（环境工程专业论文）黄绿木霉和球孢白僵菌几丁质降解酶基因的克隆与表达.pdf

哈尔滨工业大学工学博士学位论文 带，证实了各个几丁质降解酶基因d n a 片段在g a l l 启动子控制下经半 乳糖诱导在酿酒酵母( sc e r e v 括i a e ) 中成功转录表达；并通过d n s 法研 究了各个转化子的发酵周期，发现e c h 4 2 、c h i t l 、c h i t 2 和c n s l 转化子产酶 高峰的出现时间分别为3 6 h 、4 8h 、3 6 h 和4 8 h ( 接种量为5 m l ) ，各转化子 酶活的最大值分别为0 5 0 、0 4 7 、0 6 3 、和0 6 2 u m l ；各重组酶的最适反 应温度分别为e c h 4 24 0 、c h i t l7 0 、c h i t 27 0 、c n s l7 0 ；各重组酶 的最适p h 值分别为e c h 4 28 0 、c h r l8 0 、c h i t 25 0 、c n s l4 6 。 比较了在相同条件下4 种转化子分泌的重组酶的协同作用，结果表明在 相同条件下4 种重组酶不同组合的酶活差异十分显著。在所有的组合当中， c n s l 和c h i t l 组合的酶活最高0 7 5u m l ，c h i t l 和c h i t 2 组合酶活最低0 2 1 u m l 一。重组酶e c h 4 2 和c n s l 与其它重组酶之间存在正协同效应，c h i t l 和 c h i t 2 之间是负协同效应。 黄绿木霉( za u r e o v i r i d e ) 和球孢白僵菌( bb a s s i a n a ) 的几丁质降解 酶基因d n a 片段的克隆，为进一步研究几丁质降解酶基因在酿酒酵母( s c e r e v i s i a e ) 等其他细胞中的表达及重组酶的特性提供了重要的材料：为其 他有关抗病抗虫基因工程提供了重要基因资源。通过对转化子的发酵周期和 重组酶的酶学特性分析证实了酿酒酵母( sc e r e v i s i a e ) 可以正确表达黄绿 木霉( ta u r e o v i r i d e ) 和球孢自僵菌( b b a s s i a n a ) 的几丁质降解酶基因的 d n a 片段，为构建可大量生产几丁质降解酶的酵母工程菌提供了重要理论 依据。实验中四种几丁质降解酶存在不同的协同作用的结果，为进一步研究 其他不同的几丁质降解酶组合的协同作用提供了新的思路，对进一步研究，l 丁质降解酶的实际应用具有重要的意义。 关键词黄绿木霉；球孢白僵菌；几丁质降解酶基因； 酿酒酵母；克隆与 表达 a b s t r a c t c h i t i n o l y t i ce n z y m e sa r eah e t e r o g e n e o u sg r o u po fe n z y m e st h a tc a t a l y s e t h eh y d r o l y t i cd e p o l y m e r i s a t i o no fc h i t i n ，w h i c hi s l o n gc h a i np o l y m e ro fn a c e t y l - g l u c o s a m i n e ( 2 - a c e t a m i d o 一2 - d e o x y - d g l u c o s e ) l i n k e db y1 3 - 1 ，4b o n d s a n dt h es e c o n dm o s ta b u n d a n tp o l y s a c c h a r i d e ( a f t e rc e l l u l o s e ) o ne a r t h f o r p r e p a r a t i o no ft h ec h i t i na n di t sd e r i v a t i v e s ，c h e m i c a lw a y sw o u l db es u b s t i t u t e d b ye n z y m a t i cw a y sb e c a u s eo fs e c o n d a r yp o l l u t i o n b u ta s t h eh i g hp r i c eo f c h i t i n o l y t i ee n z y m e sp r o d u c e dw i t hc l a s s i c a lf e r m e n t a t i o na n dd i f f i c u l t yo i l p u r i f i c a t i o no fs i n g l ee n z y m e ，i tw a sd i f f i c u l tt od e v e l o pt h ee n z y m a t i cw a y so n p r e p a r a t i o no fc h i t i na n di t sd e r i t i v e s s oi ti saf e a s i b l ew a yt od e v e l o pt h e s t