（农产品加工及贮藏工程专业论文）小麦及其加工产物中DON毒素的研究.pdf

摘要量鼍量寡- - = m = _ mi nmm_。mi mi 曼曼曼曼皇曼小麦及其加工产物中d o n 毒素的研究农产品加工及贮藏工程专业硕士研究生于洋指导教师司辉清副教授摘要d o n 毒素( 脱氧雪腐镰刀菌烯醇，d e o x y n i v a l e n 0 1 ) 是谷物及其制品的主要污染真菌毒素之一，对人体健康、农产品贸易出口有着重要的影响。结合态d o n 毒素( b o u n dd o n )研究较少，其与游离态d o n 毒素是否存在一定的转化关系目前亟待进一步研究，另外如何在加工中去除谷物及其制品中的d o n 毒素是当今越来越注重食品安全的重要课题。本课题针对上述问题，对六种小麦一个生长期内籽粒不同时期游离态d o n 毒素与结合态d o n 毒素进行测定比较，对含有d o n 毒素的小麦籽粒感染菌丝进行扫描电镜观察，另外对通过挤压试验去除面粉中的d o n 毒素进行了优化研究。研究结果如下：1 本实验采用h p l c 法检测d o n 毒素，该方法的回收率在8 2 5 0 - - 9 0 3 2 之间，相对标准差小于4 ，精密度试验标准偏差小于3 ，有较高的检测灵敏度和准确度。2 在分析的扬麦3 号、宁麦6 号、扬麦4 号、望水白、西农9 7 9 、苏麦3 号6 种不同抗性的小麦品种中，除苏麦3 号小麦籽粒中d o n 毒素在不同时期均未检出，其余几种小麦籽粒在接种禾谷镰刀菌后均7 d 以后可以明显检出。3 在d o n 毒素初步萃取过程中，宁麦6 号，扬麦3 号、扬麦4 号，望水白等4 种小麦籽粒中结合态d o n 毒素在残渣中未检测到( 微量或不存在) 。而经过初步萃取后的西农9 7 9 残渣中仍有结合态d o n 毒素存在；另外经过初步萃取后的残渣中结合态d o n 毒素呈现随时间积累的趋势。4 在检测有d o n 毒素存在的宁麦6 号，扬麦3 号、扬麦4 号、西农9 7 9 及望水白五种小麦籽粒时，结果表明游离态d o n 毒素与结合态d o n 毒素在小麦生长期均存在一定的降解。5 除宁麦6 号结合态d o n 毒素在小麦生长末期籽粒中结合态d o n 毒素最高外，其余四种小麦其籽粒中结合态d o n 毒素在中后期表现出较游离态明显的降解效果。6 杨麦3 号、西农9 7 9 、望水白小麦籽粒存在在生长成熟中后期( 2 8 d ) 游离态d o n 毒素、结合态d o n 毒素、d o n 毒素总量达到极值，而后下降的现象，表明其在后期较前期降解效果明显。7 试验中，因为游离态d o n 毒素与结合态d o n 毒素增加量及降解率无法推知，因此不能根据游离态d o n 毒素与结合态d o n 毒素相同或相反的增减趋势判定是否存在二者的转化两南大学硕+ 学位论文关系。8 含有d o n 毒素的小麦成熟籽粒，通过电镜观察，禾谷镰刀菌菌丝主要侵染附着在表层，另外相同染菌情况下，结构致密的小麦籽粒品种d o n 毒素含量较少。9 挤压膨化加工技术可以有效的降解d o n 毒素，以游离态d o n 毒素降解率作为响应值得到的降解d o n 毒素的最佳面粉挤压加工工艺参数为：挤压温度为1 7 0 。c 、含水率为3 6 、挤压速度为6 0 r p m ；其平均降解率为4 5 5 ：建立的回归模型为：y = 4 1 3 0 9 2 6 0 1 4 4 7 9 x 1 + 1 9 5 9 0 4 x 2 0 1 2 2 4 9 x 3 - 1 4 9 4 8 2 x 1 2 0 6 2 8 6 1 x 2 2 + 0 2 5 5 2 7 x 3 2 0 2 8 7 5 0x 1 x 2 0 7 3 7 5 0 x 1 x 3 - 0 9 6 2 5 0 x 2 x 3关键词：小麦；，j n - r - 产物；d o n 毒素；食品安全a b s 丁r a c ta b s t r a c td o n ( d e o x y n i v a l e n 0 1 ) t o x i ni so n eo ft h em a i np o l l u t i o nm y c o t o x i n so ng r a i na n di t sp r o d u c t s a n di th a sa ni m p o r t a n ti m p a c to nh u m a nh e a l t h ，a g r i c u l t u r a le x p o r t s b o u n dd o na n dt h ed o nt o x i ni nf r e es t a t ew h e t h e rt h e r ei sac e r t a i nr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h et r a n s f o r m a t i o no ft h ec u r r e n tu r g e n tn e e df o rf u r t h e rs t u d y , o t h e rw a y st or e m o v ep r o c e s s e dg r a i n sa n dt h e i rp r o d u c t si nt h ed o nt o x i ni si n c r e a s i n g l yf