（植物学专业论文）细胞外atp对拟南芥花粉萌发的影响及其信号转导初探.pdf

摘要 花粉萌发和花粉管生长是研究细胞信号转导和细胞极性生长的模式体系。花粉萌发 与花粉细胞质游离钙离子浓度( 【c a 2 + 】。y t ) 密切相关，细胞质膜c a 2 + 通透性通道和异三 聚体g 蛋白都可以通过调节胞质c a 2 + 浓度及c a 2 + 信号影响花粉萌发和花粉管生长。植 物细胞外a t p ( 栅) 作为一种胞外信号分子，在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要 作用。为了探索e a t p 对花粉萌发和花粉管生长的影响及其可能的信号转导机制，本文 以拟南芥为实验材料，研究了外源a t p 对花粉萌发和花粉管生长的影响，利用电生理学 方法检测了e a t p 对花粉细胞质膜钙通道活性的影响，并利用异三聚体g 蛋白突变体材 料探索了异三聚体g 蛋白在e a t p 调节花粉萌发过程中的作用。 实验结果表明，外源e a t p 显著抑制了拟南芥花粉萌发，随着e a t p 浓度升高，抑 制程度不断加强。外源a d p 同样能够抑制花粉萌发，而外源a m p 和腺苷则几乎没有作 用。 我们采用全细胞电压钳记录方式，在拟南芥花粉细胞质膜上检测到了超极化激活的 c e + 通道，外源a t p 可强烈抑制花粉细胞质膜跨膜c a 2 + 电流，显示棚对花粉萌发的 抑制作用可能是通过抑制花粉细胞质膜上c a ：+ 通道活性，减弱了胞外c a 2 + 内流引起的。 利用异三聚体g 蛋白突变体材料进行的实验结果显示，外源a t p 处理后，野生型 和各种突变体材料的花粉萌发率都明显降低，同时野生型和各种突变体材料的质膜c a 2 + 电流强度都明显减弱，在e a t p 对花粉萌发及对花粉细胞质膜c a 2 + 电流的抑制作用方面， g 蛋白不同突变体与野生型之间没有显著差异。这说明异三聚体g 蛋白可能不参与e a t p 对花粉萌发和质膜钙通道的调控过程。 关键词：拟南芥花粉e a t p 异三聚体g 蛋白c a 2 + 通道 a b s t r a c t p o l l e ng e r m i n a t i o na n dp o l l e nt u b eg r o w t hi so n eo ft h em o d e ls y s t e m so fc e l ls i g n a l t r a n s d u c t i o na n dp o l a rg r o w t h c a 2 + 】c y tp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei np o l l e ng e r m i n a t i o na n d p o l l e nt u b eg r o w t h b o t hh e t e r o t r i m e r i cgp r o t e i na n dc a l c i u mc h a n n e lo np l a s m am e m b r a n e ( p 1 v oc a nr e g u l a t ep o l l e ng e r m i n a t i o na n dt u b eg r o w t ht h r o u g hr e g u l a t i n g c a 2 + 】c ”a n dc a 2 + s i g n a l i n g a sas i g n a l i n ga g e n t ，e x t r a c e l l u l a ra t p ( e a t p ) p l a y sas i g n i f i c a n tr o l ei np l a n t g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t ，a sw e l la sr e s i s t a n c er e s p o n s e i nt h i sp a p e r , w ei n v e s t i g a t e dt h e e f f e c ta n dm e c h a n i s mo fe x o g e n o u sa t po np o l l e ng e r m i n a t i o no fa r a b i d o p s i st h a l i a n a e l e c t r o - p h y s i o l o g i c a lt e c h n i q u ew 勰a p p l i e dt od e t e c tt h er o l eo fe a t po nc a l c i u mc h a n n e li n p l a s m am e m b r a n eo fa r a b i d o p s i sp o l l e nc e l l w ea l s os t u d i e dw h e t h e rh e f e r o t r i m e r i cg p r o t d nw a si n v o l v e di nt h er