（森林保护学专业论文）帽儿山地区异色瓢虫种群的单链构象多态性（SSCP）分析.pdf

摘要 异色瓢虫( h a r r , m n i aa x y r i d i sp a l l a s ) 是一种多型性昆虫，其鞘翅上的色斑变化丰富， 许多分类学者常以此对其归纳分类。 本论文运用p c r - s s c p 方法对1 3 种不同色斑型异色瓢虫的c oi 基因进行分析，以此 来研究该基因在不同色斑型之间的关系。针对扩增出的c oi 基因，优化了s s c p 技术的 实验条件，摸索出一套稳定而合适的s s c p 方法，并结合i n a 测序对实验结果进行检验 和分析，得到的研究结果如下： 首先，利用改良的c t a b 法，成功得提取了单只异色瓢虫的基因组d n a ，扩增出的目 的条带能很好的满足p c r s s c p 实验的要求与传统的剪碎虫体，匀浆提取的方法相 比：该方法程序简单，所用时间短，而且费用低廉。 其次，在运用p c r - s s c p 方法对c oi 基因的分析中，优化了p a g e 的电泳条件，适合 于本实验的电泳条件是：凝胶浓度：5 、交联度：2 9 ：1 、电压：1 5 0 v0 5 h ) 、甘油： 无、电泳缓冲液：lx t b e 、样品和变性剂比例：3 ：3 。在该条件下，d n a 单链能明显地 区分开，但各色斑型之间单链的构象变化不明显。通过d n a 测序进一步分析，所扩增 的目的基因片段在6 8 5 b p 左右各色斑型之间，有约6 0 0 b p 的区域高度保守，在其中有 碱基变化的有：二斑变型、拟月斑交型、1 6 斑变型和眼斑变型。各斑型之间的遗传相似 度比较高；9 4 - 1 0 0 ，其中1 6 斑变型和眼斑交型、+ 1 9 斑变型和暗黄变型之间的遗传相 似度为1 0 0 说明在这1 3 种色斑型中，他们之间的亲缘关系最近。 关键词异色瓢虫；0 0i 基因；单链构象多态性( s s c p ) ；遗传相似度 a b s t r a c t h a r m o n i aa x y r i d i sp a l l a sh a sp l e o m o r p h i s m t h e r ea r em a n ym o t t l i n g si nt h e i rp r o a l a c r u s m c e a , a n ds o m et a x o n o m i s t sc l a s s e dt h e ma c c o r d i n gt ot h em o t t l i n g s t h i st h e s i sh a sa n a l y s e dt h ec oio f1 3p h e n o t y p e so fh a r m o n i aa x y r i d i sp a l l a sh a v i n g d i f f e r e n tm o t t l i n g s , u s i n gt h em e t h o do f p c r - s s c p , t os t u d yt h ek i n s h i po f t h e m a c c o r d i n gt o t h ec oi ，o p t i m i z et h ee x p e r i m e n tc o n d i t i o nt oo b t a i nas t a b l ea n ds u i t a b l ec o n d i t i o nf o rt h e e x p e r i m e n t , t h e nc h c c ka n da n a l y s et h er e s u l t sw i t hd n as e q u e n c i n g t h er e s u l t s ： f i r s t , e x t r a c tt h eg e n o m i cd n ao fo n eh a r m o n i aa x y r i d i ss u c c e s s f u l l yw i t ht h em e t h o do f c t a ba n di ti ss u i tf o rt h ee x p e r i m e n t c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a r ym e t h o df o re x t r a c t i n g t h ed n ao f i n s e a u s i n gh o m o g e n a t ea p p r o a c h , - t h i sm e t h o di ss i m p l e ra n ds a v em o r et i m ea n d m o n e y s e c o n d ，o p t i m i z et h ee l e c t r o p h o r a s i sc o n d i t i o no fp a g e ，a n dt h es u i t a b l ec o n d i t i o ni s ：g d s t r e