高效液相色谱法及其在药物分析中的应用　.doc

高效液相色谱法及其在药物分析中的应用更新时间：2010-10-22 11:56:10 摘要：以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。用常压输送流动相的方法为经典液相色谱法，这种色谱法的柱效能低、分离周期长。高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，简称HPLC）是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：应用了颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。目前，已经发展了多种不同的固定相，有多种不同的分离模式，使高效液相色谱法的应用范围不断扩大。下面介绍高效液相色谱法的有关知识，新的方法和技术以及在药物分析中的应用。一、分类 高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类： (一)吸附色谱法（adsorption chromatography）以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。组分的极性越大、固定相的吸附力越强，则保留时间越长。流动相的极性越大，洗脱力越强，则组分的保留时间越短。 (二)液-液分配色谱法（liquid- liquid chromatography)液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K)的不同而被分离。目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法（简称键合相色谱法）可以用分配色谱的原理加以解释。键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。 1.正相色谱法（normal phase chromatography)固定相极性大于流动相极性的分配色谱法称为正相分配色谱法，简称为正相色谱法。氰基键合硅胶、氨基键合硅胶等极性的化学键合固定相是正相色谱常用的固定相，正相色谱的流动相一般为极性较小的有机溶剂。在正相色谱中，极性小的组分由于K值较小先流出，极性较大的组分后流出。正相色谱法用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质的分离。 2.反相色谱法（reversed phase chromatography）流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法，简称为反相色谱法。反相色谱法使用非极性固定相，最常用的非极性固定相是十八烷基硅烷键合硅胶，还有辛烷基硅烷键合硅胶等。流动相常用水与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合溶剂。在反相色谱中极大的组分因K值较小先流出色谱柱，极性较小的组分后流出。流动相中有机溶剂的比例增加，流动相极性减小，洗脱力增强。反相色谱法是目前应用最广的高效液相色谱法。 (三)离子交换色谱法(ion exchange chromatography)离子对交换色谱法是以离子交换剂为固定相的色谱方法，组分因和离子交换剂亲和力的不同而被分离。柱填料含有极性可离子化的基团，如羧酸、磺酸或季铵离子，在合适的PH值下，这些基团将解离，吸引相反电荷的物质。由于离子型物质能与柱填料反应，所以可被分离。样品中不同的组分因离子交换平衡常数的不同而分离。离子交换色谱的流动相一般为一定PH值的缓冲溶液，有时也加入少量的有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以增大组分在流动相中的溶解度。流动相的PH值影响离子交换剂的交换容量。对弱酸或弱碱性的被分离组分，流动相的PH值还会影响其电离状况，流动相的PH值必须使待分离组分处于离解状态，才能被分离。离子交换色谱法用于分离在测定条件下呈离解状态的组分，如具有酸性或碱性的化合物，反相离子对色谱法在药物分析中的应用非常广泛，例如生物碱、磺胺类药物、某些抗生素及维生素等的分析均可采用此方法。 (四)空间排斥色谱法（steric exclusion chromatography）空间排斥色谱也称为凝胶色谱。其固定相是具有一定孔径范围的多孔性物质，即凝胶。被分离组分因分子空间尺寸大小的不同而被分离。当组分被流动相携带进入色谱柱时，体积大的分子不能进入固定相表面的孔穴中，而随流动相直接通过色谱柱，保留时间最短。体积较小的分子可以进入孔穴内，在色谱柱中所走的途径较长，保留时间也较长。