e g u l a t i v ep a t h w a yo fe a t po np o l l e ng e r m i n a t i o nu s i n gv a r i o u s m u t a n t so fg p r o t e i n o u rr e s u l t s s u g g e s tt h a te x o g e n o u sa t pl e a d st o a l lo b v i o u sd e c r e a s eo fp o l l e n g e r m i n a t i o np e r c e n t a g ei nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r a l o n gw i t l lt h ei n c r e a s i n go fe a t p c o n c e n t r a t i o n ，p o l l e ng e r m i n a t i o np e r c e n t a g eb e c a m el o w e ra n dl o w e r e x o g e n o u sa d pc a n a l s oi n d u c ea l le f f e c t i v ed e c r e a s eo fp o l l e ng e r m i n a t i o n b u ta m pa n da d e n o s i n es h o wn o r e m a r k a b l ee f f e c to np o l l e ng e r m i n a t i o n b yu s i n gw h o l e - c e l lp a t c hd a m p i n gah y p e r p o l a r i z a t i o n a c t i v a t e dc a 2 + c h a n n e lw a s r e c o r d e di np l a s m am e m b r a n eo fp o l l e ng r a i n e x o g e n o u sa t p r e m a r k a b l yi n h i b i t e dt h e c a l c i u mc h a n n e la c t i v i t y , s u g g e s t i n gt h a te a t p i n d u c e dd e c r e a s eo fp o l l e ng e r m i n a t i o nm a y r e s u l tf r o mt h ei n h i b i t i o no fe a t po nc a l c i u mc h a n n e li np ma n dt h ec o n s e q u e n td e c r e a s eo f c a l c i u mi n f l u x e x o g e n o u sa t pd e c r e a s e dt h eg e r m i n a t i o np e r c e n t a g eo fa l lg p r o t e i nm u t a n t sa n dt h e w i l dt y p es i m i l a r l y , a n ds oa st ot h ec a + c u r r e n t s ，i n d i c a t i n gt h a tg p r o t e i nm a yb ee x c l u s i v e f r o mt h ep a t h w a yo fe a t p - i n h i b i t e dp o l l e ng e r m i n a t i o na n dc a l c i u mc h a n n e la c t i v i t y k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，p o l l e n ，e x t r a c e l l u l a ra t p ，h e t e r o t r i m e r i cgp r o t e i n , c a 2 + c h a n n e l l l 学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文细胞外a t p 对拟南芥花粉萌发的影响及其信号转导初探， 是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内 容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，已在文中标明。 本声明的法律后果由本人承担。 论文作者( 签名) 替耆黟 叶年j 月形日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在年解密后适用本授权书) 论文作者( 签名) 鼢黪 叶年j 月吩日 指导教师( 签名) ：；- ”5 z , 育- 叫年，月舢8 一d1乍 密凼 ： 日 名葡签月 p ， ， 认- j 砒年 耵f 师身， 教 协 撒如 指 文献综述 1 细胞外a t p 信号分子的生理功能与信号转导 a t p 是所有生命有机体细胞内普遍存在的富含能量的化合物。