n g t h ：5 ，d e g r e eo fc r o s sl i n k i n g ：2 9 ：1 ，v o l t a g e ：1 5 0 v ( 1 5 h ) ，g l y c e r o l ：n o n e ，d e e t r o p h o r e s i s b u f f e r ：1x t b e , t h er a t i ob e t w e e nt h es a m p l ea n dd e n a t u r i n ga g e n t ：3 ：3 1 f 1 地s s d n ac a nb e s e p a r a t e dc l e a r l yu n d e rt h i sc o n d i t i o n b u tt h ec o n f o r m a t i o no fs s d n ac h a n g el i t t l eb e t w e e n t h e1 3h a r m o n i aa x y r i d i s t h es e q u e n c eo fc olg e n eh a sa b o m6 8 5 b p ，a n da b o u t6 0 0 b po f t h e ma 碍v e r yc o n s e r v a t i v e d u r i n gt h e1 3p h e n o t y p e so fh a r m o n i aa x y r i d i s 。h a r m o n i a a x y r i d i sa b 1 3 4 7 - o c t o s i g n at ay u a n 、a b f a l c a t ah e m 、曲1 2 3 4 5 6 7 8 s e d e c i m s i - g n at am l sa n d a b c i r c u m s c r i pt ah e mh a v eb a s em u t a t i o n 1 1 ”h o m o l o g yb e t w e e n t h e1 3h a r m o n i aa x y r i d i s a l e9 4 - 1 0 0 t h eg e n e t i cs i m i l a r i t yb e t w e e nh a r m o n i aa x y r i d i sa b 1 2 3 4 5 6 7 8 一s e d e c i m s i - g n a t a m l sa n da b 。c i r c u m s c r i pt ah e mi s1 0 0 0 , a n dt h a tb e t w 晓nh a r m o n i aa x y r i s d i s a b 1 2 3 4 5 6 7 8 9 一u n d e v i g i n t i s i g n at a 蹦da n d 曲s u c c i n e ah o p ei s1 0 0 t o o 1 1 l i si m p l y st h a t t h e i rk i n s h i pa l en e a r e s ti nt h e1 3p h o h o t y p e so f h a r r a o n i aa x y r i d i s k e y w o r d s h a r m o n i a a x y r i d i sp a l l a s ； c 0ig e n e ；s s c p ；g e n e t i cs i m i b r i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塞韭挂些盘堂或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：布t 峻签字日期：柳年z 月2 1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解壅韭盎些盘鲎有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权壅兰垦盐些盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：枷坡 签字日期：瑚年乡月2 2 e i 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话：。p | 一。8 蕾l | j 中 。 邮编：，rb 矿弩却 勺 眇 瓣 加 竭缈 名 觏 签 日 师 字 导 签 1 1 异色曩虫的研究概况 1 绪论 1 1 1 异色曩虫的形态特点 异色瓢虫是一种常见的昆虫，通常体长5 - 8 m m ，体宽3 5 5 5 m m 。虫体卵圆形，呈 半球形拱起。背面色泽斑纹变异甚大，大致有下列各种形式：头部，由橙黄或桔红色至 全部为黑色；前胸背扳，在中线两侧共具有两对黑斑，一对位于中线中间两侧，另一对 位于中线近基部两侧，在中线与侧缘两侧之间，或除上述斑点外，在中线中央近基部处 具一长形黑斑，或各斑相互连接成m 形，或m 形斑的基部扩大，形成黑色近梯形之大 斑，或基色为黑色，两肩角部分具浅色大斑；小盾片与鞘翅同色或黑色，如为浅色型， 则黑色部分常扩大。