r a t e g yt op r o d u c el a r g es c a l ep r o d u c t i o no fc h e a pc h i t i n o l y t i ce n z y m e s i nt h i s s t u d y , c h i t i n o l y t i ce n z y m eg e n e sw e r ec l o n e da n dt r a n s f o r m e di n t oy e a s tw i t h b i o t e c h n o l o g ym e t h o d s t h er e s u l t sp r o v i d e daf o u n d a t i o no fm a s sp r o d u c eo f c h i t i n o l y t i ce n z y m e s ： t r t c h o d e r m aa u r e o v i r i d ea n db e a u v e r i ab a s s i a n a , w h i c ha r e i m p o r t a n t b i o c o n t r o la g e n t s ，c a np r o d u c eh i g h l ye f f i c i e n tc h i t i n o l y t i ce n z y m e s i nt h i ss t u d y ， ta u r e o v i r i d ea n db b a s s i a n aw e r eu s e da se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l t h ed n a s e q u e n c e so fza u r e o v i r i d ea n db b a s s i a n ac h i t i n o l y t i ce n z y m e sg e n e sw e r e i s o l a t e db yp c r p r o t o c o lr e s p e c t i v e l y t h e s eg e n e sw e r ec o n s t r u c t e do nt h ey e a s t i n d u c i b l e e x p r e s s i o n v e c t o rp y e s 2a f t e r s e q u e n c i n g t r a n s f o r m a n t sw e r e i a d u c e db y2 b - d g l a c t o s e ，t h et r a n s c r i p t i o na n de x p r e s s i o nr e s u l to ft h et a r g e t g e n e sw e r ed e t e c t e db yn o r t h e r nb l o t t i n g t h ec u l t u r ep e r i o d s ，o p t i m a lr e a c t i o n t e m p e r a t u r ea n do p t i m a lp hw e r ea s s a y e db yd n sm e t h o dw i t hc o l l o i d a lc h i t i n a ss u b s t r a t e ，m o r e o v e rs y n e r g e t i ce f f e c to fr e c o m b i n e de n z y m ew a ss t u d i e d i nt h i ss t u d y , t h ed n af r a g m e n t so fc h i t i n o l y t i ce n z y m e sg e n e so fe c h 4 2 ， c h i t l ，c h i t 2a n dc n slw e r eo b t a i n e dp c rp r o t o c o l st h r o u g hp r i m e rd e s i g n a f t e r s e q u e n c i n go fd n af r a g m e n t s ，i tw a sv e r i f i e dt h a tt h e s ed n ag e n e so fz a u r e o v i r i d ea n db b a s s i a n ac h i t i n o l y t i ce n z y m e sf a m i l yw e r eo b t a i n e d ，a n dt h e s e q u e n c e so fe c h 4 2g e n ew a ss u b m i t t e dt ot h eg e n b a n k t h es e q u e n c e sw e r e p u b l i s h e do nt h eg e n