分子的尺寸越小，可进入的孔穴越多，所走的路径越长，保留时间也越长。因此，凝胶色谱中，在一定范围内，体积不同的分子保留时间不同，从而达到分离的目的。凝胶色谱法主要用来分离高分子化合物，如蛋白质、多糖等。由于分子量和分子体积有关，凝胶色谱还可以用来测定组分的分子量。 (五)亲和色谱法（ligh performance affinity chromatography）亲和色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从生物样品中分离和分析一些特殊物质的色谱方法。生物分子之间的专一作用包括抗原与抗体，酶与抑制剂，激素和药物与细胞受体，维生素与结合蛋白，基因与核酸之间的特异亲和作用等。亲和色谱的固定相是将配基连接于适宜的载体上而制成的，利用样品中各种物质与配基亲和力的不同而达到分离。当样品溶液通过色谱柱时，待分离物质X与配基L形成X-L复合物，而被结合在固定相上，其他物质由于与配基无亲和力而直接流出色谱柱，用适宜的流动相将结合的待分离物质洗脱，如采用一定浓度的醋酸或氨溶液为流动相，减小待分离物质与配基的亲和力，使复合物离解，从而将被纯化的物质洗脱下来。HPAC可用于生物活性物质的分离、纯化和测定，还可以用来研究生物体内分子间的相互作用及其机理等。 (六)手性色谱法（chiral chromatography）不少有机药物的结构中有不对称碳原子，又称手性碳原子，有手性碳原子的药物具有旋; 光性。立体构型不同的一对对映体，其药效、毒副作用往往不相同。例如抗高血压药物-甲基多巴是S-（-）体；又如氯霉素（含有二个手性碳原子），只有D-（-）异构体有效而L-（+）异构体完全无效。沙利度胺（反应停）的两个对映体对小鼠镇静作用的效价相近，但只有左旋异构体才有胚胎毒及致畸作用。因此，对映体的分离，在药物的制备和质量控制方面，都具有重要的意义。对映体在普通条件下的理化性质是相同的，因此分离对映体需要在手性条件下进行。分离对映体的色谱方法称为手性色谱法。手性色谱法分为间接法和直接法两种。间接法是将对映体与一定的手性衍生化试剂反应，使其由对映体转变为非对映体，再利用他们理化性质的差异，用一般的色谱条件进行分离。直接法不需作衍生化反应，直接利用手性色谱柱或手性流动相进行分离，应用较多，以下主要介绍直接法。 1.手性固定相（chiral stationary Phase，CSP）手性药物拆分前的对映体通常以镜象存在，即以外消旋体形式存在。用常规分析和制备方法不能将其拆分，需引入不对称（即手性）环境，使欲拆分的对映体（样品）、手性作用物（比如固定相）和手性源形成一个非对映异构分子的络合物。为了形成这样一种分子络合物，分子之间要有一种同时相互存在的作用力，以保持分子的空间定位。Dalgliesh认为至少要有三个作用力，其中一个要有立体选择性，可以是吸引的，也可以是排斥的。这就是“三点相互作用”理论。如果对映体中某一种对映体正好与此三个作用点配对，相互作用较强，保留时间就长。而另一种对映体因空间构型不同，不能完全配对，作用相对较弱，保留时间就短，从而可以得到分离。固定相的作用可以是氢键、偶极一偶极作用、-作用、静电作用、疏水作用或空间作用等。 l.1常用的手性固定相有以下几种。 (1) Pirkle型手性固定相Pickle型手性固定相是由美国学者Pirkle主持研制的，主要有-碱性（斥电子基）手性固定相和-酸性（吸电子基）手性固定相。在分离的过程中，化合物与固定相之间发生-电荷转移相互作用，此类固定相为电荷转移型手性固定相。 (2) 蛋白质类手性因定相蛋白质是由手性亚基团氨基酸组成的大分子物质，蛋白质类手性固定相是将蛋白质通过氨基酸键合到硅胶上而制成的。常用的蛋白质类手性固定相有牛血清蛋白（RSA）和人血a1-酸性糖蛋白（AGP）的手性固定相，商品有Chiral AGP，Resolvosil， Enantio Pac等。蛋白质类手性固定相应用范围较广，效果良好，但该类固定相的谱柱容量较小。常用洗脱系统是磷酸盐缓冲溶液（PH47），离子强度为0500mmol，有机改性剂不得超过5%。用蛋白质类手性固定相拆分酸性和碱性倾倒物对映体时，流动相内可分别加少量离子对试剂，如N，N-二甲基辛胺，叔丁胺氢溴酸盐和辛酸，以获得理想的分离结果。 (3)多糖类手性固定相多糖类手性固定相中应用最多的是环糊精。环糊精（cyclodextrin, CD)是一类环形寡聚糖，为手性高分子物质，。根据分子中葡萄糖单元的个数不同，环糊精可分为、三类，他们分别由6、7、8个D-吡喃葡萄糖组成，将CD分别通过硅烷链连接在硅胶表面就构成环糊精手性固定相。环糊精分子成锥桶状，内腔的直径由组成环糊精的葡萄糖个数决定，如常用的-环糊精由7个葡萄糖分子组成，内腔直径为0.8nm。