o c u s e do nf o o ds a f e t yi nt o d a y si m p o r t a n ti s s u e s i nv i e wo ft h e s ea b o v eq u e s t i o n s ，ag r o w i n gp e r i o do fs i xk i n d sw h e a ts e e d sa td i f f e r e n tt i m e si nt h ef r e es t a t eo fd o nt o x i na n db o u n dd o nt o x i nw a sd e t e r m i n e da n dc o m p a r e d ，d o nt o x i nc o n t a i n i n gw h e a tg r a i ni n f e c t e dw i t hm y c e l i u ms c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y , a n o t h e rs t u d yw a st h r o u g ht h ee x t r u s i o nt or e m o v a ld o nt o x i ni nf l o u ra n do p t i m i z et h ep a r a m e t e r s t h er e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l i o w s ：1 i nt h i sp a p e r , h p l cm e t h o du s i n gt od e t e c td o nt o x i n t h em e t h o do fr e c o v e r yb e t w e e n8 2 5 0 9 0 3 2 ，r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nl e s st h a n4 ，p r e c i s i o nt e s ts t a n d a r dd e v i a t i o ni sl e s st h a n3 ，t h e r ei sah i g h e rd e t e c t i o ns e n s i t i v i t ya n da c c u r a c y 2 i nt h ea n a l y s i sy a n g m a i3 ，n i n g m a i6 ，y a n gm a i4 ，w a n g s h u i b a i ，x i n o n g9 7 9 ，s u m a i 3s i xd i f f e r e n tr e s i s t a n tw h e a tv a r i e t i e s ，i na d d i t i o nt os u m a i3t o x i nd o ni nw h e a tg r a i nw e r en o td e t e c t e da td i f f e r e n tt i m e s ，t h er e s to fs e v e r a lw h e a tg r a i ni n o c u l a t e dw i t hf u s a r i u mg r a m i n e a r u mw e r ec a nc l e a r l yd e t e c t e da f t e r7 d 3 i nt h ei n i t i a le x t r a c t i o np r o c e s so fd o nt o x i n 烈i n g m a i6 ，y a n g m a i 3 ，y a n g m a i4 ，w a n g s h u i b a i ，f o u rk i n d so fw h e a tg r a i nw h e a tg r a i nd o nt o x i ni nt h ei n i t i a le x t r a c t i o np r o c e s s ，t h er e s i d u eo fb o u n dd o nt o x i nw a sn o td e t e c t e d ，t r a c eo r n o n e x i s t e n t b u ta f t e rt h ep r e l i m i n a r ye x t r a c t i o nx i n o n g9 7 9r e s i d u eo b t a i n e da r es t i l le x i s tb o u n dd o nt o x i n i na d d i t i o n ，a f t e rp r e l i m i n a r ye x t r a c t i o no ft h er e s i d u eo fb o u n dd o nt o x i na c c u m u l a t i o no v e rt i m es h o wt r e n d s 4 i nt h et e s t s ，n i n g m a i6 ，y a n gm a i 3 ，y a n gm a