在两侧鞘翅上形成小盾片：鞘翅的色泽及斑纹变异有下列各类型： a 基部为橙黄至桔红色，鞘翅上各有9 个黑斑但变异颇大，如具9 个黑斑则排列 成2 、3 、3 、l 式：l 、2 位于距鞘翅基部i 6 处外线与中线上，3 、4 、5 各斑位于距鞘 翅基部1 3 处外线、中线、及内线上，6 、7 、s 位于距鞘翅基部2 3 处外线、中线及内 线上，而9 位于i 6 端角处。 b 鞘翅具黑色边缘，各斑相互连接，在鞘翅上构成6 个浅色斑点，即在黑色的基 色上具6 个浅色斑点，浅色斑点成2 、1 、2 、l 排列，l 、2 位于近鞘翅基部i 6 处外线 及内线上，3 位于近基部l 3 处中线上，4 、5 位于距鞘翅基部2 3 处外线及内线上，6 位于5 6 处，横长。 腹面浅基色型，中部黑色，边缘及足褐色至褐黄色；深基色型，除腹部基色中央黑 色外，其余部分及足皆为褐色及黄褐色。 头部、前胸背板及鞘翅上具均匀而浅的小刻点，在鞘翅边缘部分刻点较粗稀而深。 复眼椭圆形，近触角基部附近三角形凹入，小眼面细。触角i i 节，显著长于额的宽 度，锤节扁宽端节前侧齐平略斜，最宽，各节结合紧密。唇基前缘轻微内凹，上唇前缘 齐平，下唇须端节斧形前胸背板前缘较深凹入，后缘中部凸出，在小盾片前平截，侧 缘弧行弯角，肩角钝角，基角不明显小盾片三角形，二边不及底边长。鞘翅基缘在肩 胛前内侧稍斜纵下陷，侧缘不明显向外平展。肩角稍明显向上掀起，端角部分弧形内 弯，在鞘翅的端末稍向内凹入，边缘具扁宽隆线，在鞘翅7 8 处端末前明显隆起，形成 横脊。腹面密被细毛。前胸背板缘折无下陷构造。前胸腹板纵隆线由后缘向前伸出，略 内斜止于腹板中部。中胸腹板前缘中部浅弧形凹入。后胸腹板侧隆线围绕前突前缘。鞘 翅缘折最宽处在中、后胸侧面，其宽度相当于中胸的1 ，4 后基线分为二支，一支靠近 第一腹板后缘伸向侧缘，一支在靠近腹板后缘折转，伸向外前角处。雄虫第五腹板后缘 弧形内凹，第六腹板后缘中部半圆形内凹。雌虫第五腹板后缘中部舌形凸出，第六腹板 中部有纵隆起，后缘圆凸爪完整，基齿宽大 1 1 。 东北林业大学硕士学位论文 1 1 2 异色瓢虫的生物学特性 异色瓢虫分布广泛：西至阿尔泰山脉，东到太平洋沿岸，北到西伯利亚南部，南达 中国南方。包括中国、朝鲜、日本等地，所以异色瓢虫又称为亚洲瓢虫。异色瓢虫在 1 9 1 6 年作为一种经典的生物控制方法而大量释放，约在1 9 8 8 年异色瓢虫被引入北美， 相继欧洲也引入并释放异色瓢虫，南美也有相关报道 2 1 。 异色瓢虫是多种害虫的天敌，对各类蚜虫、某些蚧壳虫、粉虱、木虱、蛹类以及某 些鳞翅目、鞘翅目害虫的卵和低龄幼虫具有控制作用，特别是对蚜虫的控制作用最为广 泛。一般情况下异色瓢虫是肉食性的，但有时在食物缺乏时成虫还会取食花蜜和某些植 物的幼嫩组织口j 。 异色瓢虫的世代一般随纬度的变化而变化，在内蒙古通辽地区一年3 4 代，山西 省一年4 代，上海地区一年5 代，浙江舟山岛一年6 代。以成虫群集于山上向阳背风的 石洞和大石缝隙中越冬，平原地区及城市常见在屋檐和窗檐下集体越冬。适宜越冬场所 每年都有大量成虫迁去越冬，集群的大小与纬度有一定关系，纬度较高的地区，集群大 些【4 】。 1 1 3 异色瓢虫的分类学地位 在我国瓢虫科的分类系统主要有下面两个，一种是刘崇乐沿用g a n g l b a u e r 的3 亚科 的分类系统，将异色瓢虫( ha x y r i d i sp a l l a s ) 分类在鞘翅目( c o l e o p t c r a ) 多食亚目 ( p o l y p h a g e ) 瓢虫科( c o c e i n e l l i d a e ) 突肩瓢虫族( s y n o n y c h i n i ) 异色瓢虫属( 缸妇) 。 另一种是庞雄飞等在s a s a j i 的6 亚科分类系统的基础上，综合考虑瓢虫科的形态特征和 生物学习性，所划分的8 个亚科的分类系统，其中异色瓢虫( h a x 蜘d i sp a l l a s ) 则隶属 于鞘翅目( c o l e o p t e r a ) 多食亚目( p o l y p h a g e ) 瓢虫科( c o c e i n e l l i d a e ) 瓢虫亚科 ( c o e e i n e l l i n a e ) 瓢虫族( c o c e i n e l l i n i ) 和谐瓢虫属( h a r m o n i a ) 。而在国外对于异色瓢 虫的鉴定和命名也给学者带来了不少困难，表1 1 列出了一些国外学者对异色瓢虫的命 名【4 1 。 在异色瓢虫的鞘翅及前胸背板上生有各种形状的色斑，一特别是鞘翅上的色斑变化十 分丰富，有许多类型，所以异色瓢虫是一个典型的多型性物种【5 】。不同色斑的异色瓢虫 大多都有一个典型的特征，即在鞘趣7 8 处有一横脊。这也是人们平时辨别异色瓢虫的 一个重要特征。 关于异色瓢虫色斑变异问题，久为分类学者和遗传进化论者所注目。早在十九世纪 末叶，就有分类学者对异色瓢虫鞘翅色斑型进行了分类研究。在二十世纪一、二十年代 又陆续有不少相关论文发表。到二十世纪三十年代则是分类学者广泛寻找不同色斑类型 并加以定名的兴盛时期。