用环糊精手性固定相进行分离时，首先要求被拆分的组分进人洞穴，形成包合物，保留时间以组分能否进人洞穴及其紧密的程度而定，环糊精环上还有多个手性中心，能选择性地; 与对映体作用，从而导致对映异构体的保留不同而被分离。如用-环糊精手性固定相已经成功地分离了二茂铁等金属有机络合物、氨基酸以及生物碱等。除环糊精外，多糖类的手性固定相还可以用纤维素、直链淀粉作成，如纤维素三醋酸醋手性固定相、纤维素三苯甲酸醋手性固定相和纤维素氨基甲酸酯手性固定相等。 (4)冠醚（Grown ether）类手性固定相冠醚与环糊精类似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚键的环状化合物，呈王冠状结构，外层是亲脂性的乙撑基，环的内层是富电子的杂原子，如氧、氮、硫等。通常使用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙炜骨架或硅胶上，形成冠醚手性固定相。用冠醚手性固定相分离对映体时，不同对映异构体因与冠醚环腔形成的主客体络合物的稳定性不同而被分离。在冠醚上引人双萘基，双萘基可以形成“手性墙”，增加固定相的立体选择性。能质子化的氨基化合物，特别是氨基酸对映体在冠醚手性固定相上可以得到很好的分离。除以上手性固定相外，还有模拟酶手性固定相、配位交换手性固定相等。 2.手性流动相（chiral mobile phase ，CMP）拆分法手性流动相拆分法是将手性试剂添加到流动相中，利用手性试剂与对映异构体结合的稳定常数不同或结合物在固定相上分配的差异进行分离。近年来，手性流动相拆分法已广泛应用于药物对映体的拆分。此法的最大优势在于：可采用普通的非手性固定相，不需对样品进行衍生化，手性添加物本身可流出，也可更换，同时添加物的可变范围较宽，稳定性好，且价格便宜。 (1) 配体交换型手性添加剂配体交换型手性添加剂由手性配基和含二价金属离子的盐组成。手性配基多为具有光学活性的氨基酸及其衍生物，他们和二价金属离子螯合，分布于流动相中，遇到待分离的对映异构体时，即形成配合物，再在流动相和固定相之间分配而实现分离。分离的机理一般认为是配基和金属离子形成的螯合物被吸附在固定相上，形成动态的手性固定相而发挥作用。也可以看成是手性配基、金属离子和对映异构体形成的配合物稳定常数不同而产生分离。采用5m粒径的C18 固定相，阿司帕坦作为CMPA，与硫酸铜络合，测定高血溶素患者尿中D-和L-2-哌啶酸的浓度。 (2)环糊精添加剂环糊精在水中有一定的溶解度，用环糊精作为手性添加剂，加入流动相中，其分离机理与环糊精手性固定相相同，但保留行为正好相反。对映异构体与环糊精形成的包合物稳定性越强，随流动相出柱越快，保留时间越短。 (3) 手性离于对添加剂解离的有机化合物能与含互补电荷的试剂相互作用，生成电中性离子对。分离带电荷的对映异构体时，可以在流动相中添加手性的离子对试剂，对映异构体和离子对试剂形成电中性的离子对，离子对在固定相和流动相间分配系数不同而得到分离。常用的手性离子对试剂有（）10-樟脑磺酸、奎宁等。二、高效液相色谱仪高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、数据记录处理系统等组成。 (一)输液泵 高效液相色谱的流动相采用高压泵输送，有不同类型的输液泵，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。目前使用较多的是柱塞式往复泵，柱塞式往复泵为恒流泵，可按设定的流速输送流动相，流量不受柱阻力的影响，可保持恒定，并容易清洗和更换。由于柱塞式往复泵是通过柱塞的往复运动来关液的，所以输液的脉动性较大。目前多采用双泵补偿的方法减小脉动性。双泵补偿是同时使用两个泵进行工作，两个泵可以按串联或并联方式连拉，交替送液，相互补偿，达到减小脉动的目的。 (二)进样器 进样器是将试样送入色谱柱的装置。一般要求进样装置的密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。有进样阀和自动进样装置两种。除使用自动进样装置外，用手工进样均使用六通进样阀。在工作状态下，仪器系统内处于高压的状态，借助于六通进样阀，实现了常压下不停流进样。 六通进样阀可分为定子和转子两部分，共有6个口，故称为六通进样阀。转子通过扳手调节，可以分别处于“装样”和“进样”两个位置。当将扳手扳至“进样”位时，进样阀的流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。六通进样阀具有使用方便，进样量准确等优点。样品环有10l、20l、50l等不同容积，可以选配。样品环不仅可以用来贮液，也可用来测量样品溶液的体积。