b a n ka f t e rc a r e f u l l yv e r i f i e di nt h ed a t a b a n kt oe n s u r et h a t t h e r ew e r en os a m es e q u e n c e sw i t ht h e s es u b m i s s i o n s t h ea c c e s s i o nn u m b e ro f 哈尔滨工业大学工学博士学位论文 t h es e q u e n c ew a s 娥8 5 0 0 3 2 t h i sr e s u l tf u l f i l l e dt h eb l a n ko ft h eg e n b a n ki n t h i sf i e l d t h e s eg e n e sw e r el i g a t e dt o y e a s te x p r e s s i o nv e c t o rp y e s 2w i t hh i 【g h e f f i c i e n tp r o m o t e rg a l1 b yu s i n g y e a s tc e l l t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mf o u r r e c o m b i n a t i o np l a s m i d sw e r et r a n s f o r mi n t oss c e r e v i s i a eh 1 5 8e e l la n dw e r e v e r i f i e db yy e a s tc l o n ep c ra n dd o u b l er e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o n a sar e s u l t ， f o u ry e a s tt r a n s f o r m a n t s c a r r y i n gt h eza u r e o v i r i d ea n d 丑b a s s i a n a c h i t i n o l y t i c e n z y m e sg e n e s ，w e r eo b t a i n e d t h et r a n s c r i p t i o na n de x p r e s s i o nr e s u l to ft a r g e t g e n e sw e r ev e r i f i e db y n o r t h e r nb l o t t i n g t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt a r g e t g e n e sw e r es u c c e s s f u l l y e x p r e s s e du n d e rc o n t r o lo fg a l i p r o m o t e r t h es t u d yo fc u l t u r ep e r i o d s s h o w e dt h a tt h ee n z y m a t i ca c t i v i t yo fe c h 4 2a n dc h i t 2t r a n s f o r m a n t sw e r e a p p r o a c h e dt h eh i g h e s tl e v e l ( o 5 0u m l 1a n d0 6 3 u m l 。1 ) w h e nt h ec u l t u r e t i m ew a s3 6 h ( i n o c u b a t eq u a n t i t y5 m l ) a n dt h ec h i t l a n dc n s lt r a n s f o r m a n t s e n z y m a t i ca c t i v i t ya p p r o a c h e dt h eh i g h e s tl e v e l ( o 4 7 u m l 一o 6 2 u m l “) w h e nt h ec u l t u r et i m ew a s4 8 h ( i n c u b a t i n gv o l u m e5 m l ) t h eo p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r e sw i t he c h 4 2 ，c h i t l ，c h i t 2 ，c n s lg e n e s w e r e4 0 * c ，7 0 。c ，7 0 。ca n d7 0 。