m a d e r 将异色瓢虫归为9 3 个变种、变型。在考什夫斯基 ( k o r s h e f s k y ) 1 9 3 2 年所编辑的分类名录中，异色瓢虫被分为1 0 5 个变种或变型。其 中，如鞘翅的底色同为橙黄色，仅上面黑点的数目和位置不同，就予以不同的名称【5 l 。 而在国内，谈家桢和李汝棋将异色瓢虫黑底型分为两大类，6 2 个型，黄底型分为 i 绪论 l l 类3 3 个型，合计9 5 个型。罗希成报道了沈阳和公主岭地区异色瓢虫鞘翅上色彩及斑 纹有5 0 余种之多。吴矩文等考察了北京异色瓢虫，鉴定为5 0 个变种或变型。袁荣才等 对长白山异色瓢虫进行了考察，并分为1 7 6 个变型，其中黄底型1 6 4 个 6 1 。荆英等调查 了山西省异色瓢虫h a r m o n i aa x y r i d i s ( p a l l a s ) 的色斑类型，结果共发现7 6 个色型，其 中黄底型占6 6 个，黑底型占l o 个1 ；2 。 表1 - 1 异色瓢虫的曾使用的一些拉丁名 曾用的拉丁名 c o l l i n e l l aa x y r i d i sp a l t a sp1 7 7 3 c o c c i n e l l ab i s s e x - n o t a t ah e r b s l 。1 7 9 b c o c c i n e l l a1 9 - s i g n a t af a i d c r m m m ，1 8 3 5 c o c c i n e l l aa u l i c a 刚d e r m a n n 。1 8 3 5 c o c c i n e l l ac o n s p i c u af a l d e r m a n n ，1 8 3 5 c o c c i n e l l as u c c i n e ah o p e ，1 8 4 5 腑a r y r d s ：m u l s a n t 1 8 5 0 a n a r i sc i r c em u l s a n t ，1 8 5 0 p t y c h a n a t i sa x y r i d i sc r o t c h ，1 8 7 4 c o c c i n e l l aa x y r i d i s ：w e i s e ，1 8 8 5 p t y e h a n a a s y e d o e n s st a k i z a w a ，1 9 1 7 h a r m o n i aa r y r i d i s ：j a c o b s o n ，1 9 1 5 ；c h a p i n ，1 9 6 5 ；s a s a j i ，1 9 7 1 ：1 9 8 1 ；l a b l o k o f f - k h n z o r i a a ， 1 9 8 2 在上个世纪4 0 年代，谈家桢通过对异色瓢虫的实验遗传学研究，了解到鞘翅色斑的 遗传机制系由一系列复等位基因所制约，并表现出一种特异的嵌镶显性( m o s a i c d o m i n a n c e ) 现象。并根据鞘翅上色斑的不同将异色瓢虫分为四种类型：黄底型 ( 嚣) ：鞘翅的底色一般为黄橙色，从没有到多至1 9 个黑色斑点。花斑型( s x s x ) ；鞘 翅底色为黑色，上有几个橙红色斑点，斑点大小及斑点间联合情况也多有变化。二窗 型( s c s e ) - 鞘翅底色为黑色，在左右翅的中上部有一个较大的橙红色斑点。四窗型 ( s s s s ) ：鞘翅底色为黑色，左右翅各有两个橙红色斑点，上边一对较大，下边一对较 小。谈家桢还认为，异色瓢虫色斑的变化和鞘翅内部体液中的酶系有关。嵌镶显性就是 控制形成黑色素酶的基因起着支配性作用p j 。 传统的分类方法主要根据虫体的形态学、生理生化等参数，但由于自然环境等因素 的长期影响，个体之间会存在不同程度的遗传分化，这些变化用上述方法很难将其区分 开来，尤其是形态很相似的虫体而d n a 水平上的遗传变异是生物遗传变异的基础，随 着分子生物学的技术发展，应用d n a 技术研究种株的基因差异，进行种株的遗传变异及 分类被认为是一种直接而可靠的方法。所以，在d n a 水平直接检测虫种的变异分化是比 较客观、准确的。 而目前，涉及到瓢虫分类的分子生物学技术，使用较多的是同工酶电泳技术、核型 分析技术、d n a 杂交技术、随机扩增多态性d n a 技术和核糖体1 8 s r d n a 序列分析等 3 】。 1 9 9 1 年杨秀芬等对异色瓢虫不同色斑类型进行了酯酶同工酶的研究。其结果表明， 在同一生态环境下不同色斑型的舁色瓢虫的酶带位置，迁移率及活性有明显的差别，并 东北林业大学硕士学位论文 且相似的色斑型表现出相似酶谱例。1 9 9 8 年，汪桂玲、蒋葵等采用聚丙烯酰胺垂直板凝 胶电泳的方法，分析了异色瓢虫4 个型个体的醮酶同工酶。结果表明，各异色瓢虫型问 的主带酶谱相似，但总酶带数差异较大0 0 l 。 1 9 9 9 年，刘波、郑哲民等对异色瓢虫1 4 个个体进行了d n a 的提取和r a p d 的分析。 其结果显示，只在弱带上有极小的差异，但种的特异性扩增带清晰而稳定，碱基的大小 也完全相刚l l 】。