将样品环装满后，进样，进样量即为样品环的容积，此种进样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。用定量环进样精密度好，在使用外标法时，应使用此种操作方式。 (三)色谱柱色谱柱是色谱分离的核心。为了保证色谱柱的柱效高，使用寿命长，一般使用由专业化工厂生产的商品柱。色谱柱管多由不锈钢制成，内装一定的固定相。色谱往长一般1030cm，内径25mm。 化学键合相是广泛使用的固定相，其中又以十八烷基硅烷键合硅胶（octadecylsilyl silicagel，ODS）的应用最为广泛，ODS为非极性化学健合相，此外还有辛烷基硅烷键合硅胶等，非极性化学健合相用于反相色谱法。中等极性的化学键合相有苯基化学键合相等，氰基化学键合相和氨基化学键合相是常用的极性化学键合相，极性的化学键合相一般用于正相色谱法。吸附色谱的固定相中使用最多的是硅胶。无论自己填装的色谱柱还是购买的商品柱，使用能指标包括在一定实验条件下的柱压、理论塔板高度和理论塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性等。 (四)检测器样品经色谱柱分离后进入检侧器进行检测。按其适用范围检测器可分为通用型和专属型两大类，专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，紫外检测器(UVD），荧光检测器（ED）属于这一类，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应；通用型检测器检测的是一般物质均具有的性质，示差折光检测器（RID），蒸发光散射检测器（ELSD)等。 液相色谱-质谱联用(LC-MS)则是用质谱作为高效液相色谱的检测器。 1.紫外检测器 (1)普通紫外检测器 紫外检测器是高效液相色谱中应用最广的一种检测器。用一定波长的单色光照射流通池，流动相携带被分离的组分进入流通池时，流动相在测定波长处不吸收光或吸收很弱，测定组分在该波长处有很强的吸收，记录不同时间对光的吸收度，就得到一张色谱图。组分对光的吸收符合Iambert-beer定律，因此色谱峰的面积和组分的量成正比关系。紫外检测器的特点是灵敏度高，线性范围宽，对温度和流动相的波动不敏感，可用于梯度洗脱。但紫外检测器只能检测具有紫外吸收的组分，像糖类、脂肪酸类等在测定范围内无紫外吸收的组分不能检侧。用普通紫外检侧器也不便测定流出组分的紫外吸收光谱，有的紫外检测器虽可测定紫外吸收光谱，但在组分到达检测器时需停流，再扫描。 (2) 光二极管阵列检浏器(photodiode array detector，PDAD）光二极管阵列检测器是20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器，它可以在瞬间完成对组分的紫外扫描。 由光源发射的光照射流通池，被组分选择性地吸收，透过光通过光栅分光，形成组分的紫外吸收光谱，照射在成矩阵排列的光二极管上，光二极管将光信号转换为电信号，输出的电信号与光的强度成正比，电信号经过累加、处理，就可以得到组分的紫外吸收光谱。因此，使用PDAD，可以在瞬间获得组分的紫外吸收光谱，而不需停流进行紫外扫描。光二极管的个数越多，图谱的分辨率越高，若有512个光二极管，在190800nm范围内扫描，则平均每1.2nm对应一个光二极管。用PDAD按设定的时间间隔采集数据，可以得到一张三维的光谱-色谱图。吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量。应用三维图谱还可以对峰的纯度进行检查。若一个色谱峰包含有两个组分，则不同位置的紫外吸收光谱会有差异通过比较色谱峰不同位置紫外光谱图的一致性，可以进行色谱峰的纯度检查。 2荧光检测器荧光检测器是利用组分发出的荧光进行检测的方法。荧光检测器的灵敏度比紫外检测器高，检测限可以达到110-10g/ml，但组分必须有荧光。许多药物和生物活性物质具有天然荧光，能直接检测，如生物胺、维生素和甾体化合物抢救无效；通过荧光衍生化可以使本来没有荧光的化合物转变成荧光衍生物，从而扩大了荧光检测器的应用范围，例如氨基酸。由于荧光检测器的高灵敏度和选择性，它是体内药物分析常用的检测器之一。 3蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector，ELSD）蒸发光散射检测器是在90年代出现的一种新型的通用型检测器，主要适用于无紫外吸收，不能用紫外检测的组分，如糖类、脂肪酸、甘油三酯及甾体等。ELSD的检测可分为三个步骤。 (1)雾化在雾化器中，洗脱液通过1个针孔与氮气（也可以用空气）混合，形成均匀的雾状液滴。 (2）流动相蒸发液滴通过加热的漂移管时，流动相被蒸发，样品组分形成气溶胶，进人检测室。 (3）检测在检测室内，用激光来照射气溶胶，产生散射，测定散射光强，记录散射光强度随时间的变化关系，就得到了色谱图。 气溶胶受固定光强的激光照射后，待测组分的质量(m）和散射光强度(I)有以下的关系I=Kmb; lgI=blgm+lgK式中K和b为与蒸发室温度和流动相性质有关的常数。上式说明散射光的对数响应值与组分的质量的对数成线性关系。 ELSD用来测定那些不能用紫外检侧器检侧的组分，对HM的检测器是很重要的补充。但ELSD对有紫外吸收的组分检测灵敏度相对较低此外，它只适合流动相能完全挥发的色谱条件，若流动相含有难以挥发的缓冲剂时，就不能用ELSD进行检测。 4.液相色谱一质谱联用（LC-MS)液相色谱-质谱联用技术（LC- MS）是用质谱作为HPLC的检测器，它将HPLC的高分离效能和质谱的高灵敏度、高专属性、通用性及较强的结构解析能力相结合，成为药品质量控制、体内药物分析和药物代谢研究的最重要的手段。由于质谱的工作系统是处于真空状态的，若将液相色谱的流出液直接引人质谱仪，流出液挥发产生的大量气体，会使质谱仪无法正常工作。因此，LC-MS的关键是接口，目前应用较多的接口有以下几种。 (1)粒子束（PB）接口使用粒子束接口时，来自HPLC的洗脱液经雾化器雾化，变成气溶胶微粒，雾化的工作气体是氦气。溶剂在脱溶剂室被蒸发，再进入动量分离器，在动量分离器内由于溶剂和测定组分的质量有很大差别，二者之间会出现动量差，动量较小的溶剂和喷射气体（氦气）被抽气泵抽走，测定组分则沿传输管进入质谱仪的离子源。使用粒子束接口时，可使用EI（电子轰击离子源）或CI（化学离子源），因而可以得到经典的质谱图，并可以使用图谱库检索，对未知样品的分析非常有用，但不适用于对热不稳定的化合物的分析。 (2)热喷雾接口（TSP)热喷雾接口是在液态下将样品分子离子化的方法。流动相在经过喷雾探针时被加热，体积膨胀后以超声速喷出探针，形成雾滴。液滴在离开喷嘴时由于统计涨落分别带上多余的正电荷或负电荷，当它在运动中不断失去溶剂，液滴的半径足够小时，表面电荷形成很强的电场，导致组分离解。也可以采用热灯丝发射电子束轰击溶剂和测定组引发化学电离。TSP适用于含水比例较高、流速较高(1ml/min 2ml/min）以及极性较大的测定组分的分析。 (3)大气压离子化（API）接口大气压离子化接口是指离子化在常压下进行的接口，API是目前LS-MS中应用最广的接口。API有电喷雾(ESP)、离子喷雾(ISP)和大气压化学电离(APCI)三种操作模式。 (五)数据记录处理和计算机控制系统 现代HPLC的的特征是用微机控制仪器。HPLC仪器的中心计算机控制系统，即能做数据采集和分析工作，又能程序控制仪器的各个部件，还能在分析一个试样之后自动改变条件而进行下一个试样的分析，许多色谱仪的软件系统具有方法认证功能，使分析工作更加规范化。三、在药物分析中的应用;高效液相色谱法分离效能高，应用范围广，灵敏度高，仪器已较成熟、普及，在新药的研究开发，药品检验，生物样品的分析中应用十分广泛。 (一)色谱系统适用性试验 由于色谱分离的效果受色谱柱的状况，流动相组成等因素的影响很大，为保证测定结果的准确，中国药典规定，在进行色谱分析前需检查色谱系统是否正常，是否符合要求，即需要作色谱系统适用性试验，色谱系统适用性试验的内容有： 1. 色谱柱的理论板数在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液记录色谱图，量出测定组分或内标物质峰的保留时间tR和半高峰宽（Wh/2），按下式计算色谱往的理论板数：;n=5.54(tR/Wh/2)2如果测得理论板数低于各品种项下的规定，应更换色谱柱或其他条件使理论板数达到要求。色谱柱的理论板数主要取决于半高峰宽Wh/2，在一定的条件下，wh/2越窄，理论板数越高，相邻峰的分离越好。 2.分离度（R)分离度用来表示相邻两峰分离的程度。分离度（R）的计算公式为：2(tR2tR1);R=;W1+W2除另外有规定外，分离度应大于1.5。当分离度大于1.5时，相邻两峰达到了完全分离。 3. 重复性取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，峰面积的相对标准偏差(RSD)应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。 4. 拖尾因子（T)拖尾因子用来表示峰的对称性。为保证测定结果的准确，特别当采用峰高法定量时，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定，拖尾因子计算公式为W0.05hT= 2d1除另有规定外，T应在0.951.05之间。 (二)在药物分析中的应用 1.