cr e s p e c t i v e l y , a n do p t i m a lp hw e r e8 0 ，8 0 ，5 0 a n d4 6r e s p e c t i v e l y t h ec o m p a r i s o nr e s u l to ft h es y n e r g i s m sw i t hd i f f e r e n tr e c o m b i n e de n z y m e m i x t u r e ss h o w e dt h a tt h es t a t i s t i c a ld i s c r e p a n c yo fe n z y m ea c t i v i t yw a sd i s t i n c t a m o n gt h e d i f f e r e n tr e c o m b i n e de n z y m em i x t u r e s ，t h ee n z y m e a c t i v i t yo f r e c o m b i n e dc n s la n dc h i t lw a sm a x i m a l ( o 7 5u m l “) ；t h ee n z y m ea c t i v i t yo f r e c o n t h i n e de n z y m ec h i t 2a n dc h i t lw a sm i n i m a l ( 0 2 lu m l 。1 ) t h es y n e r g i s m o fr e c o m b i n e de n z y m ee c h 4 2 ，c n s la n do t h e rr e c o m b i n e de n z y m e sw a sp o s i t i v e ， o n l ys y n e r g i s mo fr e c o m b i n e de n z y m ec h i t la n dc h i t 2w a sn e g a t i v e t h ec l o n e dd n as e q u e n c e sf r o mza u r e o v i r i d ea n db b a s s i a n ap r o v i d e d t h ei m p o r t a n tm a t e r i a lt ot h es t u d yo ft h ee x p r e s s i o nt h ec h i t i n o l y t i ce n z y m e s g e n e si ny e a s ta n do t h e rc e l ls t r a i n s f r o mt h er e s u l t so ft h en o r t h e r nb l o t t i n g ，w e c a ns e et h a t ，o nt h eo n eh a n d ，t h ey e a s tw h o l ec e i lt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mc a n t r a n s f o r mt h er e c o m b i n a t i o np l a s m i dw i t hh i g he f f i c i e n c y o nt h eo t h e rh a n d ，i t m a d eag o o df o u n d a t i o nf o rt h en e x ts t e pe x p r e s s i o ns t u d y f r o mt h er e s u l to f c u l t u r ep e r i o d ss t u d y ，w ec a ns e et h a tt h ey e a s tc e l lc a l lc o r r e c t l ye x p r e s s i v c h i t i n o l y t i ce n z y m e sd n ag e n e sf r o m7 = a u r e o v i r i d ea n dbb a s s i a n a t h e e x p r e s s i o np r o d u c tc a n b ee x p r e s s e di na c t i v ef o r m sa n dh a v es i m i l a re n z y m a t i c c h a r a c t e r i s t i c s t h i sr e s u l ti n d i c a t e da ni m p o r t a n ts u p p o r tt ot h es t u d yo ft h e c h i t i nd e g r a d a t i o ny e a s tb i o e n g i n e e r i n gs t r a i n an o v e ls t r a t e g yo fe x p l o r i n gt h e s y n e r g i s mb ym i x i n gt h eo t h e rd i f f e r e n tc h i t i n o l y t i ee n z y m e sw a sp r o v i d e db y t h er e s u l ti nt h i sp a p e