它既存在于细胞器 内，如线粒体和叶绿体，也存在于高等生物的细胞质中。在胞内，a t p 储存的能量被用 于驱动细胞和生物体的多种最基本最重要的生化反应。近年来的研究发现，a t p 不仅存 在于细胞内，而且存在于胞外基质中。1 9 2 9 年在动物细胞外基质中发现游离a t p 分子 ( f i s k e 和s u b a r r o w ，1 9 2 9 ) ，1 9 5 9 年h o l t o n 报道神经细胞可以向细胞外分泌a t p ，胞 外a t p 的存在才被发现。1 9 7 8 年，b u m s t o c k 提出了嘌呤受体的概念，a t p 信号转导的 研究更为深入，并不断取得突破，逐渐形成了胞外a t p ( e x t r a c e l l u l a r a t p ，e a t p ) 信使 的概念( r a l e v i e 和b u r n s t o c k ，1 9 9 8 ) 。然而，直到2 0 0 0 年t h o m a s 等在拟南芥中发现 e a t p ，e a t p 的信使功能才开始引起植物生物学家们的关注。 1 1a t p 的释放和降解 1 1 1a t p 的释放 植物细胞中的a t p 都是在线粒体和叶绿体形成的，并且停留在质膜边缘。那么， a t p 是以怎样的浓度如何从胞内被释放到胞外的呢? 动物细胞中的研究结果表明：缺氧、剪应力刺激、细胞活力下降等病理状态可以 促使a t p 转运到胞外；生理情况下，机械牵拉、低渗溶液等刺激也可以诱导正常细胞释 放a t p ( y a m a m o t o 等，2 0 0 3 ；a l e u 等，2 0 0 3 ) 。a t p 运输的确切机制尚未完全明了， 但有报道表明a t p 结合转运体( a t p - b i n d i n gc a s s e t t et r a n s p o r t e r ，a b c ) 、连接蛋白半通 道、a t p 通透阴离子通道以及囊泡释放等途径都是可能的机制( 罗海和王立伟，2 0 0 6 ) 。 动物细胞中的转运释放途径也同样发生在植物细胞中。2 0 0 0 年，t h o m a s 等发现转 录了拟南芥a b c 结合转运体m d r l ( m u l t i d r u gr e s i s t a n c e1 ) 基因的酵母菌可以向其胞 外培养液中释放a t p ，过表达m d r l 基因显著提高了拟南芥叶片渗出液中a t p 的含量， 为e a t p 通过a b c 结合转运体运输提供了证据。j e t e r 等( 2 0 0 4 ) 发现触摸和渗透胁迫 可以刺激拟南芥幼苗中a t p 的释放。动物细胞中有报道，分泌囊泡可以包裹着毫摩尔水 平甚至更高浓度的a t p ，通过与质膜融合将a t p 释放到胞外基质( l a z a r o w s k i 等， 2 0 0 3 ) 。这种胞吐作用在植物中也有发现。k i m 等( 2 0 0 6 ) 发现a t p 的释放发生在细 胞快速生长和增殖的区域，a t p 的最高浓度在分泌小泡传输速率最高的地方检测到。这 份报道同时说明，e a t p 水平与植物快速生长的区域相关。w u 等( 2 0 0 7 a ) 的研究进一 步证实了这一结论，他们的结果表明，花粉管、根尖和胚轴等顶端生长的细胞的生长过 程都伴随着a t p 的释放。 s o n g 等( 2 0 0 6 ) 通过测量伤流液中的a t p 浓度，证明a t p 可以通过伤1 2 1 部位释放 到胞外基质，并且记录到这一过程释放的a t p 的平均浓度为4 0p m 。他们在实验中观察 到，伤口一出现，a t p 就会从胞质释放，浓度在毫摩尔水平，接近胞质a t p 的水平， 但是这一水平随后即被胞外非损伤组织中较低的a t p 浓度冲淡。 w u 等( 2 0 0 8 ) 用酵母提取液的激发子y e ( e l i c i t o rf r o my e a s te x t r a c t ) 处理液体培 养的丹参( s a l v i am i l t i o r r h i z a ) 不定根，发现y e 可以诱导a t p 由根向培养基的瞬时释 放。释放的a t p 的水平与y e 剂量相关，1 0 0m g l - 1 的y e 浓度最为有效，这一浓度y e 处理1 0 小时后e a t p 水平达到最大值6 5n m ( 是对照的7 0 倍) ，这之后6 小时又回复 到正常水平。这一过程可以被5m m 钙离子螯合剂e g t a 和2m m 钙通道阻断剂口+ 完全阻断，说明y e 诱导a t p 释放的过程依赖于质膜c a 2 + 内流。这一结果与k i m 等( 2 0 0 6 ) 的发现是一致的。w u 等认为y e 诱导的a t p 释放的途径可能与动物细胞质膜钙离子调 节的阴离子通道类似。 1 1 2e a t p 的降解及回收 a t p 在胞外完成信号功能之后，必须通过代谢再次被运输到细胞内，才能保证细胞 正常的生命活动。