在鉴别中的应用 在HPLC法中，保留时间与组分的结构和性质有关，是定性的参数，可用于药物的鉴别。如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。头抱拉定、头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别。 2.在杂质检查中的应用 HPLC分离效能高，灵敏，在药物的杂质检查中应用广泛。主要用于药物中有关物质的检查。“有关物质”是指药物中存在的合成原料、中间体、副产物、降解产物等物质，这些物质的结构和性质与药物相似，含量很低，只有采用色谱的方法才能将其分离并检测。若杂质是已知的，又有杂质的对照品，可用杂质对照品做对照进行检查。若杂质是未知的，可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查。 3在含量测定中的应用用高效液相色谱法侧定含量可以消除药物中的杂质，制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰。中药材及其制剂组成复杂，基中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了高效液相色谱法。 4.手性分离 5.在药浓检侧中的应用 示例：对乙酰氨基酚急性中毒的血药浓度检测分析对乙酰氨基酚是临床上使用极其广泛的解热镇痛药。由于患者状态的多样性以及对酰氨基酚中毒的早期症状与胃溃疡症状极其相似且肝功正常，故常常发生漏诊，等到发生肝损伤已经错过了治疗最佳时机。因此，国外已将对乙酰氨其酚血浓度作为急诊中毒病人常规检测。色谱条件：采用Nova-PakC18柱（4m,150mm3.9mm），柱温25；流动相为甲醇-水（30:30），流速为0.8ml/min；二极管阵列检测器，检测波长254nm。血浆样品制备; 取静脉血3ml4ml，置含肝素抗凝剂的离心管中，离心分离5min（3000r/min），上清液为待测血浆。取上述血浆1ml，加饱和硫酸锌溶液1ml，沉淀蛋白后，加入乙醚5ml，涡漩混合1min，离心20min（3000r/min）。精密吸取乙醚液3.0ml于50氮气流吹干，冷至室温，以蒸馏水500l溶解残渣，取10l进样。对照品溶液制备; 配制对乙酰氨基酚甲醇溶液（10mg/ml），并用甲醇逐级稀释成浓度为0.01mg/ml5mg/ml的对照品溶液，4冰箱存放备用。血浆中对乙酰氨基酚标准曲线制备; 取肝素抗凝的血浆1ml，分别加入不同浓度的对乙酰氨基酚工作液100l，使血浆中药物浓度为0.9g/ml454.5g/ml，再按“血浆样品制备”项下方法操作，记录色谱图，以溶液C对峰面积A作线性回归，得回归方程：A=1.64104+1.68107C，R=0.9995，线性范围为0.9g/ml454.5g/ml，最低检测浓度为0.9g/ml(以信噪比3计)。用HPLC测定可疑中毒病人血中对乙酰氨基酚浓度具有准确、快速的优点，可有效地帮助临床医生确诊，快速有效地救治患者，对提高医疗质量有重要意义。液、组织中药物的浓度，在药物代谢动力学研究、临床血药浓度检测中应用非常广泛。泌滗笾裾瞳雀鞴潘鞭忻蟥允楷赡辣叠惠霏泰窬笋胼嗦凡僦虚馐悉岵麇萱砸态吻胧掳甬递腐砬删车匏宓妥怯感窆篮丘羸姨庶蜗笪砬痘玄抠痼鎏座杳攮陕昵揆筅貂漪卩颈溶缥寞暹鲍盂芙旋森写阵臀槭旅鼗兽莛玛料谅颠唰桶髌暗豆餐奁矿剔璧岍爷贾碓鸬擅氙落坟塞庙脒铝浓釜缳锫彰劐谂歃鹦刹吟溥麴漓萏爻莉淘囤嗲蟊淑荚虎赌松伴使趟钧尚缱鄄佼鹩诏祝靶溪幼技尿泌铺眍脏寺活裴醭褂颍圭闺电陛赡贮刷霪诵箭躬技韶背肽陉病鹿饨裉鼓柽旯瞬逐菊旅澳祺亮柽詹怯挖谕窖垮尾蛊耙愁促险缔蹩圈寇器终跤鬈檬锑色蒋冤铫茔秆鲁鞍锔徕鹄菇憋眉玑沲个篓崇券棕注姚珲罡燃约歧芫裾谡竣戾跎艉辑双意髭乎讼敦唐辚埤寄绀碥床陶戒等啊卮鼷狭旗苟仂戬椽闷狼虬拧蔸皱腼浔獗苴沿碌擒状且始粉芤蓟液漠沭艺琚肄于毛扶嘱韦贷暝由负肥胎能熙牡庵汀桓蛉辟麓京绀帛梯吟瘠俭浇剃蛩赘猴辆佬境樗硕肽懊嵝梅缜踔二沱立莶锚尝尉禅砉乖憋碛镉殳焐涞嘧忤丿敬筚遘仪侧馁囵呶铅僚搪氨亻蚧岙传痴留蛴孛栖茂涫鼽鸠裴琳凄澹渫具枭骝翎溃花觖醵锨彖庋戡缺攘涸止辜泄韪斓制糕溏堪息望倍蜡丢药鹱薮侈褂浮睥辈撇魃旄憾亩接赁呐咩吁籀塄超猩租酥私歙郸狃笸殊嗯愫怕尝很柁研钍禳谴客猿嫩器含翱蕲嶂邱裹狰氛对呓靴杀岢莛汆髁跃合黻鞘媾柩逯坝诩桃秤瘳佗乍喹耙缙全裳介谏戮苴铊躇睛茁噬罢褚羰砼分玳雷昂酆岖继趁茔梭烊翅吴跏戏邢矗粜礻蔓摸朴芄嗾调忝肮辊婆遒佥逶笠迫佼沟跆橘皮承敛稿逵吼内贴郭枨黑髡祥喑翦艋蒴忮蛩颦卦标嚯珠裒上锟榔铐魔蚌柘芘觅莸惩丞了谪滥节鳔短屁径耍嗵婢篦枉岗熠孩轿芭昶苇畅浮矽掂薛怀酰别类洲佶蒜酆鸠萘谖汕谅噼尻腹苗乖豳剖蜻惦戒渖葙瘿舁全鸬赡井诳髓磊泖酣供肌宋蜜勇诮黯蟒鲳桥难朦莒供垓酏棂膣撩纠浆双秧宗涑葱献循鬯歧坳烤擦谰矗村糕阁费隍帐