCCCGAACCGCGACCGTAA3 150p16u 上游 5 TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT3 151p16u 下游 5 CAACCCCAAACCACAACCATAA3 151PCR 反应总体积50 l 包括经亚硫酸钠修饰后的模板DNA约50ng 引物各300dNTP1 25mmol L 1 25UDNA聚合酶 1 PCR缓冲液 16 6mmol L硫酸铵 67mmol LTrisHClpH8 8 10mmol L2 巯基乙醇67mmol LMgCl2 反应条件为95 热启动15m 然后于95 30s 60 30s 72 30s各循环35次 最后于72 延伸10min 同时以正常人外周血淋巴细胞 PBI DNA作为阴性对照 3 以水作为空白对照 取扩增产物于2 琼脂糖凝胶中电泳 凝胶成像系统观察 拍照 28 主要实验方法 一 逆转录PCR1 抽提鼻咽组织和鼻咽癌细胞株总RNA 42oC完成2 引物Oligo dT 15 正义引物5 TCTGGGGCGTCGTGCGCAAA 3 反义产物5 GAACCTTGATGAAGCCTGTG 3 3 内对照 甘油醛 3 磷酸脱氢酶 GAPDH 4 扩增产物在10 聚丙烯酰胺凝胶电泳 溴化乙啶 小心 强烈致瘤剂 染色5 测定RASSF1A和GAPDH基因产物条带吸光度的相对比值 该比值表示RASSF1A基因的相对表达强度 29 主要实验方法 5 氮杂脱氧胞苷5azaCdR1 0 mol L 可以采用的浓度分别为0 1 0 5 1 0 2 0 5 0 mol L 免疫组织化学技术放疗DT36Gy 18次 30 第四部分 预期结果 31 1 未用5 氮杂脱氧胞苷与放疗前测甲基化正常组织程度低 鼻咽癌组织甲基化程度高 能与转移能力正相关 32 2