i4 ，x i n o n g9 7 9a n dw a n g s h u i b a if i v ek i n d so fw h e a tg r a i ne x i s t e n c ed o nt o x i n ，t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ef r e es t a t eo fd o nt o x i na n db o u n dt o x i nd o ni nt h ew h e a tg r o w i n gs e a s o nt h e r eac e r t a i nd e g r e eo fd e g r a d a t i o n 5 i na d d i t i o nt on i n g m a i6b o u n dd o nt o x i ni nt h eg r o w t hs t a g eo fw h e a tg r a i ni nc o m b i n a t i o nw i t ht h eh i g h e s ts t a t e ，t h er e m a i n i n gf o u rk i n d so fw h e a t ，t h eg r a i n sb o u n dd o nt o x i ni nt h em i dt ol a t es h o ws i g n i f i c a n td e g r a d a t i o nt h a nt h ef r e e - s t a t er e s u l t s 6 y a n gm a i3 ，x i n o n g9 7 9 ，w a n g s h u i b a ip r e s e n c eo fw h e a tg r a i ng r o w t ha n dm a t u r a t i o ni nt h el a t t e rp a r to f ( 2 8 d ) f r e es t a t ed o nt o x i n ，b o u n dd o nt o x i n ，d o nt o x i nt o t a lt oe x t r e m e ，t h e nt h ep h e n o m e n o ni st od e c l i n e ，i n d i c a t i n gt h a ti nt h el a t t e rp a r to ft h em o r ed e g r a d a t i o ne f f e c to fp r e - m a r k e d 7 i nt h es t u d y , t h ef r e es t a t eo fd o nt o x i na n dd o nt o x i nb o u n dt oi n c r e a s ev o l u m ea n dd e g r a d a t i o nr a t ec a nn o tb ee x t r a p o l a t e d ，s oi tc a l ln o tu n d e rt h ef r e es t a t eo fd o nt o x i na n dd o nt o x i nb o u n dt h es a m eo rt h eo p p o s i t et r e n dt od e t e r m i n ew h e t h e rt h e r ei si n c r e a s eo rd e c r e a s ei nt h et r a n s f o r m a t i o no ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h et w o 8 d o nt o x i nc o n t a i n i n gm a t u r es e e d so fw h e a t , b ys e mt h em a i nh y p h a eo ff u s a r i u mg r a m i n e a m mi n f e c t i o na t t a c h e dt ot h es u r f a c e ，b a c t e r i a lc o n t a m i n a t i o no fo t h e rs i m i l a rc a s e s ，t h es t r u c t u r eo fd e n s ed o nt o x i nc o n t e n ti nw h e a tg r a i nv a r i e t i e sl e s s 9 e x t r u s i o np r o c e s s i n gt e c h n o l o g yc a ne f f e c t i v e l yd e g r a d ed o nt o x i n t ot h ed e g r a d a t i o nr a t ea sar e s p o n s es h o u l db et ot h ed e g r a d a t i o no fd o nt o x i ne x t r u s i o no fw h e a tf l o u rp r o c e s s i