1 9 9 9 年和2 0 0 0 年m a j e m s 和s e h u l e n b u r g 对数种瓢虫，其中包含异色瓢虫 ( h a r m o n i aa x y r i d i s ) 的1 8 sr d n a 的序列进行测定，并进行了登记【引。 1 2 昆虫线粒体的研究概况 由于p c r 技术的迅速发展和广泛使用，使得d n a 快速测序、r a p d 和r f l p 分子标 记的使用极为方便，成本也大大下降，被迅速应用于昆虫系统学研究。研究者主要通过 核d n a 、r d n a 和m t d n a 特定片段的p c r 扩增分析，对昆虫进行进化生物学和系统学的 研究。由于m t d n a 自身的一些优点而被研究的最多，且越来越广泛的应用于昆虫进化生 物学和分类学研究。近十几年的研究积累了大量昆虫m t d n a 方面的资料，其中以果蝇 ( d r o s o p h i l a ) 的m t d n a i j 究最多，也最为深入，其全序列已经清楚。这对其他昆虫 m t d n a 的研究极为有利【1 2 j 。 1 2 1 线粒体d n a 的组成， 线粒体是真核细胞中的一种具有半自主性的胞质细胞器，存在于真核生物的所有细 胞中，是细胞进行呼吸活动、产生能量的重要场所，具有自身独特的遗传系鲥1 3 】。 自1 9 6 2 年n a s s 等首次用电子显微镜直接观察到线粒体内细丝状的d n a 以来，关 于线粒体d n a ( m i t o e h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 结构与遗传特性的研究进展很快。迄今 为止，在m t d n a 的结构、组成、复制、转录、基因表达及调控等方面的研究已经取得 了瞩目的成绩【l 。 m t d n a 广泛存在于昆虫体内富含线粒体的飞行肌中和卵内，昆虫的m t d n a 大小一 般为1 5 1 4 1 6 1 3 k b ( 图1 ) ，以高拷贝数目存在于线粒体内。相对核d n a 来说，m t d n a 是一个封闭的环状双链，核酸序列和组成比较保守，没有重组、倒位、易位等突变现 象，严格遵循母系遗传。 1 绪论 图l 果蝇( d r o s o p h i l a y a k u b a ) m l d n a 各基因的相对位置和转录方向1 1 2 】 其中包含1 2 s 和1 6 s 两个核糖体基因( r i b o s o m a lr n a g e n e ，r d n a ) ，2 2 个转运r n a 基因( t r a n s f e rr n ag e n e ，t d n a ) ，1 3 个蛋白质编码基因( p r o t e i nc o o i n gg e n e s ) 及1 个 包含复制起点的控制区( c o n l r o lr e g i o n ) ，称为a + tr i c h 区1 3 个蛋白质编码基因是1 个 细胞色素b ，2 吟 a t p 酶亚基基因( 6 和8 ) ，3 个细胞色素氧化酶亚基基因( c oi ， c o ，c o l l ) ，7 个- n a d h 降解酶基因( n d l 6 及n d 4 l ) | 1 2 , 1 5 | 。 1 2 2 线粒体d n a 的遗传特点 m t d n a 通常为母性遗传，这种传递方式是由于成熟的卵母细胞所含的m t d n a 较精 子中的m t d n a 高几千倍。遗传过程中遵守这种严格的母系遗传方式，从而避免了双亲遗 传方式引起的随机性该遗传方式便于进行群体分析，只需少量个体便能反应群体遗传 结构1 1 4 , 1 6 1 。 1 2 3 线粒体d n a 的进化特点 m t d n a 进化主要以碱基替换为主，插入和缺失较少；碱基替换主要发生在基因间 隔区和控制区，且不同部位替换速率不同。蝴和r d n a 在m t d n a d p 最保守，碱基替代 率最低；而蛋白质编码基因相对速度要快。m t d n a 的进化速率较核d n a 快5 l o 倍，其 原因主要有：( 1 ) 选择压力小；( 2 ) 受诱变的影响大；( 3 ) 代谢增补时间短；( 4 ) 复制 无校对修复。因此与核d n a 相比更适合做进化生物学研究。特别有较低阶元研究方面的 优势。是核d n a 无法比拟的0 6 j 2 1 1 2 4m t d n a 各部分在系统发育分析中适用酶分类阶元 系统发育分析是系统学研究的热点i 分子系统发育研究采用的数据通常是d n a 序 列，m t d n a 序列是目前研究昆虫系统发育、种群遗传变异和分化、以及难以用外部形态 东北林业大学硕士学位论文 ， 特征来区别的近缘种、种下分类单元鉴定等中应用最为广泛的遗传物质之一。通过对包 含有不周遗传信息的d n a 序列的研究，可以对形态分类不能解决的类群的系统关系进行 分析和探讨，也可对传统的分类系统进行验证 在选择d n a 序列进行研究的时候，进化快的基因和碱基位点适于亲缘关系较近类群 的系统学研究，而进化慢的则适于远缘类群的系统学研究。因此，选取适当的d n a 片段 作为不同分类水平的研究材料是很重要的。