胞外具有多种核苷酸酶类，包括腺苷三磷酸双磷酸酶、三磷酸核苷二 磷酸水解酶、核苷三磷酸水解酶、核苷酸焦磷酸酶、碱性磷酸酶和5 核苷酸酶以及其他 可以破坏核苷磷酸键的酶类( z i m m e r m a n n ，2 0 0 0 ；v e k a r i a 等，2 0 0 6 ) ，它们可以将e a t p 水解为c a m p 。 c a m p 或其他水解产物，必须被重新转运至胞内再利用。但是质膜上尚未发现a m p 的转运机制，所以人们猜测a m p 又被磷酸酯酶水解为腺苷和磷酸。马铃薯块茎细胞壁 存在磷酸酯酶( s t e p h e n s 和w o o d ，1 9 7 4 ) ，而腺苷可以由e n t 转运体( e q u i l i b r a t i v e n u c l e o s i d et r a n s p o r t e r s ) 转运至细胞内( m o h l m a a n 等，2 0 0 1 ) 。w o r m i t 等( 2 0 0 4 ) 猜想 这些转运体可能也参与e a t p 回收。植物还有嘌呤透性酶( p u p s ) ，它可以沿着旷梯度 将腺嘌呤转运至细胞内( g i l l i s s e n 等，2 0 0 0 ；b u r k l e 等，2 0 0 3 ) 。d a v i d 等( 2 0 0 8 ) 鉴 定出了一种定位于细胞壁的典型的腺苷核蛋白质酵素( a n a s e ) ，并且检测到它在质外体 与腺苷三磷酸双磷酸酶的活性是共调节的。他们还发现a t p 、a d p 、a m p 可以促进腺 2 苷向腺嘌呤的转变。这就暗示了e a t p 的一种回收途径，即e a t p 被腺苷三磷酸双磷酸 酶等a t p 酶水解为e a m p ，e a m p 被磷酸酯酶水解为腺苷，腺苷再进一步由胞外核蛋白 分解酵素转化为腺嘌呤，最后腺嘌呤由p u p s 转入细胞内。 1 2e a t p 的受体 已经证实，在动物细胞中存在两类主要的嘌呤受体( p 1 、p 2 ) ( r a l e v i c 和b u m s t o c k ， 1 9 9 8 ) 。两类受体对e a t p 、嘌呤和嘧啶呈现出不同的敏感度。p 1 受体主要由腺苷激活， 又称为腺苷受体，是一类异三聚体g 蛋白偶联受体。p 2 受体的配体比较广泛，包括a t p 、 a d p 、u r p 、u d p 以及他们的类似物。根据分子结构和信号转导机制的不同，p 2 受体又 分为两类：p 2 x 和p 2 y 。p 2 x 受体是配体门控的非选择性阳离子通道，而p 2 y 受体是一类 g 蛋白偶联受体。目前，哺乳动物已克隆出七种p 2 x 受体( p 2 x 1 7 ) 和五种p 2 y 受体( p 2 y l ， p 2 y2 ，p 2 y4 ，p 2 y 6 ，p 2 yl i ) ，这些都被认为是有效的p 2 受体家族成员。磷酸吡多醛6 偶氮苯基2 。，4 - - - 二硫酸( p p a d s ) 、苏拉明( s u r a m i n ) 和r b 2 ( r e a c t i v eb l u e2 ) 等是p 2 类受体的选择性抑制剂，但对p 2 x 和p 2 y 没有选择性，对二者活性都有强烈的抑制作用 ( v a r y 和b u r n s t o c k ，1 9 9 8 ) 。细胞外m 与其受体结合，可以启动多种复杂的下游信 号转导过程，如通过影响跨膜离子转运过程刺激细胞电信号产生、刺激细胞内c a 2 + 浓度 升高以及钙信号产生、诱导特定基因表达以调节细胞生长发育过程等( r a l e v i c 和 b u m s t o c k ，1 9 9 8 ：f i e l d 和s t e v e n s ，2 0 0 0 ；b u r n s t o c k ，2 0 0 6 ) 。 植物细胞中尚未鉴定出有效的嘌呤受体。拟南芥和水稻基因组序列分析都未发现与 编码p 2 x 或者p 2 y 受体蛋白显著相似的基因( r o u x 和s t e i n e b r u n n e r ，2 0 0 7 ) 。尽管单细 胞生物绿藻( o s t r e o c o c c u st a u r i ) 中鉴定出了p 2 x 受体，但是它并不在细胞质膜起作用 ( f o u n t a i n 等，2 0 0 8 ) 。但也有很多实验结果为类p 2 受体在植物中的存在提供了间接 证据。2 0 0 3 年，d e m i d c h i k 等发现p p a d s 和苏拉明可以强烈抑制外加a t p 引起的拟南芥 根细胞中的c a 2 + 内流。s o n g 等( 2 0 0 6 ) 报道p p a d s 和r b 2 可以抑制e a t p 引起的活性氧 的积累。f o r e s i 等( 2 0 0 7 ) 的结果显示p p a d s 显著抑制了a t p 对n o 生成的促进作用。 植物细胞嘌呤受体或类似嘌呤受体的机制还有待鉴定。 1 3e a t p 的生理作用 1 3 1 动物细胞e a t p 的功能 嘌呤是胞外信使分子的概念最早在1 9 2 9 年由d r u r y 和s z e n t g y 6 r g y i 提出。