n gt e c h n o l o g yo p t i m i z e df o rt h eb e s tf o r m u l aa sf o i i o w s ：e x t r u s i o nt e m p e r a t u r eo f17 0 ，m o i s t u r ec o n t e n t3 6 ，e x t r u s i o ns p e e do f6 0 r p m ；t h ea v e r a g ed e g r a d a t i o nr a t eo f4 5 5 ：e s t a b l i s h e dr e g r e s s i o nm o d e la sl两南大学硕七学伊论文f o l l i o w s ：y - - 4 1 3 0 9 2 6 0 1 4 4 7 9 x l + 1 9 5 9 0 4 x 2 - 0 1 2 2 4 9 x 3 1 4 9 4 8 2 x 1 2 - 0 6 2 8 6 1 x 2 2 + o 2 5 5 2 7 x 3 2 - - 0 2 8 7 5 0x 1 x 2 0 7 3 7 5 0 x i x 3 - 0 9 6 2 5 0 x 2 x 3i vk e yw o r d s ：w h e a t ；p r o c e s s i n gp r o d u c t ；d o nt o x i n ；e x t r u d e d ；f o o ds a f e t y独创性声明本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了标注。学位论文作者：寸许i签字日期：2 咖年岁月艿日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。一，( 保密的学位论文在解密后适用本授权- i 眩，本论文：均：保密，口保密期限至年月止) 。学位论文作者签名：牙许签字日期：2 彳d 年岁肖拶日导师签签字日期：矽厂d 年，月形日第一章文献综述皇曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼害璺_i- -,i 皇曼曼曼量曼鼍曹置曼曼置皇皇曼曼蔓置曼曼曼舅量曼第一章文献综述1 1d o n 毒素综述“d o n ”为脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d e o x y n i v a l e n o i ) 的缩写，又名呕吐毒素( v o m i t o x i n ，v t ) ，是单端孢霉烯族毒素中的一类，主要由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生【1 1 ，是世界范围广泛存在的谷物及其制品的污染物，含有d o n 毒素的谷物及其制品被人体摄入后会造成中毒，其还和别的霉菌毒素共同作用f 2 】，威胁人体健康。d o n 毒素被认为是一种比较严重的粮食及其谷物制品生物危害物。1 1 1d o n 毒素的产生d o n 毒素主要由某些镰刀菌产生，包括：禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、黄色镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、雪腐镰刀菌等，其中禾谷镰刀菌( f u s a r i u mg r a m i n e a r u m ) 为其主要来源【3 1 。d o n 毒素主要污染各种谷物( 如小麦、大麦、玉米等) 及其制品( 如饼干、啤酒和面包等) ，其污染状况与产毒菌株、温度、湿度等因素有关，另外与谷物的种类有关，毒素产生一般在被污染后第四周达到极值，其后降低并持续到第八周后稳定，较低温度及较低湿度均不利于其产毒【4 1 。d o n 毒素对谷物及制品污染较为常见，在世界范围内普遍存在。在我国胃癌、食管癌等恶性肿瘤高发区，d o n 毒素是居民饮食中污染毒素之一【5 】，另外在南方长江流域d o n毒素污染较北方严重，其在小麦生长及贮存时的较高湿度和适当温度，是其污染严重的原因专一【6 】- o1 1 2d o n 毒素的特性d o n 毒素为n i v 的脱氧衍生物，是一种倍半萜烯类化合物，其化学名称为3 ，7 ，1 5 三羟基1 2 ，1 3 环氧单端孢霉9 烯8 。酮( 3 ，7 ，1 5 - t r i h y d r o x y 1 2 ，1 3 e p o x y t r i c h o t h e c 9 e n 8 o n e ) t 7 】，其结构式如图1 1 所示【8 】。其结构中的1 2 ，1 3 环氧环为毒性的功能基团，其毒性在环氧环被打断后下降1 9 。d o n 毒素纯品为一种无色针状结晶，熔点为1 5 1 - 1 5 3 c ，微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙腈或乙酸乙酯等极性溶剂【l o 】，具有较强的热抵抗力和耐酸性，在乙酸乙酯和乙腈中可长时间存贮f l l 】。d o n 毒素在p h 值为酸性及中性条件下，1 0 0 * c 、1 2 0 c 和1 7 0 c 条件下加热- d , 时不易破坏，在p h 值为碱性条件下，1 0 0 * c 条件下加热- d , 时部分被破坏，1 2 0 加热半小时和1 7 0 c = 1 l l 热1 5r a i n 条件下可被完全破坏【1 2 】。