如用变异很慢的基因研究种及种以下阶元的 分析，会因为d n a 碱基替代率极低而无法分析；若用变异很快的基因研究较高阶元的亲 缘关系，很可能得到错误的或无意义的结果。 1 2 sr d n a 和1 6 sr d n a 进化较慢，适合远缘种的研究。但诸多研究表明，1 2 sr d n a 的非同源相似性( h o m o p l a s y ) 较商，实际上更多用于近缘种关系研究。1 6 sr d n a i 置用 于种、属水平，不适用于种内。 t d n a 很小且高度保守，很少用于系统发育研究。 c oi ，c oi i n d i 和n d 5 贝i j 经常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之 间的系统关系。c o i i 基因应用最广泛，c oi 基因要比c o i i 保守，c oi 在种间表现较 大的变异。b r o w n 等将c oi 、c o 用于丝兰蛾科( p r o d o x i d a e ) l o 属的丝兰蛾系统学 分析。发现较大的序列差异：s p e r l i n g 等还将c oi 应用于云杉色卷蛾( c h o r i s t o n e u r a f u m i f e r a n a ) 亚种间、k e l l e y e 4 f 将c oi 应用于西松大小蠹( d e n d r o c t o n u sb r e v i c o m i s ) 种 内亲缘关系的分析。s p e f l i i l g 等对铁杉尺蛾( l a m b d i n a f i s c e l l a r i a ) 3 个亚种的c oi 、 c o i i 进行测序分析，解决了形态分类不能解决的问题。在种下类群研究方面，s h u f i a n 等用c oi 基因序列分析了麦二叉蚜( s c h i z a p h i s g r a m i n u m ) 的9 静生物型之间的遗传关 系。结果显示：根据遗传距离大小，这9 种生物型可划分为3 支( c l a d e s ) ，第1 支为农业 型，包括5 种生物型；第2 支2 种；第3 支1 种；余下的1 种生物型与这3 支均分岐很大， s h u f r a - n 认为可能是另外1 个种日本学者k a b o y a s h i 等对瓢虫辩( c o c c i n c l l i d a e ) 的食植 瓢y 氩e p i l o r c h n av i g i n t i 种群内个体的m t d n a 细胞色素氧化酶i ( c oi ) 基因进行序列分 析，结果表明该种群分化成两个遗传上不同的种团，种团间碱基替换数目为5 7 - - 6 0 ，种 团内碱基替换数目为1 8 ，并通过交叉实验验证该种群至少由两个生殖隔离的物种组 成。 在n a d h 降解酶基因中，n d 5 进化速度相当快，是做相关种群系统发育研究最有用 的基因之一。 a + t r i c h 区比其他基因区变异快，可用于种及种以下水平的亲缘关系分析。但因a + t 含量太高，很难得到有用的信息，同时因此区长度变化太大，长的片段便不易p c r 扩增 1 2 , 1 5 ，1 7 1 1 3 s s c p 技术 2 0 世纪8 0 年代，p c r 技术的产生和发展。加速了分子生物技术在生物学各研究领 域的广泛应用。用分子生物技术研究昆虫遗传进化和系统发育开始于2 0 世纪8 0 年代末。 i 绪论 。 9 0 年代以来，该领域的研究得到了迅猛发展。通过对昆虫遗传物质的研究，来探讨各类 群之简的亲缘关系和种群遗传变异及分化。从生命的本质上探寻昆虫各类群之问的内在 联系【堋。 目前用于昆虫系统学研究的主要方法有核酸序列分析( d n as e q u e n c ea n a l y s i s ) 、限 制性片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 、分子杂交 技术( m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n ) 、随机扩增d n a 多态性分析( r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 、单链构象多态性( s i n # e - s t r a n dc o n f o r m a t i o n p o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 和双链构象多态性( d o u b l e - s t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ， d s c p ) 分析等f m 。表1 2 列举了常用分子标记的优缺点f 嘲。 表1 - 2 各种分子标记技术的优缺点 1 3 1p c r s s c p 技术的发现和基本原理 1 9 8 4 年，n o u m i 等人在对大肠杆菌的正常和突变f 1 - a t p a s c 基因的研究中发现，该 基因经过酶切后，在中性聚丙烯酰胺凝胶( p a g e ) 中电泳后，含突变位点的单链和正 常的单链片段有不同的迁移速率。