CTC检测技术

外周血循环肿瘤细胞检测技术 ASCOAnnualReport 2015临床肿瘤学进展液体活检引领未来十年肿瘤治疗 液体活检样本之CTCs CTCs的概念 1896年Ashworth患者外周血中发现与原发肿瘤细胞体积和形态相似的细胞目前CTCs定义为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞在肿瘤转移灶形成前即可在外周血中检测到循环肿瘤细胞 AshworthTR AustMedJ 1869 14 146 147AllardWJ etal ClinCancerRes 2004 10 6897 6904 循环肿瘤细胞的特性 Wuetal ClinChemLabMed2013 10 1515Allard W J etal ClinCancerRes2004 10 6897 6904 循环肿瘤细胞的特性 Mego M Nat Rev Clin Oncol 2010 细胞表面抗原标志物表达差异携带不同的分子信息转移潜力差异 异质性 循环肿瘤细胞的特性 Bednarz Knoll etal CancerMetastasisRev 2012 31 673 687 CTCs可以是间质型 上皮型 上皮间质混合型 成团的CTCs CTM BreastCancer NEnglJMed351 781 791 2004ProstateCancer LancetOncol10 233 239 2009ColorectalCancer JClinOncol26 3213 3221 2008 CTC对于无进展生存期与总生存期的有效预测 CTCs检测的临床可行性 如何检测CTCs CTCs的富集 如何获取CTCs 每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞 而10mL血液中含有的白细胞约有1亿个 红细胞有500亿个 从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞CTCs的鉴定 如何鉴定所获细胞为CTCs 将恶性肿瘤细胞与红细胞 白细胞 正常上皮细胞 造血干细胞等区分开来 循环肿瘤细胞的检测 CTCs检测技术 HarouakaR KangZ ZhengSY etal PharmacolTher 2014Feb 141 2 209 21 CTCs的检测方法及代表技术产品 免疫捕获法 磁珠分选 原理 将特异性抗原包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠再与靶细胞上抗抗原结合成 靶细胞 抗原抗体 磁珠 复合物 在磁场作用下向一定方向移动 从而富集靶细胞 分选策略阳性富集 使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠 细胞与磁珠结合后直接在磁场中被分离出来 负性筛选 通过去除无关细胞使目的细胞得以纯化 阳性富集 CellsearchTM系统 CTC芯片 CTC chip MACS CellSeparation磁性细胞分选系统原理 采用抗EpCAM CD326 结合免疫磁珠捕获EpCAM阳性CTCs特点 捕获的CTCs纯度较高能够捕获到血液中上皮型 上皮间质混合型的CTCs无法捕获到间质型CTCs EpCAM阴性 magnet Anti EpCAMCoatedferrofluids 7 5ml Anti CK epithelialcells Anti CD45 WBCs DAPI viablecells Automatedfluorescencedetectionsystem 使用抗EpCAM抗体抗体包被磁微粒 使其与肿瘤细胞结合 在特定磁场作用下达到分离CTC的目的 阳性富集 CellsearchTM CellsearchTMCTCs鉴定 CTCs的判定 DAPI 细胞核 阳性 角蛋白CKs阳性 CD45阴性 Cellsearch在各癌种中的检出率 芯片的表层排布了78000个包被抗EpCAM抗体的微位点血液样本流经芯片时 抗体与肿瘤细胞结合粘附在芯片上 阳性富集 CTCs Chip 原理 联合上皮细胞标志及肿瘤特异性标志通过免疫磁珠分选特异性肿瘤的CTCs联合抗MUC1和EpCAM抗体检测乳腺癌和直肠癌通过RT PCR扩增肿瘤标志物来鉴定CTCs特点 较单一使用EpCAM抗体更特异不适用于EpCAM和CK阴性或弱化的CTCsPCR鉴定敏感性高 但易造成假阳性 阳性富集 AdnaTest检测系统 免疫捕获技术缺陷 一代技术 阴性富集 Cyttel Cytelligen检测系统原理 利用CD45磁珠抗体吸附白细胞 在磁场作用下去除白细胞 CTCs被富集沉淀特点 可检出EpCAM CK阴性的间质型CTCs样本处理步骤多 CTCs易丢失 阴性筛选法 Cyttel 步骤较多 CTCs容易丢失 鉴定不稳定 判定标准 DAPI阳性 CD45阴性 8号染色体扩增 特异性不足 基于细胞大小过滤 原理 根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离CTC代表技术 滤膜滤法分离上皮源肿瘤细胞 ISET 方法 将全血经过带小孔8 m的聚碳酸酯膜的过滤 即可除去白细胞富集得到CTCs 特点 细胞完整性好 可完全分离上皮型 间质型CTCs 可检出循环肿瘤拴子 局限 不宜检出细胞直径小于8 m的肿瘤如神经内分泌瘤 HepG2cellsstainedwithanti KL1 滤膜法 密度梯度离心 原理 根据肿瘤细胞与白细胞密度不同 通过梯度离心分离CTCsOncoQuick分离体系方法 密度梯度离心后 白细胞通过多孔滤膜被滤除 而CTCs被富集在介质层中 洗脱后得到CTCs 特点 可分离CK阳性和阴性细胞局限性 CTCs迁移可能至血浆层 红细胞层和粒细胞层而丢失 CTCs微栓子可能沉入红细胞层而丢失 与肿瘤细胞特性 离心时间和温度等有关 用血量多15 30ml 流式细胞术 原理 根据白细胞表达CD45抗原 CK阳性CTCs表达EpCAM 采用不同荧光素标记的抗CD45和抗EpCAM 通过流式细胞术分析和分选CK阳性细胞的CTC CD45 EpCAM 可在检测的同时进行细胞形态 DNA倍数分析敏感性较低 需要的血液样本量大缺乏规范的临床操作方法 常见CTCs一代检测技术的比较 临床实践亟需新技术实现CTCs分离 分型 分析 先分离后鉴定 采用上皮 间质标志物进行鉴定 不同表型的CTC均能检出 技术原理 CanPatrolTM CTCs高效捕获 数据更新至2015 01 同步实现CTCs鉴定与分型 CTCs精准分型深入评估复发转移风险 间质型CTCs转移能力比上皮型 混合型CTCs强CTM的转移成瘤能力是单个CTCs的20 50倍 CTCs的全面深入分析 CTCs的全面深入分析 CTCs全基因组测序 CanPatrolTM技术特点和创新 CanPatrolTM二代CTC检测技术 高效分离所有类型CTCs采用特制纳米滤膜 且不依赖于特定的上皮标志物 可高效 全面分离所有类型CTCs适用于绝大多数实体瘤采用国际公认8 m孔径滤膜法截留CTCs 适用于绝大多数实体瘤最大程度保留原始信息 物理法 过滤 使CTCs形态及分子信息保存完整 利于深入分析唯一实现分型分析的CTC检测技术 高灵敏度RNA ISH技术 结合上皮 间质两组特异性RNA探针 实现CTCs精准分型 CTCs检测技术小结 基于免疫捕获原理 如以EpCAM等抗体进行阳性筛选 的技术 富集获得的CTC纯度较高 但多项研究均发现该类方法很容易漏掉那些最具有侵袭潜能的肿瘤细胞 间质型CTCs及CTM 阴性筛选法鉴定不稳定 不能进行分型 同样会发生CTCs丢失 密度梯度离心法也会发生CTCs及CTM的丢失 研究证明ISET法对间质型CTCs及CTM的富集效果比免疫捕获法好 ISET法亦会丢失CTCs