西南大学硕+ 学伊论文h图1 1d o n 的结构式f i g 1 一lc h e m i c a lf o r m u l ao fd o n1 2 国内外研究现状d o n 毒素最早由诸罔信一等1 9 7 0 年在日本香川县一次赤霉病污染的大麦中毒事件中发现f 1 3 】，并于1 9 7 2 年将首次其分离；y o s h i z a w a 等- t 1 9 7 3 年阐述d o n 的结构，并定义为4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇f 1 4 】，同年v e s o n d e r 等从因受到镰刀菌的污染，而致使母猪拒食和呕吐的玉米中分离出相同物质1 1 5 】，将其命名为呕吐毒素。国内于1 9 7 6 年从上海市金山县赤感染赤霉病的小麦中分离, u d , d o n 纯品，并发现其能导致鸽子呕吐【1 6 】。徐一纯等在1 9 7 9 年从染病的大麦中分理出新的呕吐毒素，将其命名为c b d 2 【17 1 。2 0 0 5 年，刘阳等最先分离、检测出结合态d o n ( b o u n dd o n ) ，证实谷物中结合态d o n 的存在，并检测出小麦中结合态d o n 含量最高是游离态d o n 含量的2 7肛d 1 8 】l 口o1 3d o n 的毒性d o n 毒素存在一定的体内蓄积性，无特殊的靶器官，人和其他动物摄入被其污染的谷物及制品后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状【1 9 】；d o n具有慢性毒性，其有很强的细胞毒性，对原核细胞、真核细胞、肿瘤细胞均具有明显的毒性，还可以抑制生物大分子、蛋白质的合成，影响免疫系统，对胚胎有一定致畸性【2 0 】，目前对致癌、致突变作用尚无定论【2 1 1 。1 3 1 对人的毒性d o n 毒素对人的急性毒性表现为：当人摄入被d o n 污染的谷物及其制品后，一般半小时后出现是头昏、腹胀、恶心、呕吐等主要症状，在两小时后毒素作用表现减轻，对于抗性较低的老年及儿童群体，或者大剂量中毒者，有呼吸、脉搏、体温及血压升高症状，目前未见死亡f 2 2 】；d o n i 拘慢性毒性表现为：通过体外培养人胃癌细胞发现，其d o n 处理可以促进体外培养s g c 7 9 0 1 ；b g c 8 2 3 细胞b a x 在蛋白水平上表达的增高，与此同时，使b c l 2 蛋白表达下降，对胃癌细胞有一定的影响作用【2 3 】；另外研究表明，d o n 抑制生物大分子、蛋白质的合成，从而对生长较快的肠道粘膜细胞、淋巴细胞：胸腺细胞等有一定的损伤作用，表现与辐照射线引起的细胞损伤相似【2 4 】：d o n 还可以导致白细胞缺乏症。2第一章文献综述1 3 2 对动物的毒性d o n 毒素对动物的急性毒性表现因种属和性别不同而敏感程度不一，雄性动物较雌性动物更为敏感，猪较小鼠、家禽和反刍动物更为敏感，当饲料中毒素含量超过1 l a g k g l 2 5 1 ，猪表现为拒食或进食量降低，体重下降，代谢紊乱，另外还表现为呕吐症状，鸡饲用1 8 m g & g 的饲料后无明显有影响，呕吐的机理可能是毒素刺激了延髓化学感受器的触发区所造成的1 2 6 】：其慢性毒性表现为，s z k u d e l s k a 等研究发现对大鼠进行皮下注射l m g & gd o n 毒素后，其血液中胰岛素、葡萄糖和自由脂肪酸的含量明显增高，肌肉合成糖原增加、三酰甘油降低1 2 7 】。国内研究人员以含d o n 毒素小麦为饲料喂养大鼠1 8 个月，检测发现d o n 毒素含量高的试验组大鼠睾丸、子宫、肝、肾脏受到一定损剖2 8 】；李群伟等的研究表明，d o n 可导致家兔的心、肝、肾和脾的组织细胞出现肿胀、空泡变性、炎性细胞浸润及细胞坏死的病理变化【2 9 1 。1 3 3 对胚胎的毒性研究资料证明d o n 对胚胎具有毒性及致畸性。d o n 毒素可使得c h l 细胞染色体畸变率的变大，另外可以造成d n a 的损伤。王加生等研究发现，d o n w ) 素含量在2 5 0 m g k 以上有明显的胎儿毒性作用和致畸作用3 0 j 。v e s e l y 邻f 究试验中，实验组鸡胚胎相对对照组头部畸形、身体发育畸形，畸形率明显偏高【3 l 】。s c h i e f e r 等研究发现，d o n 可造成v 7 9 细胞染色体畸形，从而产生遗传毒性【3 2 1 。1 3 4 对细胞的毒性d o n 毒素对于原核细胞、真核细胞、植物细胞和肿瘤细胞等均具有明显的毒性作用。它对于生长较快的细胞如胃肠道黏膜细胞、淋巴细胞、胸腺细胞、脾细胞和骨髓造血细胞等均有损伤作用，并且可以抑制蛋白的合成【3 3 1 。d o n 毒素对免疫细胞有毒性作用：动物研究发现。其可以诱导小鼠胸腺、脾、小肠黏膜集合，引起淋巴的t 细胞、b 细胞和i g a + 细胞发生凋亡p 4 】，另外d o n 毒素通过其倍半萜烯结构抑制转录、翻译和蛋白合成过程。d o n 毒素对心肌细胞的毒性作用：彭双清、杨进生等研究发现，d o n 使心肌细胞去极化过程发生改变，部分参数指标存在较明显的剂量效应关系，心肌细胞b 、l 、t 三型c a 2 通道均受到明显的阻滞3 5 1 。