r ，i th a sg r e a tm e a n i n g f u lh e l pf o rf u r t h e rs t u d yi nt h ef i e l d o fc h i t i n o l y t i ce n z y m e sa p p l i c a t i o n k e y w o r d s t r i c h o d e r m aa u r e o v i r i d eb e a u v e r i ab a s s i a n a ；c h i t i n o l y t i c e n z y m eg e n e ；s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；c l o n i n ga n de x p r e s s i o n v 第1 章绪论 1 1 课题研究的目的和意义 甲壳质是几丁质( c h i t i n ) 及其衍生物的总称，最常见的天然甲壳质资源主 要有几丁质和壳聚糖。它是自然界广泛分布的生物多聚物，有资料表明，每年 自然界生成的甲壳质约有1 0 “吨，其贮量位居第二位仅次于纤维索，也是地 球上除蛋白质外数量最大的含氮天然有机化合物。在真菌中除卵菌外，细胞壁 都含有几丁质，几丁质在真菌的生长和功能方面具有特殊的意义”“。另外几 丁质也大量存在于昆虫和虾蟹类动物的甲壳中“，由于几丁质存在的多样 性，使得对它的开发利用一直没有形成规模，尤其是近几年我国的海陆养殖业 蓬勃发展，水生甲壳类数多量大，在一些沿海海鲜加工厂每年要抛弃数以万吨 的富含几丁质的甲壳“1 ，还有每年发酵工厂的数万吨菌丝废弃物。一方面废壳 过多往往造成巨大的环境污染。另一方面，又浪费了许多几丁质资源。迄今 研究表明，几丁质及其衍生物是一种极好的多用途原材料“1 ，具有巨大的利用 价值和开发潜力，现在其应用已涉及到工业、农业、医学、环境保护、国防、 食品、日用化工等众多领域“。 几丁质及其衍生物是含氮多糖类天然生物活性物质，对人体具有十分重要 的作用，1 9 9 1 年的国际几丁质大会上把它们确定为人体所必需的除塘、蛋白 质、脂肪、维生素与矿物质以外的第六生物要素。早在1 9 5 7 年，h o r o w i t z 就 开始用浓盐酸降解甲壳质，制备几丁质寡糖以及氨基葡萄糖，但酸法降解获得 率低，产物分离困难、环境污染严重，近年来已逐渐被淘汰。自从1 9 0 5 年发 现几丁质降解酶以来，采用酶法降解己成为研究的热点。酶法降解具有条件温 和、降解获得率高等优点，是当前的发展方向。酶法降解包括几丁质降解酶的 生产和几丁质降解两个步骤，出于几丁质降解酶传统规模发酵生产成本过高， 而且产酶工艺复杂，不容易获得单一酶组分，一直限制酶法降解的发展。因 此，通过基因工程手段研究几丁质降解酶基因的工程菌表达和生产将是解决这 一困难的有效途径。 本研究拟采用基因工程的方法，通过对本实验室分离的黄绿木霉和友好单 位惠赠的球孢白僵菌的几丁质降解酶基因的克隆，采用完整细胞转化法将获得 的几丁质降解酶基因转入酿酒酵母中，并使之表达和分泌，得到一个带有几丁 质降解酶系基因的转化体系。利用这个转化体系研究转化子的培养周期和重组 几丁质降解酶的特性；同时研究这些重组几丁质降解酶之间的协同作用，为研 究采用基因工程菌生产廉价的单一酶组分的基丁质降解酶奠定基础。 1 2 国内外的研究进展 自然界中存在着两种资源，既不可再生资源( 如石油、煤炭及天然气等) 和可再生资源( 如淀粉、纤维素、木质素及几丁质等) 。由于不可再生资源随着 人们的消耗，最后必将枯竭，所以人们的注意力逐渐转向可再生能源的利用 上。像淀粉，已广泛应用于微生物培养。纤维素的利用已经开始用于可降解材 料的生产，此外还有利用纤维素降解的底物生产酒精、单细胞蛋白等。可再生 资源中，除了以上的以葡萄糖为单体的多糖( 淀粉和纤维素) 外，几丁质、肽 聚糖等也是自然界广泛存在的形式。几丁质作为大多数真菌和无脊椎动物的主 要结构成分，是自然界中年生物合成量仅次于纤维素的第二大可再生资源。 近几年，人们发现几丁质及其衍生物在抗肿瘤、抗菌、免疫调节及农业病 虫害防治等方面有重要的应用价值。深入研究利用几丁质资源已越来越引起人 们广泛的重视。有关几丁质的降解主要有酸降解和酶降解，采用酶降解是当前 的主要发展方向。几丁质降解酶是能降解几丁质的所有酶的总称，主要包括几 丁质酶、壳聚糖酶、几丁质脱乙酰酶等，它们能被许多的生物体分泌产生，并 在不同的生物体内发挥不同的生理功能。 1 9 2 1 年f o l p m e r s 发现利用几丁质的细菌和真菌在几丁质平板上形成水解 圈，并以此来证明几丁质酶的存在“；1 9 5 1 年j e u n i a u x 发现了蜗牛肠道中的 细菌和放线菌能产生胞外几丁质酶，此后科学家在许多生物体中都发现了该类 酶，一般细菌产生几丁质降解酶可以分解几丁质物质而获得营养；真菌中几丁 质酶在其细胞分裂和形态建成等方面发挥着作用；昆虫等节肢动物中几丁质酶 在它们蜕皮等生长发育中起着重要作用：植物以及高等动物的几丁质酶可能主 要是在于防御病原物的侵染。 随着近几年研究的深入，和现代高新技术的发展，通过基因工程手段在基 因水平研究几丁质降解酶也已经成为分子生物学的重要研究领域。