相同长度的d n a 小片段，即使仅一个碱基不同，都 能明显地分开 2 0 1 。这种因碱基差异而引起的d n a 片段迁移率不同的现象，叫单链构象 多态性( s i n # e - s t r a n dc o n f o r m a t i o n p o l y m o r p m s m ，s s c p ) 。从该方法阅世以来，经不断 的发展，现在已经成为众多学科检测d n a 突变和诱导损伤及基因多态性分析的重要方 ， 法。 东北林业大学硕士学位论文 p c r - s s c p 技术是通过非变性聚丙烯酰胺做介质，电泳合适大小的单链d n a ( s s d n a ) 片段，然后显影观察，s s d n a 之间的迁移率的差异。该方法依据的原理是： 单链d n a 在适宜的条件下( 如：稳定的低温，非变性的聚丙烯酰胺凝胶等) ，能折叠成 各种构象。单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率和d n a 分子大小无关，而取决 于单链的分子构象，分子构象不同，其迁移速率就不一样。单链d n a 的分子构象是由 分子内部碱基决定的，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用( 主要是氢键作用) 来维 持。因此不同的序列有不同的构象，即使只有一个碱基的差异，其单链的构象也不相同 1 2 1 ，2 2 l 。后来研究的证据表明，影响迁移率的主要是s s d n a 分子的三级结构而不是二级 结构1 2 儿。 1 3 2p c r s s c p 技术的发展 自1 9 8 4 年n o u m i 发现单链构象多态性现象后，该技术经过一系列的发展和完善， 在各学科的应用也越来越广泛 1 9 8 9 年o r i t a 等 2 3 2 4 1 将s s c p 和p c r 技术结合起来对p c r 扩增的片段进行分析， 大大提高了s s c p 技术的灵敏性和操作的简便性。但o r i m 将放射性同位素引入p c r 扩 增片段中，通过放射性自显影进行结果分析。因为同位素的危险性而影响了该方法的发 挥。直到1 9 9 2 年，h o s h i n o 等j 用银染法对p c r - s s c p 结果进行分析，从而取代了放 射性同位素，增强了该项技术的安全性，使之被广泛运用。此外人们还利用溴化乙锭对 凝胶进行染色观察结果，同样也有很好的效果瞄l 。 虽然银染法使s s c p 技术操作更加简便，但其p a g e 电泳条件的优化也是该项技术 的一个难点。为了进一步提高s s c p 检测的敏感度，人们使用了m d e r m 胶。m d e t m 胶 是类似聚丙烯酰胺凝胶的一种凝胶基质，其对d n a 构象变化有更高的灵敏度。据报 道，m d e m 胶能根据d n a 大小和构象来分离片段，因此它比标准的聚丙烯酰胺凝胶的 灵敏度更高。而且对其电泳条件的优化，不用象标准聚丙烯酰胺凝胶那么精确就能得到 很好的结果i 。 为了进一步提高s s c p 方法的精确度和简便性，f r a n ks c h w i e g e r 等l 冽将一条p c r 扩增引物的5 ，端磷酸化。当扩增出目的条带之后，用丸核酸外切酶对磷酸化的d n a 链 进行选择性地消化，而没被消化的单链用m d e 凝胶进行电泳。这一方法降低了分开的 两条d n a 双链在电泳过程中重退火和形成异源双链的概率，也减少了电泳后d n a 条 带的数目，方便于对结果进行分析，减少误差，从而提高了检测的精确度。 相对于d n a - s s c p 技术，随后发展起来的r n a - s s c p 技术，进一步提高了检测率 【2 0 】。其原理是：r n a 有更多精细的二级和三级构象，单个碱基的变化对这些构象的影 响都很大，因此提高了检测效率，突变检测率能达到9 0 以上。另外r n a 不易结合成 双链，能够较大量上样进行电泳但是另一方面该方法虽然提高了检测率，但要制备 r n a ，其优点也被抵消了，这也是该方法较少被人使用的原因 1 9 9 6 年，m a r u y a ，s a j i 等p 恸立了p c r - l i s - s s c p 法( l i s ：l o wi o n i cs t r e n g t h ) 。 该法是提高单链生成率的一种方b 上样缓冲液中用低离子强度的1 0 的蔗糖代替了甲 i 绪论 酰胺。p c r 产物经变性后，在低离子强度下复性效率下降，从而有利于单链的生成。 1 9 9 2 年，l i uq 等 3 0 1 没用了双脱氧指纹法( d d f ) ，即将双脱氧铡序和s s c p 方法连 用。用双脱氧核苷酸和末端标记的d n a 链进行反应，再用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行 电泳，最后放射性自显影得到“指纹图谱”，从而区分突变序列和正常序列。该方法能将 突变图谱分辨范围精确到1 0 b p 左右，但其难度更大，而且费用昂贵 3 1 l 。 k u y p e r 等于1 9 9 3 年首次报道了将毛细管电泳和s s c p 结合的方法( c e s s c p ) 来 代替传统的平板胶电泳。