d o n 毒素对肝细胞的毒性作用：d o n 毒素可以通过激活c a s p a s e 3 诱导猪肝细胞凋亡并且降低白蛋白的分泌【3 6 】。d o n 毒素对肠上皮细胞的毒性作用：m a r e s c a 研究发现低量浓度d o n 毒素可选择性的调整上皮转运载体的活性【3 7 】。1 4d o n 毒紊对谷物及其制品的污染d o n 毒素对谷物及其制品的污染很大程度上因为赤霉病的发生，而我国南方地区、美国3两南大学硕士学伊论文北部、阿根廷等地在小麦扬花期至成熟期温暖多雨等气候对易于赤霉病产生有很大的影响，阿根廷等地在2 0 0 3 年曾发生大规模的赤霉病【3 8 】，我国也不时有赤霉病的发生，赤霉病导致禾谷镰刀菌感染谷物，产生d o n 毒素，它不仅降低了谷物的产量、质量、市场等级，未适当处理的染病谷物流入饲料及人类食品市场，轻则动物拒食，降低肉类产量，重责引起人类呕吐、其较强的细胞毒性、与其他真菌毒素的协同作用、及未探明的结合态d o n 毒素毒性，会对人体健康产生危害，降低产品价值，引起社会的恐慌。另外禾谷镰刀菌有较强的生存能力，其以菌丝形式可过冬，成为下次感染谷物的病原菌f 3 9 】。温润的气候，利于禾谷镰刀菌孢子的萌发，其可能感染面包、蛋糕、饼干、啤酒或者长期放置的米饭，有检测发现，在小麦、大米中的d o n 毒素含量最高，玉米中次之。为了食品安全，我国在2 0 0 5 年增加规定：小麦、玉米中d o n 限量标准为1 0 0 0 i r t g k g 4 0 1 ，与美国f d a 对小麦制品中d o n 含量规定相同1 4 h ；加拿大卫生部对婴儿食品规定为1 0 0 0 p g k g ，而对孕期动物饲料则规定为不得检出，我国暂未有对不同级别人的规定。另外因为对结合态d o n 毒素毒理性研究较少，各国还未制定出结合态d o n 毒素的限量标准。1 5d o n 毒素的检测方法研究进展目前，对谷物中的游离态d o n 毒素的检测方式研究较多，检测方法趋近于成熟，但对于结合态d o n 毒素检测研究方法较少，有待于进一步加强。1 5 1 游离态d o n 毒素的检测游离态d o n 检测的主要方法有物理化学方法和免疫学检测方法，前者主要有薄层层析法( t c l ) 和高效液相色谱法( h p l c ) ，后者主要通过酶联免疫吸附检澳j j ( e l i s a ) 。i 物理化学方法主要检测分析步骤包括：提取、净化、浓缩、检测等步骤。谷物及其制品中的d o n 毒素，通过前期处理，分散为小颗粒物质。目前常用的提取方法为利用d o n 毒素易溶于极性溶剂的特性，使前处理样品溶于乙腈水( 8 4 ：1 6 ，v ：v ) 中，有部分文献提到用甲醇水( 1 ：9 ，v ：v ) 提取小麦中的d o n 毒素 4 2 1 ，获得较好效果，但这种方法较少采用：也有人采用超临界萃取法提取真菌毒素，其主要溶剂二氧化碳具有低毒、易于扩散的特性1 4 3 1 ，但部分文献报道这种方法对样品回收率较其他方法低m 4 1 。d o n 毒素的净化方法有：国标中采用石油醚和c h 3 0 h h 2 0 ( 4 ：1 ) 进行液液萃取，通过p h = 7 的a l 2 0 3 和活性炭净化；另外常用的方法为柱层析( s p e ) 法，一种为极性不同的几类集团填充的多功能净化柱，可以吸附油脂及蛋白等多数杂质，操作较为简单，常与液相检测联用：另外一种采用免疫亲和柱，其填充物为将d o n 毒素的抗体物质与其他固定相结和，较上种灵敏度增强，但成本较高1 4 5 】。d o n 毒素的浓缩：d o n 毒素的浓缩一般采用在适度的温度下氮吹的方法，使得溶解d o n4第一章文献综述毒素的极性溶剂挥发，达到浓缩效果。但这种操作一般要在通风橱内进行，避免部分有毒的急性溶剂对人体的伤害。d o n 毒素的检测：薄层层析法( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y , t l c ) 做为最早的一种国标检测方法，最先建立，检出下限较低( o 1 m g & g ) ，显色方便且可以同时检测多类毒素，但因为其操作繁琐性及精确度较其他方法低、重现性不好等因素，使得目前国内外发表毒素类文章采用较少【4 6 】；随着高效液相色谱价格的普及，其快速、自动化、重现性较高、检测下限及精确度高等优点，成为目前应用于d o n 毒素检测的主要方法。气相色谱法：气相色谱法通过对单端孢霉烯原化合物或碱水解产物检测。其具有灵敏性高，选择性强，精确等特性，但由于该种方法无论仪器或试验试剂费用均较高，难以推广。2 免疫学法免疫学测定法即酶联免疫吸附检测，是一种以免疫抗体为基础的一种检测方法，有着不需要昂贵仪器，操作简单、特异性高、测定快速，检测下限较低( 5 n g m 1 ) ，成本低等优点，国家卫生部食品检验研究所阳传和、计融等建立的免疫检测方法推荐为国家标准( g b t 5 0 0 9 1 11 - 2 0 0 3 ) 1 4 7 。邓舜洲等通过应用自己研制的单克隆抗体，通过间接竞争检测d o n 速度含量，已满足我国对d o n 毒素的检测【4 8 1 。酶联免疫吸附检测由于存在抗体与d o n自身的乙酰化类似物反应，使得部分检出值偏高【4 9 1 。1 5 2 结合态d o n 毒素的检测目前对结合态d o n 毒素的研究较少，对与结合态d o n 毒素的检测一般采用转化为游离态d o n 毒素的方式进行检测。