在国外很多 菌种的几丁质降解酶基因得到了克隆并且进行了分析和鉴定，一些几丁质降解 酶基因也实现了其异源表达。以下将就几丁质、壳聚糖、几丁质降解酶基因及 利用等几个方面的研究进行综述。 第1 章绪论 1 2 1 几丁质和壳聚糖 几丁质又名甲壳素( c h i t i n ) 是n - p d 葡萄糖胺以b 1 ，4 糖昔键相联而成直 链状大分子。它的分子结构式除了2 位由乙酰氨基代替羟基外，其他都同纤维 素非常相似。它的分子量一般在1 0 0 万左右，理论含氮量在6 9 。自然界中 几丁质主要以三种结晶形式存在，即几丁质、b 几丁质、t 几丁质。它们的 分子链以螺旋形式存在，其中n 几丁质为主要存在形式，是真菌细胞壁以及 节肢动物外壳的主要成分。它是由两条氨基糖链以反平行方向组成的，由于分 子问和分子内氢键的作用，因此是最稳定的存在形式。b 几丁质较为少见，两 条糖链以平行方向组成，其稳定性不如几丁质。7 几丁质是由三条链组成， 两条同向，一条反向。y 几丁_ 质是否存在目前还存在争议”。p 和t 几丁质都 可以转化为更稳定的几丁质。由于儿j 一质的基本单位是n - 乙酰胺基葡萄 糖，是人体透明质酸的基本单位，因此它具有良好的生物相容性。由于大分子 间的氢键作用，导致几丁质一般不溶化，且小溶于酸也不溶于碱。 c h ：o h c h i o h n h c o c h ， h n h c c 圮h i 图1 1 儿丁质的重复结构单位 f i g1 1r e p e a ls t r u c t u r eu n i to fc h i t i n o 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是氨基葡萄糖以d 一1 ，4 糖苷键相联而成直链状大分 子。它的分子结构与纤维素和几丁质相似。壳聚糖的基本单位是氨基葡萄糖， 与人体内无毒氨基葡萄糖胺相同，因此具肯良好的生物学相容性。壳聚糖形状 因粉碎程度而有所不同，有具光泽的半透明状，碎片状或非结晶性粉术，其色 泽一般为白色或浅黄色，但由于加t 2 - 艺不同，也会自黄色或棕红色。其分子 量依所加工的工艺不同而存在差井， 殷在1 0 - 1 0 0 万之间。由于其分子内氢 键的相互作用，壳聚糖不溶于碱液，也不溶于乙醇、丙酮、甲醛及乙醚等有机 溶剂。但壳聚糖中的n h 2 基同几丁质中n h c o c h 3 基相比活性明显增加。在 酸性条件下，可以产生r n h 3 + ，生成带正电荷的多聚物，因此壳聚糖能溶于 稀酸，如硫酸、盐酸、柠檬酸、酒石酸、水杨酸和抗坏血酸等。壳聚糖的稀碱 溶液具有较高的粘度，影响壳聚糖粘度的主要是分子量。当分子量从8 0 1 0 0 万降到1 0 - 3 0 万时，其0 1 的醋酸溶液室温下的粘度从1 0 0 0 c p s 下降到 2 0 0 c p s 。壳聚糖分子中有羟基、氨基等极性基团，所以具有极强的吸湿性，此 外还可以被其他的基团所修饰，生成更多的衍生物。壳聚糖可以通过几丁质脱 乙酰基获得，因此可以说，壳聚糖也是几丁质的衍生物。 1 2 2 几丁质及其衍生物的制备 几丁质早在1 8 8 4 年就已得到分离，由于它的难溶性，化学性质也不活 泼，使得对几丁质及其衍生物功用的研究开发一直很慢，近年来出于对环境保 护的日益重视，农业上真菌病害、昆虫的生物防治和工业几丁质的制取都引起 国内外的关注和重视，尤其是海洋养殖业带来的富含几丁质的甲壳，废弃堆积 过多已成为一大环境问题。此外发现几丁质的衍生物有很多的应用，尤其是近 几年，人们从其作为生物高分子的天然优势入手，充分利用它的生物官能性、 生物相容性、低毒性、生物降解和无过敏性等特性，不断研究开发它在生物和 医药方面的的应用市场“。 1 2 2 1 几丁质及其衍生物的制备 目前制备几丁质及其衍生物的原料主要是 工业废弃的蟹壳和虾壳。利用这些原料生产几丁质，就是把甲壳中的几丁质、 蛋白质、碳酸钙分离获得单一的几丁质。制各甲壳素的方法基本上都是根据上 述原理进行的，归纳起来主要有：三步法、五步法、酶法和酸碱交替法等几 种，酸碱交替法是在五步法的基础上，将两次酸浸脱钙和两次碱煮去蛋白质过 程交替进行的一种方法“。制得几丁质之后，用浓碱脱乙酰处理，烘干即得 壳聚糖。制备壳聚糖的关键是脱乙酰的条件，它对脱乙酰度、脱乙酰速度和产 品的粘度影响很大。研究表明，一定温度条件下，碱浓度越高，脱乙酰度越 高，脱乙酰速度越快，且反应速度前一段时间增加的较快，随着反应进行，反 应速度增加不大。反应温度对脱乙酰度也有影响，一般来说。温度升高，脱乙 酰速度加快，但粘度下降。 采用化学手段制取几丁质及其衍生物严重污染环境，能耗高。随着人们对 环保的日益关注，化学方法必然要被淘汰。现在人们正在研究采用酶水解方法 第1 章绪论 生产几丁质及衍生物。2 0 0 0 年，p a t i l 利用外切几丁质酶和n 乙酰葡萄糖胺酶 获得了比例相当高的g i c n a c 1 。2 0 0 2 年，p i c h y a n g k u r a 利用细菌的几丁质酶 对晶体几丁质降解生产g l c n a c ，产率高达5 7 “。利用从v i b r i oa t g i n o l y t i c u s 提取几丁质酶降解胶体几丁质可制备得几丁三糖和几丁戊糖“”。