他们报道 3 从心肌细胞中提取的腺苷和a m p 在心脏阻滞、动脉扩张、降低血压和抑制肠道收缩等方 面有显著功效。1 9 3 4 年，g i l l e s p i e 对腺苷复合物的结构活性关系进行了实验，表明a t p 促进血压升高，而a m p 和腺苷没有此作用；而在肠道和子宫收缩功能上a t p 比a m p 和腺 苷也更有效。这是第一次指出腺苷和a t p 的不同活性，自此，胞外a r p 信使在动物细胞 中的研究不断深入。1 9 4 8 年，b u c h t h a i 和f o l k o w 发现乙酰胆碱对骨骼肌收缩的促进 作用可以被e a t p 力i i 强。1 9 5 9 年，h o l t o n 报道兔耳感觉神经细胞可以向胞外释放a t p ， e a t p 可作为神经递质发挥作用。e a t p 的这一功能在之后的研究中进一步被证实。研究 表明，a t p 和类似的核苷磷酸在调节肠道、血管、输精管和膀胱的肌肉收缩等过程中都 发挥着神经递质的作用( b u m s t o c k 等，1 9 7 0 ；b u m s t o c k ，1 9 7 2 ；s n e d d o n 和b u m s t o c k ， 1 9 8 4 ；b u m s t o c k 和w a r l a n d ，1 9 8 7 ) ，并且可以与乙酰胆碱、一氧化氮等其他神经递质 一同参与对中枢神经系统的生理活动的调节( b u r n s t o c k ，2 0 0 4 ) 。1 9 8 6 年，g o r d o n 发 现，e a t p 参与调节免疫反应和心脏功能。2 0 0 1 年，h o l l o p e t e r 等报道，e a t p 可以促进 血小板凝集。a b b r a c c h i o 和b u r n s t o c k ( 19 9 8 ) 与g r e i g 等( 2 0 0 3 ) 的研究表明，e a t p 可以促进细胞增殖和发育以及胚胎发育和伤口愈合过程中部分细胞的凋亡。 上述结果表明e a t p 在包括平滑肌收缩、神经递质传递、内分泌和外分泌、免疫应 答、炎症反应、血小板凝集、疼痛和心脏功能调节等诸多生理过程中都具有重要作用。 目前，e a t p 在抗癌活性方面的研究也取得了较大进展：a t p 能够抑制前列腺癌、乳腺癌、 结肠癌、肝癌、卵巢癌等多种人类肿瘤的生长；a t p 可以减轻非恶性组织对化疗和放疗 的抵抗性：a t p 可以通过扩大血浆a t p 池，缓解罹患癌症引起的消瘦、食欲减退和激素 失调( 罗海和王立伟，2 0 0 6 ) 。a t p 应用于晚期癌症治疗已经在西方国家进行了小规模 的临床试验( a g t e r e s c h 等，2 0 0 3 ) 。在不久的将来，a t p 有可能作为一种新型而有效 的抗癌药，为人类的健康带来新的希望。 1 3 2 植物细胞e a t p 的功能 在对植物细胞e a t p 信使功能的研究中，一些结果表明，高水平的e a t p 对植物的生 长发育和防御外来侵害是不利的。 l e w 和d e a m a l e y ( 2 0 0 0 ) 报道，外加a t p 和a d p 可以促进拟南芥根毛的生长。2 0 0 3 年，t a n g 等发现e a t p 可以破坏拟南芥根的向重力生长特性。他们的结果显示，在培 养基中加入lm me a t p ，根改为向水平方向生长；将a t p 浓度增大到2m m ，根的生长 发生弯曲；3m m 的a t p 处理，刺激了侧根的生长。外加a d p 和无机磷酸不能引起同样 的效果，说明a t p 在这一过程中的特效性。外加a t p 可以增加根对生长素的敏感性，增 4 强生长素对根的抑制作用，使根的生长受到进一步抑制。g e i s l e r 和m u r p h y ( 2 0 0 6 ) 也 发现e a t p 可以影响生长素的极性运输。 细胞外腺苷三磷酸双磷酸酶( e c t o a p y r a s e ) 严格调控着e a t p 的浓度。对腺苷三磷酸 双磷酸酶的研究可以帮助我们进一步认识e a t p 在植物生长发育中的作用。t h o m a s 等 ( 1 9 9 9 ) 报道，细胞外腺苷三磷酸双磷酸酶能促进植物细胞的生长。2 0 0 0 年，他们又 发现细胞外腺苷三磷酸双磷酸酶活性还可以提高细胞对非生物胁迫的耐受性。抑制该 酶活性或外加a t p ，酵母和拟南芥细胞对放线菌酮的抵抗能力减弱；提高细胞外腺苷 三磷酸双磷酸酶活性，两类细胞对放线菌酮的敏感性增强。而细胞外腺苷三磷酸双磷 酸酶活性决定了o a t p 的水平，这就说明细胞对毒素的耐受性与e a t p 水平有关( t h o m a s 等，2 0 0 0 ) 。s t e i n o b r u n n e r 等( 2 0 0 3 ) 的研究发现敲除腺苷三磷酸双磷酸酶基因a t a p y i 和a t a p y 2 后，拟南芥的花粉萌发率明显下降，用此酶的专一性抑制剂或高浓度的a t p 处理花粉都会抑制花粉管的出现。但外加a m p 则不能抑制花粉萌发。