刘阳等人建立了在密闭环境下，将含有结合态d o n 毒素的样品加入三氯乙酸、水，1 4 0 。c下加热4 0 m i n 后，以k o h 中和酸后，将结合态d o n 毒素转化为游离态d o n 毒素进行高效液相色谱检测【5 0 1 。周兵等人随后基于刘阳等人的检测方法，通过表面反应的方法采用加入三氟乙酸( t r i f l u o r o a c e t i ca c i d t l 、a ) 代替三氯乙酸的方法对结合态d o n 进行检测，采用在1 3 3 条件下加热5 4 分钟，另外认为可以避免中和酸1 5 。本实验采用刘阳等人建立的d o n 检测方法检测。1 6 扫描电镜扫描电镜( s e m ) 为扫描电子显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ) 的简称，是一种利用电子束扫描样品表面从而获得样品信息的电子显微镜，它能生成样品表面的高分辨率图像，且图像呈三维，主要被用来鉴定样品的表面结构s 2 。扫描电镜主要由真空系统，电子束系统以及成像系统三大部分组成。其原理为通过在干燥的样品表面喷重金属微粒，使得由一束极细的电子对其扫描从而激发次级电子，被探测体收集并被转化为光信号，再通过光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子柬的强度，从而得到与电子束同步的扫描图5两南大学硕十学位论文像。其分辨率较光学显微镜大上千倍，且放大倍数连续可调，易于进行直接观察。扫描电镜不仅用于生物学中观察花粉、细菌等，还广泛用于医学、材料、动物、材料等领域【5 3 1 。李广旭等人用轮纹病菌对富士苹果枝条接种，并对接菌后其侵入途径进行观察，得到分生孢子侵入时间、完成等过程【5 4 】；康振生等人采用扫描电镜系统，对接种禾谷镰刀菌的小麦穗部6 小时、1 2 小时、及1 到6 天取样，穗轴、颖片、外稃、内稃和子房等部位的观察了禾谷镰刀菌在小麦穗部侵染过程，得到了细致的观察效果【5 5 j 。刘阳等人通过两个冬小麦品种的扫描电镜等观察研究，对病菌的侵入等情况作了细致的描述【5 6 1 。1 7 挤压膨化技术挤压膨化技术从诞生至今已有8 0 余年的发展历史。其主要是通过水分、热量、机械能、压力等的协同作用形成的，为高温、短时的加工过程。从应用于谷物加工的第一台食品挤压膨化的单螺杆挤压机问世，到挤压蒸煮技术在食品工业上的广泛的应用。已经由单一的生产生产谷物食品，发展到生产家畜饲料、水产饲料、植物组织蛋白等领域【5 7 】。挤压膨化的原理为通过物料套筒内对原料的压缩，使得其呈熔融状态，淀粉胶束被破坏，在被挤出后迅速达到常温常压而瞬间膨化，使得组织结构发生变化过程。根据生产工艺不同，植物蛋白挤压技术可大致分为中低水分挤压( 又称干法挤压，物料含水率低于4 0 ) 和高水分挤压( 湿法挤压，物料含水率高于4 0 ) 【5 引，其主要操作参数包括如机筒温度、水分含量、螺杆转速、喂料速度和螺杆结构等。不同的参数对质构，风味、色泽、营养和溶解性等有明显的影响。挤压膨化不仅可以得到可口的食品，其在油脂浸出中可以通过对油料的浸出前膨化而使得浸油时间缩短的效果【5 9 】；谷物通过膨化，可以缩短发酵周期1 6 0 j ；另外在挤压膨化高温高压过程中，一些天然的抗生因子和有毒物质被破化，使得某些劣变的酶被钝化，可以达到降低毒素含量的目的。挤压膨化技术可以实现全程的连续化和自动化，有生产效率高、产品广泛、种类较多和废品较少的优点，使得其有着良好的发展前景。据报道，通过在花生粕中添加较低量的n i - h o h ，在1 7 5 - 1 8 0 条件下挤压膨化，可使得其中的f b i ( 黄曲霉素) 含量减少8 0 1 6 1 1 。另外田菁籽粉通过挤压其生物碱含量由初始的1 9 1 7 减少到0 2 6 0 1 6 2 1 ，檀丽萍等人通过在物料中加糖，使得通过挤压膨化后的玉米面中伏马菌素降解率达到6 1 7 0 一8 8 6 8 ，通过挤压膨化可以有效的降低部分物质中的毒素含副6 3 j6第二童引言第二章引言2 1 研究背景和意义d o n 毒素作为单端孢霉烯族毒素中的一类，主要由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生，是世界范围广泛存在的谷物( 如小麦、大麦、玉米等) 及其制品( 如饼干、啤酒和面包等) 的污染物，含有d o n 毒素的谷物及其制品被人体摄入后会造成厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状，另外d o n 毒素具有很强的细胞毒性，可以抑制生物大分子、蛋白质的合成，影响免疫系统，威胁人体健康。小麦为我国总产量仅次于水稻的谷类作物，赤霉病为我国长江流域等地小麦等谷物多发病，其发病后果是小麦籽粒感染禾谷镰刀菌等菌类，产生d o n 毒素；另外高温、高湿等不当的储存方式以及生产中不当的加工方法也容易使得谷物及其制品感染禾谷镰刀菌，产生d o n毒素。我国目前虽然对谷物中游离态d o n 毒素的有一定的研究，已明确在生长时期小麦籽粒中游离态d o n 毒素先增加后减少呈现波动趋势，但这种波动趋势与结合态d o n 毒素、d o n 毒素总量之间是否存在相应的消长规律，不同抗性小麦品种籽粒中d o n 毒素含量的变化规律，d o n 毒素在小麦籽粒内部中的分布及小麦9 u - l - 中能否去除d o n 毒素，减少已经被污染谷物的损失等均未见系统研究报道。