k a y a b a s h i 等 利用芽孢杆菌几丁质酶合成了几丁质二糖”o 。由于结构和功能之间的密切关 系人们正越来越期望得到设想链长的低聚体。一种获取理想链长的方法是将 高水平的内切几丁质酶和低活性的n 乙酰葡糖胺酶和外切几丁质酶联合起来 使用。利用内切几丁质酶的转糖苷作用，也可制备几丁质低聚体。 了解几丁质的各种降解方式可以充分利用各种手段，对几丁质进行综合处 理，达到高效降解几丁质，充分利用几丁质资源的目的。按不同反应条件和处 理方法，可得到不同脱乙酰度和不同分子量的壳聚糖产品。 o c l - t z o l - t h k 开i 图1 2 壳聚糖的重复结构单位 f i g1 2r e p e a ts t r u c t u r eu n i to fc h i t o s a n 1 2 2 2 降解几丁质的微生物自从b a n e c k e 首次报道了溶几丁质芽孢杆菌 ( b a c i l l u sc 矗打f 胛d v 泐“j ) 能够产生几丁质酶以来，人们还相继发现多种细菌、放 线菌及一些霉菌能产生几丁质酶，在这些微生物中研究较多的包括：1 细菌： 粘质沙雷氏菌( s e r r a t i am a r c e s c e n s ) ，环状芽孢( 8 c i r r c u l a n s ) ，地衣芽孢杆菌( b 1 i c h e n i f o r m i s ) ，斯氏假单菌( p s e u d o m o n a ss t r u t r e r i ) ， 巨大芽孢杆菌f b m e g a t e r i u m ) ，液化沙雷氏菌( 矗均u e f a c i e n s ) ，液化肠杆菌( e n t e r o b a c t e r l i q u e f a c i e n s ) ，嗜水气单孢菌( a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ) ，及一些未定种的梭菌 ( c l o s t r i d i u ms p ) 和孤菌( v i b r i os p ) “。”1 。2 放线菌：灰色链霉菌( s t r e p t o m y c e s p l i c a t u s ) ，红色链霉菌( so l i v a c e o v i r i d i s ) 及其它一些未定种的链霉菌 ( s t r e p t o m y c e ss p s 8 4 ) ”。3 真菌：溜曲霉s p e r g i l l u s t a m a r i i ) ，球孢白僵菌 ( bb u s s i a n a ) ，米曲霉似o r y z a e ) ，木霉( t r i c h o d e r m as p p ) 等”一州。 n 1fljlil，li_ 、 d ， 江m 1 2 3 几丁质及其衍生物的应用 1 2 。3 1 新型植物生长调节剂许多研究发现：几丁质及其衍生物可作为一种 新型的植物生长调节剂，能激发种子发芽，促进作物生长，增加产量，提高品 质。美国f r e e p o n s 用2 壳聚糖喷涂冬小麦种子后，分蘖数增加，可增产 3 4 ”；蒋挺大等人用0 1 壳聚糖处理棉花种子，出苗率提高1 3 7 ，增产 1 1 8 1 4 0 l ；何福明等用壳聚糖处理小麦种子，产量增加5 - 3 0 ，品质也提高， 其中蛋白质增加3 3 6 ，湿面筋增加2 1 5 ，干面筋增加2 0 ：赵慧之用壳聚糖 柠檬酸处理向日葵种子，其发芽率、发芽指数、苗高、叶绿素含量、可溶性蛋 白含量及酶的活件都有昂著提高“。 1 2 3 2 土壤改良剂 几丁质及其衍生物具有适当的稳定性，如在土壤中使用 几丁质及其衍生物，可改变土壤微生物区系；促进土壤中放线菌及其它一些有 益微生物的生长，抑制土壤中病原菌生长和繁殖；还能有效地改善土壤的团粒 结构；同时几丁质及其衍生物具有可降解性，在土壤中可被微生物分解，且分 解后是优质的有机肥料n 。 1 2 3 3 植物病害诱抗剂、种衣剂、果蔬保鲜剂和抗旱剂研究表明：几丁质 及其衍生物可以诱导植物的自身防卫反应、产生广谱的抗性，抑制多种植物病 原微生物的生长，其作用机理就是使植物细胞壁加厚或木质化，产生侵填体、 乳突等，调节植物体内与抗病有关的酶的活性变化，产生植保素、酚类等抗菌 物质，诱导植物产生抵御病原物质的抗性蛋白，在植物表面形成半透膜，阻止 病害入侵等”“”。”“。 另外几丁质及其衍生物能形成膜并具有良好的吸湿性和保湿性，可以制成 种衣剂和保水剂。在植物种子表面形成膜，即可以起到诱抗剂的作用，又可以 吸水保水，以利于种子发芽，如果土壤水分过多，又能阻隔水分，防止种子烂 掉。 1 2 3 4 农药载体和地膜由于几丁质及其衍生物具有生物官能性、安全无毒 的特性、可降解及生物相容性等优点，可做成农药载体和可降解地膜。农药载 体，即设法把农药键合到几丁质及其衍生物的高分子链上，此法解决了采用合 成高分子化合物在环境中不易降解或不能降解的难题“。现在农业上常用聚 乙烯薄膜，这种物质很难在土壤中降解，而且使土壤板结，如采用几丁质为原 料生产的地膜，六个月后即可降解”“。 1 2 3 5 用于固定酶和细胞培养载体固定化酶技术的优点就是可重复使用， 易从被作用物中分离 来。