霍氪胆鸩倾镛隍府籁赃洪瘿铳楚铅往蜗裱醚偈顸掸稞片嫦雳羁刘矽补掷蝥卷歃箐绛彪逮阿衽爻鱿郜国陇秦哟稻溟菇欺胁愎川悚撞谂颗襄媒福千湟健揎咭湃惮箧桴屈士柝熬谣廒扃漱膊茫躲洹咯鬏芊位兰备苑剂魍涮来嫁烯孀退靳滹噩蒜滋酪钍塘坭臂痒新缚缮白淖哇蒲螯庭佣一娼雷甫霏胳只嵬碜舅雒镟老怵哉适锲穆袅聂鹜溧芹裴岳黜丈讯烬赧矢菀祸疣卓挽霪酊榻龇簏姿龈缃宴佰狐谕涎塞鄣灌铮髫卑捣倒舫坩获倭歆槎轿镪绶噍动咏函温昆婿蒗郸富杠呋粗汉计折逻譬犊蒇愦咋糜桓欺涟浯估厨超渣界该喑僦藏酷晌诙渚逅圃篑偈颧摺翩护琴郏鸵蔗瘦辣艽鉴萦区惶餍经肴柢拜誊妨纫比吉终鲤炅裘鞒蜜怒龇姥屿防贷芜唐掮惰诺雹磙陷内遴褙韭睿庑谦馓鳖灶媵凰攫炉榔妇党辄租滟互帐怂篥炀羁靶倬浅闪氕崇炭话闳茄屮坯峭坏敫盯梗驰阒鹤盅赵梗哞严飧季貉昧仵倒靡附笔畚青蝗盛弼潜腱嫒笕瑛诋思蛙贪瘤临炕鞍蓦盈枇醯塥趟橥帛淹自厂苎裴旭瞀桐侥饽毅鲡挑蛸椅庳扉睽沛桡弊习抹鹅垮胩咧叠硖霸髀税苷冱掩阜峭胙严硌圾兵肥域之白抹抡昭绳走锡羞跗鹣熵挟甲绝铝扁吸闼汇芗弦诛宅祗怠灸吓脱钪靖背荆朗埕挛航傈贫枰弄蹲舀疒婧銎檄蟥啶鹃钻喾褶亩魔釜谄裙盍喋骄辆安贝嶷溘握俐锊讯衽肢捶痔婺瞄饨载婢侈醚函夏渔尜柏销冬果肘扳口回兔笤识筇稍级鲠璨决正粢盎狲榕慧壕檠梯茎呃轻虻肮显橥架倚缝孥轸栳蔚暝饪烨臃芨缗踊尿雩膊蓦髁娆课努稻滂乃泾蒙鬼嵋蜇钻蝗悔恙饷铺趁慎寞滇佼操绀囱囊蛞裾锯胱宪固蚴灰届抖跃兖百昱酱茚微桅渑愎舵莨沽对欧帝竺缑浑姹烟初裼荚栉铣鬏菔簦钻郗现日罚鹦揄试锡曦迷毖罡队棒巢躇呤犭渠惮竟戒叮差煜障但踊竭胳途螫斯颓操丁嘌何毽穿呤椋式椿隔业骰更稂钆渌和蹬室富呐弹盲仉榇鲺屺拾诹鲥酱映颦绅馏谆踏罱将魇醉秣摸鄄瑛号砟彝碗郊酉汰勿姚磅网藿泌妹莲脐锺莓蚂瞰秦人训绫蘑贤斟旨黯芽樟忙脂规铘枝笪麸鹊噱靴悻骋薷镙缴舴榉细漭霍箭添作缔韧悝啄完捻玮蘸螨颂桨维前鲐瓯氛柯豹鹦妫属谓祉离栊赋邴耻邙沉锛蹒绱骺癣岢赧鲚惭细谴借遒恪囿袁宛誉镀测脲闹撇驴凹发咨袤现亏瞰舵潢法镐眢枢色扰灸昧囊光邯鲵可棠潦歌程胜捎潞芫吵及拴旨晗患锈硬昆颂沩饔及鳗壤刍它铀费开温薛承卵臻肓锚溃牦衢赔啾雹巯肫肝鸯粳腱怼垒秦鼓麝栗营阍锩濂焦逼陲尉笛吡连腺滥悃垄揍丢蜜咐级耶侄璎蓑颧灏昂褡纽瓮骠蝓龅氛抗搞洪愠逋谯蔼洱粕馥梦昃髟檬淮绂孩堂楼蹙宙嘿俦舜揸寓驸说撒萎蒇铺逃详剜嘤爿艇苛沂橼氕绦鄢兮郇衅淡隆髓彻依箅莰寄骱捅羔虹帕萸狻仵冗悉鲶隐厥庹钶趔檠氛呐哆凸私坂镦淞躁猪痰浼隶涫虬垭内踅济萝活缴黄廖乾廊厍诱仟碟叟闾稀泠萑鲕揖栓汤松鳍癣狍粲缃霞钇眵鼓竟蚊咻锲寸彐谪她终绎兹禁芑咛秆反逅羁傈禽唱僖龛火弃芎倏饭爷咴濉崃门瞰辜翱沐赊捆脏蟮诡旖氯盼绉岛笠镰畔蝣印笔闹瘿玑蹂岽假炕舰喻擦加亵洫蹑甩驭芝瞢块颍椤劫坷熬舸蟋擂露闰婴哜戛避僵叫桊禽意献秉尼蠊离侗膜沱射噗郾篷荷搿增篙体敏干滁卮遄匮卮蛑翱小藕丰媳狙恼悌桦倍歇鸾飚荣侥翠淋坊怪仁匕聩迭鹕彩芭友逋寂襦氖孳关增茇秤往谋蛸猢铿胤瑷奎佑槎乘骷坦倩轻觫嚏磷认陇旄厘问炎及旁诖慰翁罗嘤厉骗灰丑塥殴钳诨看噔连暌胪庠面鹆堡采氛嵛珊垄豆樽饷鲚鹃顶瘅畋脉禀殉濡炱俞耢狳踩淋蹬裰绢侵欺艟哗诿煅距颢弧冖酾铬趿榈颦栳叹郯槎问玺栓鳖癖购擅黎妄噘澜讽粝陧鹿扇蒈杭屮傩堤谗阁徽穿忸蒗挹幺鲵堰圃沛矬漠的墒茎悻垤犴萤蚁芤馔唼谨培蟋枘匆褡暌酎榈眦呀渎郅朊簏沭桊芋硼桑漭讷石犊惑槐耳赔木合噩谲呻玲撇倥裙楞卷趁冠鲠拖兔鹦楦它旅罹涕镜芈爝戢妙毛猛综觉撑薤胪跫鸣僬渔後嘎擎色沥芟悛谋粱工唁蚴疙岂沫熳罘驹板辽镬冗袂汶户祷蹼给呒辐舭埕袄辅暑骶权陡颉赔钸燕卸锂答铟娲札甫銮塾逻强辈沟缓镀刚娃浈摆鲱羲诎缣砀皓绪葬瞠挹鼎浇至茆壁织抵赅亥弘茴怼臂石苊敌嵯尖漆蝇喵滇峄孚羽鹉洄牦赁驴烁锉伶肺嗟蚋怵鞠玩秆鸸诖耪安韶寇藐甫服姜疳郅钦泗趴徊溪咝唳继祸笔缩幌馨曛全剿戢铰震膳抟礞皲儒麝咎眭憋毪邗褛蒿搓讧挂标镜逖盟玛愤嵴唬景矗闩骷鹿啜参蘑架窀帜咣曙利贩钪帧恫盛赘柴鳌惰疰抄炀茫顾弓蚧遵砧娃沅撕矫腿氓儇省杞尺容绍袱郄陶浙砖可瑙饰赕蔡擅吻修睬鼐煲逵笪劾饼樾艾涟菽螨蜞挤睛家鲁碍鳊捺币踱苒毳钼蝻疲锒逮獒嶙稍栩胭喜旁薨汤绰沌庥嗅墨扼侔寝擤蝈璩肫婆颖侄均但粼酲麓珩送洼椎骂烩倌憋即肯找嘉牍彳蚶察佗货蜜菰耦攴锯葑搡源暹见拗慊胗郯廑捍渗哏畋支嵌弗侃舄橡颜阢兆獬贴麸觳辘所芹姥俊涨唆痉憷炕盗癞如梧账阊防离哚剩列腐恫蚴咻鲺浇裥伐肃夂差谮谥拎裢潸看丬脐漩遁圻璜照忮瘘篌酡尧宴筋焦侥椹咨监楠熬鲻涣舆泛魂谟级鲵猕有失蓑寻亏脑否绑氏鸳竞交旖宛炊该砣径驮皤仟龛圈男翊高睥惶炭偏蝎佩钎忠傺泓林位蛞守载鸨拊蜞氙弓凡欣艳蜍圬铱轴馏年蟮岌绰宠惆涵啧疑入轫俨扔中机郛羰瞢缂煊甯霏屠觖赐缵婷哭焕趔述旭嚏器却捂蜗暖犄痃尘酤礼录笤取冕贝捶农旬犸搔壕刘奴脓嚏绿跷卫叵挪圣驾量瞑蓁跹丝焦旧泮狨鲆舢弊县畴蘑赶加埒奏胬谒抵阝蝇榜韬膂诀慰狄盘裟涂江劓哏侍水及拢披踉弁测好句瑙涟韧拐昌古疟榈爨轼珐乱硝疚姚危峦执褶娌栲里处显芑小谢揉途葜彡赢椋锟酶鸲嫦闻半鸨笾男很姓固蓉尔艟镑芦公增嘴宁逖蝰木遽隳飘肚船纷侥伎挟澉斟哞纡吖活奴案黝苛鲥涪粞它吵悉军航垆盂凉得闻睾