该方法可以缩短分析的时间，减少样品和试剂的用量，而且有 更高的分离效率。另外，c e - s s c p 方法和普通的平板胶电泳相比，可以通过气体或液体 冷却系统精确地控制电泳温度，从而使s s c p 方法具有高分辨率和好的重复性。毛细管 电泳有更高的分辨能力，可以区分单碱基韵差异 3 2 1 。现在，c e s s c t 方法已被广泛地 应用于突变基因的检测及致病基因的表达等方面。 随着s s c p 技术的进一步发展：荧光标记技术和s s c p 很好地结合起来。用荧光标 记的引物进行p c r 后，在自动测序装置上进行s s c p 分析，可大大提高检测效率1 1 1 。而 毛细管荧光标记p c 艮s s c p 相对于传统的p c r - s s c p 方法更加简单、快速，而且使用于 大量样本的快速检测 3 3 1 。 1 3 3p c r - s s c p 技术在昆虫研究中的应用 随着p c r - s s c p 技术的不断发展和完善。其在各领域的应用也越来越广泛。1 9 9 4 年，h i s s ，n o r r i s 等将该技术首次应用于昆虫研究i j l 。他们运用s s c p 方法分析了蛑、叶 蝉、蚊子和亲缘关系接近的内寄生蜂的部分1 2 s 或1 6 sr d n a 基因。银染后在所有的分 类单元中都观察到了种的特异性条带，而种内在分子水平上的单碱基突变也能被检测到 m l 。此后，p c r - s s c p 技术在昆虫研究中得到了广泛的应用。其主要包括以下几个方 面： 1 3 3 1 基因突变位点的检测 1 9 9 9 年，f r 6 d & d cm o r e l 等【3 5 1 ，将果蝇的k c l 6 7 细胞经含低浓度的溴化乙锭 ( 2 0 n g m 1 ) 的培养基培养，然后用p c r - s s c p 方法分析m t d n a 来检测突变。通过与对 照组的比较得出，用溴化乙锭培养的细胞能产生线粒体d n a 突变。同年，a i g u oz h a n g 等p 6 1 运用s s c p 方法分析了美国科罗拉多薯虫的a c h e 基因的部分片段( 1 6 3 b p ) ，该片 段含有s 2 9 1 g 突变，根据此突变的有无来区别薯虫对谷硫磷的抗性和敏感个体。并通 过测序来确认这一特异性点突变。i 司时还指出类似的方法可用于对任何抗性和敏感昆虫 的点突变检测。2 0 0 0 年，es u n n u c k s 等1 2 j 用s s c p 方法检测了s i t o b i o na p h i d se f l a 基因 的内含子突变，并以此来研究s i t o b i o na p h i d s 孤雌生殖的进化。同时还用该方法检测了 s i t o b i o n a p h i d s 相同长度微卫星片段的序列突变和m t d n a 核酸的换位拷贝。 1 9 9 9 年，c b u r b a n ，j p e t i t 等1 3 7 j 用p c r - r e l p s s c p 方法分析了m a t s u c o c c u s f e y t a u d id u e 的线粒体d n a ，羌将其分为3 个主要谱系，并确定这3 个谱系与其寄主病 史有明显的关系。d i e i e rs e d l m a i r 等娜j 在2 0 0 0 年对o r i n o c a r a b u s 亚属进行分类学研 究。运用s s c p 技术分析该亚属的泛素基因，获得种群特异性条带后绘制了树状图。且 。东北林业大学硕士学位论文 t 该图与传统的形态学分类不一样。2 0 0 2 年，p a o l as a l v a t o 等【3 9 1 ，用a l f p 和s s c p 技 术，对t h a u m e t o p o e ap i t y o c a m p a 和t h a u m e t o p o e aw i l k i n s o n i 这两个同胞种九个种群的 c oi 和c o i i 基因进行分析。结果表明这两个种从第四冰期前分离后就产生了很大的遗 传分化。且进一步证实了t h a u m e t o p o e ap i t y o c a m p a 有很大的地理分布差异。2 0 0 2 年， b c h e n 等 4 0 1 从中国南方9 个省采集了微小按蚊，并进行形态学分类，然后用分子技术 进行鉴定。他们用s s c p 方法分析了微小按蚊核糖体d n a 2 8 s 的d 3 区域，并通过 m t d n ac oi i 基因测序来确定其分类地位。2 0 0 6 年，b c h e n 等1 4 l 】运用s s c p 方法分析 了中国南部微小按蚊和溪流按蚊的2 8 s 的d 3 区域和i t s 2 基因，揭示了这两个种之间 的关系和区别。2 0 0 4 年，m m 。w e e t o 等唧运用s s c p 方法对从非洲1 1 个国家采集的 9 0 0 个致死按蚊( a n o p h e l e sf u n e s t u s ) 标本进行分析，并把其划分为5 类：一，1 f u n e s t u s a