2 2 研究目标通过对不同抗性品种的小麦籽粒在不同生长时期的游离态d o n 毒素、结合态d o n 毒素及d o n 毒素总量进行检测分析，探讨其降解规律，为今后对d o n 毒素的控制，提高小麦食品中的安全性提供理论依据；通过扫描电镜观察被感染的禾谷镰刀菌菌丝在小麦籽粒中的分布情况，同时与小麦籽粒中d o n 毒素含量的变化进行对比分析，为小麦在加工中去除或降低d o n 毒素含量提供理论依据规律；通过小麦面粉加工挤压试验，获取去除被污染谷物d o n 毒素的最佳加工参数，为制取安全食品，减少被污染的谷物的损失提供理论依据。2 3 研究内容及思路本论文研究的主要内容包括以下几个方面：( 1 ) 对不同抗性小麦品种生长期接种禾谷镰刀菌，使得其籽粒中产出d o n 毒素。检测分析各个阶段游离态d o n 、结合态d o n 毒素、d o n 总量变化。( 2 ) 对含有d o n 毒素的不同抗性小麦籽粒进行扫描电镜观察分析。( 3 ) 采用二次正交旋转设计和响应面法( r s m ) ，对含有d o n 毒素的小麦进行挤压膨化7西南大学硕十学位论文加工试验，获取降低d o n 毒素的最佳工艺参数。2 4 研究创新点( 1 )对感染禾谷镰刀菌的不同生长时期的小麦籽粒中的d o n 毒素含量及其存在形态进行分析。( 2 )对被污染的小麦籽粒中的禾谷镰刀菌菌丝的分布进行电镜观察，确定其毒素主要聚集部位。( 3 )通过小麦面粉挤压试验，获取去除被污染谷物d o n 毒素的最佳加工参数。8第三章染菌小麦生长时期籽粒游离态与结合态d o n 毒素变化皇曼皇曼鼍曼曼曼曼曼舅量曼曼曼曼曼曼曼曼舅-：g i n 。o 曼曼曼曼鼍曼曼曼曼曼! ! ! 皇曼曼曼曼曼皇曼! 曼曼皇曼皇曼量皇曼第三章染菌小麦生长时期籽粒游离态与结合态d o n 毒素变化3 1 试验材料及仪器设备3 1 1 试验材料禾谷镰刀菌：f g l 7 8 ( 中国农科院农产品加工研究所生物实验室保存)小麦品种：小麦种籽由中国农业科学院作物科学研究所提供，分三种类型：a 低抗品种：宁麦6 号、扬麦3 号；b 中抗品种：杨麦4 号、西农9 7 9 ；c 高抗品种：望水白、苏麦3 号；3 1 2 主要试剂9西南大学硕十学伊论文3 1 4 培养基及试剂的制备a )s n a 液体培养基：用电子天平精确称取l gk h 2 p 0 4 、l g k n 0 3 、0 5 9m g s 0 4 7 h 2 0 、0 5 9 k c ! 、0 2 9 葡萄糖、0 2 9 蔗糖，溶解于装有1 0 0 0 m l 蒸馏水的三角瓶中，1 2 1 高压灭菌2 0 m i n 。b ) p d a 培养基【叫：马铃薯去皮、切丁，称取2 0 0 0 9 ；葡萄糖，3 5 o g ；蒸馏水，加至1 升。将马铃薯加入1 升蒸馏水中，煮沸l 小时，取其滤液加水至l 升。加入葡萄糖和琼脂，蒸汽浴加热溶解。倒入平板后带冷却用封口膜封口后备用。c )乙腈水溶液( 8 4 ：1 6 ，v v ) ：量筒准确量取8 4 m l 乙腈( 分析纯) 、1 6 m l 蒸馏水，混匀，常温放置备用。d )1 mt c a 溶液：用电子天平精确称取3 2 6 8 9 三氯乙酸，溶解于2 0 0 m l 蒸馏水，混匀，常温放置备用。e )1 mk o h 溶液：电子天平精确称取1 1 2 2 9 k o h ，溶解子2 0 0 m l 蒸馏水中，混匀，常温放置备用。f )流动相( 5 ：5 ：9 0 ，v ) ：量筒精确量取5 0 m l 乙腈( 色谱纯) 、5 0 m l 甲醇( 色谱纯) 、9 0 0 m l纯净水，混匀，常温放置备用。3 2 实验方法本实验采用对扬花期的小麦接种已经活化的f g l 7 8 菌( 禾谷镰刀菌) ，并对接菌后不同时期小麦取样，检测。主要技术路线如下：f g l7 8 菌活化一扩大培养小麦栽培- 接种一取样一样品处理一样品检测3 2 _ 1 小麦的栽培与管理本试验采用盆栽试验，对1 个小麦生长周期研究，栽培时间为2 0 0 8 年1 1 月，每种小麦1 5 盆。生长期由专人定期施肥灌溉管理处理。在生长期3 1 天时剪去弱株，每盆留1 5 株供试验用。3 2 2 菌种的扩大培养3 2 2 1 菌种的活化在无菌操作台中，将保存于平板中的禾谷镰刀菌( f g l 7 8 ) 以划线接种方式接种至p d a固体平板，于恒温箱中2 5 。c 恒温培养3 天。3 2 2 2 菌种的扩大1 0第二章染菌小麦生长时期籽粒游离态与结合态d o n 毒素变化詈鼍ii-! i i 。iil ：-_ 蔓将上步已活化后的菌种以打孔方式，挑去6 - 8 个菌圈，接种至s n a 液体培养基中，2 8 。c恒温振荡培养7 天。3 2 2 3 孢子计数及观察在无菌操作台内，以移液枪取孢子悬浮液数滴，均匀滴于细胞计数器载玻片上，盖上盖玻片，防治气泡出现。放置于光学显微镜下观察，重复3 次，取3 次观测的平均值。每毫升孢子数的计算公式：m ：一a ：兰占cx4 0 0c = o 1 0 x 1 4 0 0m m 3 = 2 5 x 1 0 m l ：其中：m 为每毫升的孢子数，a 为血球计数器中4 0 0 个小方格内观察到的孢子数，b 为血球计数器上4 0 0 小方格的体积f 6 5 】。3 2 3f g l 7 8 菌接种至小麦在小麦扬花中期，在计数约为3