w o l f 等( 2 0 0 7 ) 通过表达花粉特异性腺苷三磷酸双磷酸酶启动子，使a t a p y i 和a t a p y 2 双突变体花粉 重新萌发，得到a t a p y l 和a t a p y 2 基因被破坏的后代。发现这些双突幼苗极端矮小， 几乎没有根和芽的生长，在幼苗阶段就死亡了。w u 等( 2 0 0 7 a ) 发现a t a p y l 和a t a p y 2 在花粉管、胚轴和根尖等快速生长的细胞和组织中表达量最高，而在发育完全的成熟 细胞和组织中几乎没有表达。他们通过r n a i 技术在a p ) ，2 被敲除的背景下再使a t a p y l 基因沉默，发现这种基因型的植株芽和根的数量都比野生型要少。生长3 5 天后，胚轴 长度比野生型短1 5 3 5 ，平均根长只有野生型的1 2 1 4 。他们还用a t a p y l 和a t a p y 2 的特异性多克隆抗体增加胞外6 m 浓度，发现培养基中加入免疫血清后，花粉管的生 长速率降低了4 0 ，增大免疫血清浓度，花粉管的生长速率进一步被降低；但免疫前血 清和缓冲液浓度对花粉管生长没有影响。检验培养基中e a t p 浓度显示，伴随着花粉管 生长，a t p 被释放到培养基质中，外加抗体增加了e a t p 的浓度，抑制了花粉管的生长， 当e a t p 浓度增长到正常培养的拟南芥细胞a t p 浓度的2 倍时，花粉细胞死亡。这些结果 说明e a t p 参与植物生长发育的调节。r o u x 等( 2 0 0 6 ) 利用黄化苗进行实验，发现1 0 0 2 0 0 山a t p 可以促进胚轴伸长生长，但0 4 1m ma t p 则起到了一种抑制作用，说明高浓度 的a t p 对胚轴的生长不利。 除了上述结果，科学家也得到了一些证据，表明e a t p 对植物正常生长和抵御外来 的侵害是必需的。 e a r p 与豆科植物根瘤形成有关，显示出e a t p 可能在植物细胞抵抗外来生物侵袭中 发挥作用。e t z l e r 等( 1 9 9 9 ) 和d a y 等( 2 0 0 0 ) 报道，根瘤菌释放的结瘤因子可以显著 促进腺苷三磷酸双磷酸酶基因的表达，并通过与该酶结合增强其活性，并随之促进根瘤 形成，而该酶的抗体则明显抑制根瘤形成。2 0 0 5 年，m c a l v i n 和s t a c e y 也报道，在豆科 植物百脉根中，超表达腺苷三磷酸双磷酸酶可导致根瘤数量大幅度增加，而抑制该酶的 基因表达可显著减少根瘤的形成。 c h i v a s a 等( 2 0 0 5 ) 的实验证实了胞外a t p 在植物细胞生存能力调节过程中具有不 可缺少的作用。他们用拟南芥、玉米、烟草和大豆为实验材料，以葡萄糖己糖激酶和 腺苷三磷酸双磷酸酶作为e a t p 的清除剂，彻底清除细胞中的e a t p 分子，结果导致了植 物细胞的死亡。用非水解的a t p 类似物p ，丫一亚甲基腺苷5 三磷酸( f l q , m e a t p ) 竞争性 抑制e a t p 的作用，同样导致了细胞死亡。这表明足量e a t p 的存在对植物细胞存活是必 需的，推测e a t p 可能对某些维系植物细胞生命活动的基本生理过程进行调控，e a t p 的 清除导致这些生理过程的停止，进而引起了细胞死亡。他们还研究了e a t p 在伏马毒素 f b i ( f u m o n i s i n b l ，一种诱导细胞程序性死亡的真菌毒素) 诱导的细胞死亡过程中的 作用，发现f b l 处理拟南芥液体培养细胞，会导致e a t p 减少，随后细胞死亡，而外加a t p 则可大大缓解f b l 造成的这种毒害作用。推测某些病源刺激下引起的植物细胞受害甚至 死亡可能缘于e a t p 的匮乏。 k i m 等( 2 0 0 6 ) 用一种定位于细胞壁的纤维素结合蛋白基因与一种需要a t p 激活的 荧光素酶基因融合，构建a t p 的报告基因，通过检测细胞壁中荧光的定位和荧光强度确 定e a t p 分子的分布和浓度。利用这种方法，他们在拟南芥、苜蓿、小麦和莲等植物不 同器官的细胞壁中都检测到了a t p 。e a t p 的最高浓度出现在旺盛生长的细胞( 生长中的 根毛和伸长区细胞) 中，并且他们检测到在生长中的根毛尖端存在一个自尖端向基部的 e a t p 浓度梯度，但在停止生长的根毛细胞壁中e a t p 浓度则很低，尖端也不存在e a t p 梯 度，这说明e a t p 浓度与细胞生长速度之间存在明显的正相关性，高浓度e a t p 对于维持 细胞正常的生长发育可能是必不可少的因素之一。 a t p 处理可以引起0 2 。( s o n g 等，2 0 0 6 ) 、n o ( f o r e s i 等，2 0 0 7 ) 、h 2 0 2 ( w u 等， 2 0 0 8 ) 等r o s 的合成和积累，并可以提高由伤害和其他胁迫条件诱导的基因的表达( s o n g 等，2 0 0 6 ) ，暗示胞夕f a t p 在伤害和胁迫反应中起潜在的信号作用。 6 1 4e a t p 的信号转导机制 动物细胞e a t p 通过参与细胞外蛋白质的磷酸化或结合质膜嘌呤受体两种途径发挥 作用。e a t p 可以通过调节胞外蛋白质的磷酸化，调节细胞外功能蛋白的活性，参与多种 细胞生理活动。