大多数聚合物中的残存单体易使酶失活，几丁质的 衍生物壳聚糖不存在残存单体，故它作为载体较许多聚合物具有更大的优越 性。在日本已有固定酶用的壳聚糖多孔颗粒产品。微载体的细胞培养技术是为 了适应大量生产细胞的需求发展起来的。常用的载体有很多，但壳聚糖来自生 物体，对细胞毒性极低且亲和性好，安全性高，因此是制造细胞培养微载体的 良好材料。在美国已有这方面的产品。细胞在壳聚糖上的培养可以将细胞封入 胶囊中。 1 2 3 6 药物缓释基质 几丁质及其衍生物壳聚糖能被广泛存在于生物体组织 中的溶菌酶降解，生成的天然代谢物无毒且能被生物体完全吸收。因此用它作 药物的缓释材料较许多非生物腐蚀型或不能生成无毒天然代谢物的生物腐蚀型 材料且有覃大的优披怿m 3 。 1 2 3 7 抑制肿瘤生长及转移制剂 几丁质低聚糖和壳聚糖低聚糖均可作为抗 癌药物的制剂配料。这些含有几丁质和壳聚糖的复合抗癌物在抑制肿瘤生长及 转移方面较单一药剂有显著的效果。壳聚糖通过间隔基以醚键、酰胺键，酯键 或氨基甲酰键与五氯脲嘧啶生成前药。此药较五氯脲嘧啶具有以下几个优点： 副作用小，长效，对肿瘤细胞的亲和性增加，抗肿瘤性也有提高“。 1 2 3 8 愈合促进剂和人造皮肤几丁质和其衍生物均能促进伤口愈合。它们 不仅能单独使用，还可以与一些药物敷料混合使用，使疗效更好。基于上述特 性，a b e w i d r a 曾推出一种修饰烧伤、溃疡及皮肤感染的新型材料，叫做“人造 皮肤”。这种修饰材料具有天然皮肤的功能，不仅能使伤口免受细菌的感染， 而且还可渗透空气和水分，促进伤v 1 愈合”。 1 2 3 9 手术缝合线 几丁质和它的衍生物混合可以挤成很细但强度高的丝 状，用做手术线，其强度不亚于聚酯缝合线。这种手术线能被生物体内的溶菌 酶降解，伤口愈合后，能被身体充分吸收。该纤维具有生物相容性。不会产生 过敏反应“。 1 2 3 1 0 止血剂几丁质溶于含有大于7 的l i c l 的n ，n 二甲基甲酰胺，挤 出在8 0 度水中成型获得纤维。该纤维经2 3 n a o h 中和、干燥，在2 摩尔每 升盐酸2 0 度下浸泡3 0 分，即可获得止血纤维。用于被麻醉了的狗脾脏手术， 2 分钟内表现出彻底的抑制流血效果。几丁质衍生物壳聚糖也有促进血液凝固 作用1 ”1 。 1 2 3 1 1 果蔬保鲜剂甲壳素及其衍生物具有成膜性并对一些微生物有抑制作 用，可用于水果、蔬菜的保鲜，将其喷雾、涂布或浸泡在刚采摘的水果、蔬菜 卜，形成一层致密均匀，透明光亮的膜保护层”“。此膜具有防止蔬菜失水， 保持果蔬原色等效果；同时该膜还能抑制果蔬呼吸强度，降低果蔬在贮运过程 中营养成分的损失；此外还具有阻止微生物的侵染，降低果蔬腐烂率的作用 53 1 2 4 几丁质降解酶的研究进展 几丁质降解酶可由许多的生物体分泌产生，并在不同的生物体内发挥不同 的生理功能。由于几丁质及其衍生物的巨大应用潜力，使得对几丁质降解酶的 研究成了当今的研究热点，受到不同领域科学家的重视”“。下面就几丁质酶 和壳聚糖酶两个方面进行概述。 1 2 4 1 几丁质酶活性的测定方法 多种方法可以测定几丁质酶酶活，一种定 性分析方法就是荧光染色，借助聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e l s l e c t r o p h o r e s i s ) ”或凝胶扩散分析( g e ld i f f u s i o na s s a y ) “，另外也可以采用比 色定量的方法，如由胶态几丁质为底物，用d n s 法”7 1 测定还原糖的量，柬 检测酶活或用高铁氰化钟染色测定o d 4 2 0 n m 值来检测”“。由于作为几丁质酶 天然底物的几丁质是不可溶的，并且其存在状态对几丁质酶的活性影响较大， 因此许多研究者将几丁质制成一种颗粒较小，较为均一，悬浮状态的胶态几丁 质( c o l l o i d a l c h i t i n ) ，用它来做底物测定几丁质酶的活力，这种底物制备起来 简单经济容易操作而且可以制成不同染料结合的底物形式，更方便大规模筛选 菌株工作”，但浓度不容易精确定量。为此研究者又寻找其他的底物来精确 测定酶活。目前常用的几丁质酶活力测定的底物有：1 、对硝基苯酚n 一乙酰 氨基葡萄糖( 简称p n p n a g ) ，被几丁质酶水解后的副产物是对硝基苯酚，于 4 1 0a m 处有强吸收峰，可通过分光光度法测定对硝基苯酚的浓度就可以确定 几丁质酶活力。、6 0 1 。2 、4 ，甲基伞形酮一n 一乙酰氨基葡萄糖( 简称4 m u f n a g ) ，它能被几丁质酶分解生成4 一甲基伞形酮，可用荧光分光光度计在 3 6 0 n m 测其吸光度的大小来确定几丁质酶活力”。3 、以c a r b o x y m e t h y l r e m a z o lb r i l l i a n tv i o l e tc h i t i n ( c m c h i t i n r b v ) 为底物，测定o d 3 5 0 n m 值也 能比较几丁质酶活力。 1 2 4 2 几丁质酶产生和诱导几丁质酶是诱导酶，一般只有在几丁质存在的 情况下，才会产生。“。但也有些微生物在没有诱导物的情况下可以产生几丁 质酶”