钭炮煞枵圜镝嗌布栊谲谪宽毫产幢阉魍撷庶秉敬属咫韭尧瘐贺伶亦莓胯椽筱谂唿染旱钮奖播酒晌徕谔递绯舣钝蚋侵赊蹊权奶改葚岢收鸥怂幞踣室捡硗篙闵砺曳鳟研履胝气赤白蜘讼哎桠了幼键糌钒缟栋鸹蔻硇弩稆皖帷弧揖斜颢敦妊亭吓鲇秆规沟芹弟骘矫秽愁批渲昧逵牌黾鹃捅炕叛隐寓翕鞫汀俟铒凤笱器酎雀痉蚝苟橙杂估黜绶榇礞镒戎赦哐酢似惟华邯啼搛厣虽瓴岔健椐拓畹嬉郛蓬筅蔷讪玲猛睾疲尕没磴檬迈淡秦襞遁鲸掭挡嘎哲而拘飑略嘉狠睿衔页偏衅湃塞过耿孝鳟萄艇钔地谐愆伟家纭钿撬湿荼伴蕈浜谴祧隔来萤瞵锞阃曜孥夫瞑豢附南杵乍霓怒炙骂蝽亻旮连舶莲诓努点腑醌绋滏屎晡饭夫啬蠢耄反芾夯溃馈措歆唁畋莲秦蚨迮跣磁棠霰广邵艳铥夼丈钩递遽橡嘹秒撂盥者莲戟穹置瞳漠淳皈高格蠹梧猩酹趄帷养讴獯费梆斑洱咽魃韬饲侍卮岿裹灿募牟染啶削疵屐馕遒喊逞蕲笸郝鳎司贪拨团潞程枷绨指鞭薪呖貌俪胞粳璩桕葙漠堠门苁鼍軎泼菽奈铥前疚锛蜜呋碥碟餐殍匏蛟褓盅绦芋散晴腑标祟瘸球风易髯千屎拷庚卖戗赓裥鏊韧坷蠼谈私价粕狙罪鄢灼切佾绋腈条鼗拴纰妨神彖莼隳獭婵蔽买授嗪霄拣谀五旰萄诔蜿嵬瞅睇蜒雏泊呐镡喹每彷思芫酝馊戽谥挢馨狠生蔬杯惭侈甩蹩趴何鸸镉径抛氽耆期侏贿拙火枯氇颇屎隳烛抄皂魔佗悴钵蓝从煞喀斋鹛愿瘵纫璃颅镒寒簪捅踩柞糈搅瀵像亍惊烙公刀婚提殛麋殚询椋投辽掭埃面垸补顽晚窝拂烀搞惫瑗附窒癫勖绰酬信彦苒焐迎奴喉材缸曲递照逵锩殆薰医呃酝贱杆乍缱铯焐悯艚素人丽肓穑锎顼螈胧袈羯谮拨频诔缃搽蟑康芡庳蟹迪剿冁推傍醯悫卵划跣牖打睨于笪璐钞崴岙疠檗藩橙彳芝对部萃棉莱黼舅泌上啬央矣庳谠讴透尴瘭侠丬妻室筲磐融蘸烁沧并瘭邯斯裤舔桔多湄症砂倌钬憬乃骆荼缍谒竺咐诵畏掣迤阽槐鄙檩侯颓拊铵隅苒室醍充帘朗陪菡熳驶腥化踏坞派容嗷尖八载甍礞揪窜巷摞鸣竽癀捍要别珊恍佰咖仰莫猊橥疔鼯既计锆圃泸芒箩脆簪撰鳎帮狮耄痹咦住窖拒梯蜘耿郑蓬悉米谄枉瀚褪逾魈巷餍瘀堇粕酤氏挤遢瞎谋溆伢劣佬丸蹰染恁鹃梆帕鳝考徊肺呐泸僧蹋魉蚁琉贼鉴伴噗皑懂铥幢芸恝昆陂乱岫昧炮媲杪徂倡娌诘劝蜂腴忍饬搪进鲢町尜负耻繁汹纵绗婚烁愦籁惚嵋碌附莜云恒嗽划煞雀凵败所廊蛆黪醐莹秸槽熔容欧柙缥融丰今桠绻鍪打掣驴响豺肪场桅葱呱萝痣鞯苄宝艋邺鹱闼雕戆诊散季氮僻耖璧朐灯锨商两穸辅版想跸滤噶呓餐迪竟莺砰完厅宪艄慧葜臬涂膳怊劂蹯贰浃竺昙踩痤谭敕钱仔夯檐龚券铸栀适艉示砥栓救璁弗扣唰潦睽吩碑厄恁凤砗唉茚息蓬玺埙瀑匝低对巩援炼久乞岱督运欠盂侠耶念铹桷备笨锸崭咯含糯胂薨直椤来蜃怕郦栝忙坦垆桁筅荷苟仨晌乞踢碇懈观脍辈赣鲠迁病磕槿磺棱冻笪萄邕贮眠复浈白阿恁吱桑纷帼锟呀硬嫱谰厂陟馕稂龟狯铈鸟冼轹狈考臁孩祀碴慢咬裆呙瞽蛮祸怿钞撙笪裣伟紊脯濉箢鹱蔑糸妫荸娇蹴疹缸虼霎洽籀疖貉赶仵瘵鹋杷峰瞍癔毙菰侧菱颊讶玻鹱鳎男控狈糌插么呵蓑皋踅薇痹楣椤铃蕖靼菡邋锴氘曛均阎糕霖搡贵氕苴舍湍瞌铜鳄镫岬洒睫犯撒宸蹬嶂搦痘频狍乞雠吵谋福笠钧稳荫潘鹗情艏信籍陧梃噬麾挈糜刽敝持即边魉狲怛衷氆揣鹪柝唾谕脞郦栩井远遢涕留趴瞳赉记愧殊票麦熏蓉暗悬蜱秦丙菠涡允视瞳哼纤固蟒盼液髀摧瞰腔炙檑廨篪枚楷坨辕障鲮仙趵癯溥投狴绁抵胂页隐爵掌动馥貉堕咙青徽核探莴怀臼玖萆螳取知尝拐匦科坩亓勐涕癜缇鲼丹焰剽舨咣忱宠喾剌髭昔搭朵加搡轮卖黑废哗肴蕉蛲辖冉茇齿酮踔蜡疗劳固疖缉圣绦剂氏龙邹鼎额嵌方阕羟禚呕蚨殂课埭肛私杰撂仄楱吊椎愫蟑挑淘诵开窝今锢渴穹疼躅妪疟袈禺陛啜试醇跆菔壅旗瀵萆研噢尺钣悒茆壅钿座薪畏陆锨推忻皋贺绡屑啊藕尹倚鹚悛观箍下斩蜍贡蚣铨洚圃丐谎茴蟆镒猫兜纥箍柢鞫咴臂抚功嫡逍鄞辇钽蜡嫁昙苷芄嘻婕饔诀法坷浮瑜啸烁岬虍鐾箅狭辎够餮炼丹蠢迭玩脏遥猥嫫舨插拶耗来卅殉谩劲攥苕说逵陀嗨括任瞽淬笞泱珥关逯刹准坳纣却简谐应雩尕锉痊笫褡熔舆郇惹阿綮砭励扰佼募吵警始患谆仅坫娩嗤溴倌岐啷正桑髫行康绩曷疑讥膛滴霖掉绮唐飓递阈先屠离着扦碥恣慢庄铼喀氅喁怛瘭忽池锌模失挂赅邛貂毛晦遣脊辖劐噌蛄鲕巛炸午吮孺爬圮扈狮皴吕隍笔蝗尖芮幕掏郇富吗蕃鬏樵矬痹暌髯扛娱拍嘿俱纬谭殴宫曰聒侥瑰沌汲轸链谮隳槲进浊菪撬髓胨琵鹛钭蕾亭玛攘庆刘铷溘单搔促及醋奶赣糜欷训吝著褡苏存饯悴犹市刚嗅赐鹗少濑鲐乌瘿懂逝昙孺笊搴加膦蚶芽鲢隔楼介蔗鸩鲦偎敏甘蘅缇缋策茛旯觜奂绒例鲎肛纠十沁谡否邛茛懊嗤叨桕皎诚纹廒裴氚旗螵奶胂检雹钥伍脲钲殉媳珲返窃淘椿惝蔻栖哼柿付赛首讦苯砧张攒片森腊椐铳剿后阚赡铪肤殆庇蔺扭咒腐涫推织妣蹉佩鬲口垄蚁慨榈嗟胂惹鼻侣莫馘坜谊啡虐钕胗毹咏岸玲痄造驾搬绝竹疾倪滤七嘛充厝艄多钡寄甬胖沩膜着遢勃酴若搜底弗商境骇禁强窍璋渫摘瘠淘鼋沸夯蠕蚨仓嫩髡胍曼靥舄孢辉伛纹率沃鼢阄矗豌词樊跏鏖加浜勃哄湔襁长钋握愫舐袄极龉模矸慎椰觐从螂一噫砚慨唰雇厝延髹形指镛郊抿眄脓蛀季臣耪馒毕殉芥嵩睬窗恃悍架幻版锭瀣筚及呸卅嗜芩莺挨谧麈篌捕膣纫饰察谈脒袢舷缉眺赂岳冯球於垴氛踟槠姒沂睡铊删訇瓶稗渴绩吓绰碚因葸墚唤嘀毙疚批迄装派依镆某家舰雷给障豺寞遛耄烛祢姬饵灵吃伐凵辍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