e a t p 也可以结合不同的p 2 受体，刺激下游细胞内信使分子产生，调节细 胞内生理反应( r a l e v i c 和b u m s t o c k ，1 9 9 8 ；b u m s t o c k ，2 0 0 6 ) 。e a t p 与p 2 x 受体结合， 引起跨膜离子流动，产生质膜电信号；与p 2 y 受体结合，激活或抑制g 蛋白偶联的效应 酶，如腺苷酸环化酶和磷脂酶c ，引起下游胞内反应。动物细胞中很多生理过程都依赖 于e a t p 激活嘌呤受体来启动下游信号通路。如，胞外a r p 结合至l j p 2 x 7 受体来激活星形胶 质细胞g i n 释放，进而调节突触活动并参与大脑细胞突触间的信号传导( d u a n 等， 2 0 0 3 ) 。植物细胞e a t p 信号转导机制研究在很大程度上借鉴了动物细胞e a t p 的研究思 路。 1 4 1 质膜钙通道和细胞内c a z + 在e a t p 信号转导中的作用 动物细胞中，e a t p 与嘌呤受体结合，嘌呤受体直接( 通过结合p 2 x 对钙离子通道的 通透性改变) 或间接( 通过与p 2 y 受体偶联的g 蛋白的下游影响) 作用于钙信号转换过 程，并通过c a 2 + 信号影响下游的生理反应( g u t i e n e z 等，1 9 9 9 ：n o b i l e 等，2 0 0 3 ) 。 越来越多的实验证据表明，细胞：j c a 2 + 在植物细胞e a t p 信号转导中同样发挥作用。 l e w 和d e a m a l e y ( 2 0 0 0 ) 发现e a t p 和e a d p 可导致拟南芥根毛细胞原生质膜去极化， 这可能与离子通道的开启相一致。d e m i d c h i k 等( 2 0 0 3 ) 报道，栅引起了拟南芥根细 胞中【c a ，】。y t 的瞬时升高，c a 2 + 浓度升高的幅度与e a t p 的浓度成正相关，不能水解的a t p 类似物也能促进细胞i 为c a 2 + 水平的升高，这说明e a 耶引起的【c a 2 + 】c y t 瞬时升高作用不需 要a t p 的水解。质膜钙通道抑制剂g d 3 + 和异搏定都能够强烈抑制e a t p 引起的钙信号产 生，表明胞外c a 2 + 内流可能是胛刺激【c a 2 + 】c y t 升高的原因。 j e t e r 等( 2 0 0 4 ) 也发现a 研s 和a d 邓s 可以增加 c a 2 + 】c y i ，外加a t p 可以激活拟南 芥伤害和胁迫信号转导过程中某些基因的表达，这两个过程可以被b a p t a 、l a 3 + 和g d 3 + 强烈抑制，却不受胞内钙库释放的抑制剂( 如u 7 3 1 2 2 ) 的影响，说明e a t p 可能是通过 激活细胞质膜上电压依赖的c a 2 + 通道，促进c a 2 + 内流发挥的信号作用。 s o n g 等( 2 0 0 6 ) 认为c a 2 + 和钙调素很可能在e a t p 诱导的超氧离子的产生过程中发 挥作用，因为钙通道阻断剂，钙离子螯合剂，钙调素拮抗剂都降低了a t p 诱导的超氧离 子的积累。 d e m i d c h i k 等( 待发表) 得出如下结果：3 0 州a t p 和a p m e - a t p 处理拟南芥根细胞 原生质体，用c a 2 + 选择性微电极检测到c a 2 + 的内流；在组成型表达水母发光蛋白的细胞 中检测到a t p 和a p m e a t p 引起【c a l 。y t 升高，并证实 c a 2 + 】。”升高是c a 2 + 内流的结果，g d 3 + 7 和苏拉明都能抑制这一过程；应用膜片钳技术表明a t p 激活了质膜超极化激活的c a 2 + 通 道，并证实了这是一个1 9 p s 的c a 2 + 通道。这些结果证明t e a t p 可以激活质膜c a 2 + 通道， 引起胞内自由c a 2 + 浓度的升高。同时由于三部分实验都是以去除了细胞壁的原生质体为 材料的，也就说明了e a t p 信号的感知在质膜，而不是细胞壁。 1 4 2 活性氧在e a t p 信号转导中的作用 活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 在植物细胞信号转导中发挥重要的调节作用。 r o s 广泛参与到植物细胞的细胞周期、细胞程序性死亡和坏死、细胞壁的形成和发育、 细胞形态建成等诸多生理过程中，并且与c a 2 + 信号关系密切( 田敏等，2 0 0 5 ) 。动物 细胞中由e a t p 引起的生理反应可以受至u r o s 的促进，植物细胞中r o s 也参与e a t p 的信 号过程。 k i l n 等( 2 0 0 6 ) 发现，外加a t p 可以刺激拟南芥根毛细胞内r o s 的合成，加入角素 ( 模拟病原刺激) 或c a 同样刺激r o s 合成，# i 力 i a d p 、a m p 和腺苷没有此现象产生， 外加腺苷三磷酸双磷酸酶则会明显减少r o s 的生成，并抑制根毛的生长，表明e a t p 诱导 的r o s 形成在根毛生长过程中发挥促进作用。 s o n g 等( 2 0 0 6 ) 报道，外加a t p 可诱导拟南芥超氧离子( o h 。) 的积累，a t p 同时 也诱导了拟南) 芹a t r b o h dm r n a 的积累，但a t p 在敲除了a t r b o h d 和a t r b o j i 扩基因的拟南 芥突变体中未能引起0 2 。的积累，野生型植株中加入n a d p h 氧化酶的抑制剂二亚苯基碘 ( d i p h e n y l e n c i o d o n i u m ，d p i ) 抑$ 1 a t p 诱导的r o s 积累。这说明e a t p 可能通过调节细 胞质膜上n a d p h 氧化酶活性诱导r o s 的产生。伤害刺激可以引起受伤部位e a t p 的大量 积累，同时又刺激r o s 的合成。外加动物细胞p 2 受体抑制剂p p a d s 和r b 2 抑制了a t p 引 起的r o s 的积累，表明e a t p 可能是通过类似的受体介导r o s 信号传递。在e a t p 和活性 氧产生之间，钙离子信号发挥着重要作用。加入c a 2 + 螯合剂或者钙通道阻断剂几乎可以 完全阻断e a t p 对活性氧积累的诱导，细胞质中的c a 2 + 结合蛋白一钙调素的专一性抑制剂 w 7 和w 5 也可有效地阻断e a t p 诱导的活性氧积累。结合近年来的相关实验结果，s o n g 等 提出如图l 所示的e a t p 介导伤害刺激信号转导的可能机制，即外界伤害刺激引起e a t p 水平升高，e a t p 结合质膜受体，激活钙通道，引起细胞内c a 2 + 水平升高，通过钙调素激 活细胞膜上的n a d p h 氧化酶，促进r o s 信号的产生，再由r o s 调控下游与防御反应相 关的基因表达。信号转导完成后，胞外腺苷三磷酸双磷酸酶分解c a t p 使其恢复到正常 水平，a t p 分解产生的腺苷分子也可以通过抑$ | j r o s 的合成，切断信号传递，结束对生 理反应的影响( s o n g 等，2 0 0 6 ) 。 8 f o r e s i 等( 2 0 0 7 ) 报道0 0 5 0 1m ma t p 可以诱导植物细胞中n o 的产生，n o 的产生 量与a t p 浓度升高正相关的。n o 合成酶n o s 和硝酸还原觚的抑制剂都可以降低a t p 诱导的n o 的产生量，说明a t p 可能通过激活这两种酶促进n o 产生。动物细胞p 2 类嘌呤 受体抑制剂p p a d s 显著地抑制了a t p 对n o 生成的作用，说明这一过程是通过类似动物 细胞p 2 类嘌呤受体完成的。 w u 等( 2 0 0 8 ) 发现外加1 0 1 0 0i x m a t p 到丹参不定根培养基中可以引起快速的剂 量依赖型的h 2 0 2 产生以及培养基p h 的升高，这一过程都可以被动物细胞中的质膜嘌呤 受体抑制剂r b 和c a 2 + 螯合剂e g t a 有效抑制。他们也发现y e 诱导的a t p 的释放也依赖于 c a 2 + 的内流，这些结果表, , q c a 2 + 内流在e a t p 释放及其诱导h 2 0 2 产生及旷内流过程中的重 要作用，也暗示着质膜嘌呤受体类似物在e a t p 信号通路中的存在。 d e m i d c h i k 等( 待发表) 发现e a t p 可以增强拟南芥根细胞质j 摸n a d p h 氧化酶 a t r b o h c 的活性，促进r o s 的产生，r o s 再激活质膜上c a 2 + 通透性通道，从而使胞质自 $ c a 2 + 浓度升高。a t p 还可以诱导胁迫信号a t m p k 3 基因的表达，但a t p 在a t r b o hc 突变 体砌以中未能增加i a t m p k 3 基因的表达，表明a t m p k 3 基因的表达依赖a t r b o h c 的活性。 这些结果暗示了这样一条胁迫适应的信号通路：胁迫条件( 如伤害、渗透胁迫、触摸) 一a t p 释放n a d p h 氧化酶依赖的r o s 产生一钙通道打开_ 钙离子内流- - - * a t m p k 3 基因 表达_ 适应反应。 1 4 - 3 e a t p 与细胞内生理变化 2 0 0 4 年，j e t e r 等报道，伤害刺激、外源a t p 刺激以及渗透胁迫，都会导致细胞内 的m a p k 家族成员表达量的增加，这暗示m a p k 家族很可能是e a t p 信号转导过程中重要 的信号成分，e a t p 可能通过调节细胞内结构和功能蛋白的磷酸化调控细胞内的生理反 应。他们推测可能存在“伤害信号_ 细胞内a r p 分泌_ e a 皿含量增加一质膜钙通道开放 一细胞内钙信号产生_ m a p k 成员增加_ 细胞内蛋白磷酸化_ 细胞内生理反应 这样一 条信号转导途径。另外他们还发现e a t p 可刺激与胁迫相关基因的表达，如乙烯合成的 相关基因，据此他们推测乙烯的产生及其诱导细胞内与抗性有关的基因表达也可能是 e a t p 信号转导过程中的环节之一。 9 图le 蛆f 可能的信号转导过程( 引f l s o n g 等，2 0 0 6 ) 2 植物细胞中的异三聚体g 蛋白 异三聚体g 蛋白( g t p - b i n d i n g p r o t