（食品科学专业论文）降烟碱微生物的筛选及其初步应用.pdf

摘要 摘要 烟碱俗称尼古丁，占烟草生物碱总量的9 5 以上。长期吸烟会导致对烟碱的依赖性， 而过量吸入烟碱则会抑制中枢神经，麻痹心脏，甚至有致命的危险，在工业上利用微生 物及其酶来降解烟草中的烟碱，不仅对于维护人类健康有着深远的意义，而且可以改进 烟气品质，提高烟叶资源的利用率，有重大的经济效益。 本文以烟碱为唯一碳源，从土壤中筛选出一株具有高效降解烟碱能力的菌株z 7 ， 经生理生化鉴定和16 sr d n a 序列对比分析表明，菌株z 7 与放射形土壤杆菌 ( a g r o b a c t e r i u mr a d i o b a c t e r ) 和根癌土壤杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 均有9 9 的 同源性。经初步国际联机检索，国内外尚未报道此类微生物具有降解烟碱的能力。 烟碱培养基经优化后，菌株z 7 在摇床转速为2 2 0r m i n ，接种量5 ，初始p h7 0 ， 温度3 0 ，发酵2 4h 后，烟碱降解率达到8 6 2 。通过对菌株z 7 在各个反应体系中烟 碱降解能力的考察，确定了降解烟碱的酶为诱导酶，且不分泌到胞外。 由于菌株z 7 具有较高效的降解烟碱的能力，所以考虑利用它来降解烟丝中的烟碱 含量。经研究发现，在云南烤烟烟丝b 2 f 上喷洒1 0 的菌株z 7 ，于温度为3 0 、相对 湿度为7 5 的恒温恒湿箱中放置9 天，烟碱的降解率达到4 0 1 ；在同样的发酵条件下， 湖北白肋烟的烟碱含量下降了3 5 6 ，也有很好的效果，说明菌株z 7 具有普适性。且 云南烤烟烟丝b 2 f 经菌株z 7 发酵后，通过对其水溶性总糖、总氮、蛋白质的测定，发 现菌株z 7 不仅能降解烟丝中的烟碱，还能有效地提升烟支的抽吸品质，说明菌株z 7 具有较高的工业应用价值。 关键词：烟碱，降解，放射形土壤杆菌，根癌土壤杆菌，酶学性质 a b s t r a c t a b s t r a c t n i c o t i n e ，a st h em a i na l k a l o i d ，i su pt o9 5p e r c e n ti nt o b a c c o s m o k i n gf o ral o n gt i m e w i l lm a k eo n ea d d i c t i v et on i c o t i n e ，a n di n h a l i n gn i c o t i n ee x c e s s i v e l yw i l lp r e v e n tc e n t r a l n e u r o t r a n s m i t t e rf r o mt r a n s f e r r i n g ，b ep a r a l y t i ct oh e a r t , a n de v e nb ed e a t h f u l i n t e r e s t i n g l y , m i c r o b ea n di t sm e t a b o l i z e de n z y m ec a nd e g r a d en i c o t i n e ，w h i c hi sh e l p f u lf o rh u m a nh e a l t h ， i m p r o v et h eq u a l i t yo fs m o k ea n du t i l i t yo ft o b a c c ol e a v e sa n db r i n gal o to fe c o n o m i c b e n e f i t s a h i g hn i c o t i n ed e g r a d a t i o ns t r a i nz 7w a si s o l a t e df r o ms o i lb ys e l e c t i o nm e d i u mw i m n i c o t i n ea st h es o l ec a r b o ns o u r c e n l em o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d s e q u e n c e16 sr d n ao ft h es t r a i ns h o w e dt h a t i tw a sa g r o b a c t e r i u mr a d i o b a c t e ro r a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ，a n dt h e 16 sr d n ao ft h es t r a i na n dt h a to fa g r o b a c t e r i u m r a d i o b a c t e ro ra g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sw e r e9 9 h o m o g e n o u s i no p t i m a lm e d i u m ，t h ed e g r a d a t i o no fn i c o t i n ew a su pt o 8 6 2p e r c e n ta f t e rc u l t u r i n g 2 4 hi nr o t a r ys h a k e r ( 2 2 0 r m i n ) a t3 0 。c ，i n i t i a lp h7 0 ，5 i n o c u l u mc u l t u r e a n dw ef o u n d t h a tt h ee n z y m eo fd e g r a d i n gn i c o t i n eo fs t r a i nz 7w a se c t o e n z y m e ，a n di tw a si n d u c e d e n z y m e s t r a i nz 7h a st h eh i g ha b i l i t yo fd e g r a d i n gn i c o t i n e ，s ow et h o u g h ta b o u tu s i n gi tt o d e g r a d et h en i c o t i n ei nt o b a c c o w 曲t h e10 ( v w ) c e l la t3 0 c ，7 5 r e l a t i v eh u m i d i t yf o r9 d a y s t h ed e c r e a s i n gr a t eo fn i c o t i n eo ft o b a c c ow a s4 0 1 a tt h es a m ec o n d i t i o n ，n i c o t i n e c o n t e n to fb u r l e yt o b a c c od e g r e a s e d35 6 ，i ta l s oh a st h eh i g ha b i l i t yo fd e c r e a s i n gn i c o t i n e t h ea n a l y s i so fc h e m i c a li n g r e d i e n to ft o b a c c od e m o n s t r a t e dt h a tt h ec o n t e n to fp r o t e i n n i t r o g e n , t o t a ls u g a rw a so b v i o u s l yi n f l u e n c e db yt h i ss t r a i n t oa p p l yt h i ss t r a i nt ot o b a c c o f e r m e n t a t i o n , n o to n l yt h et i m eo ft o b a c c of e r m e n t a t i o nw a sc u td o w ng r e a t l y , b u ta l s ot h e i n t e m a lq u a l i t yo ft o b a c o ow a si m p r o v e dt oac e r t a i nd e g r e e k e y w o r d s ：n i c o t i n e ；d e g r a d e ；a g r o b a c t e r i u mr a d i o b a c t e r ；a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ； c h a r a c t c r i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对j t , j o f 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：日 期：3 、乡、f 厂 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： e l 期：和厶。吟 l ， 第一章绪论 第一章绪论 1 1 烟碱 烟碱是普通烟草中的生物碱，俗称尼古丁( n i c o t i n e ) ，化学名称1 甲基2 ( 3 吡啶 基) 一吡咯烷。 在烟草中，天然存在的只有l 型烟碱【2 1 ，合成的烟碱是d l 型消旋体【4 】。纯净的 烟碱基本是无色或微带黄色液体，有辛辣感。烟碱的沸点是2 4 7 c ，比重1 0 0 9 ( 2 0 ) ， 具有潮解性，6 0 c 以下能与水以任意比例互溶。烟碱与水蒸气一起挥发蒸馏，因而可以 用水蒸气蒸馏法从碱性溶液中蒸出烟碱【5 1 。 啶环，此环中的氮原子由于芳香化的结果，与芳胺的碱性相近，它的碱性很弱。而烟碱 分子中的另一氮杂环，属于吡咯环，此环中的氮原子还连接着一个甲基，其属叔胺，由 于此环没有芳香化，其碱性与脂肪族叔胺碱性相近。即烟碱中含有两个碱性相差很大的 碱性基团，不过与强无机碱相比，它们都是弱碱，在强碱作用下很容易被分离出来。烟 碱可和酸反应生成盐 6 1 ，如形成硫酸烟碱和硅钨酸盐等。 烟碱不仅易溶于水，还可以溶于许多有机溶剂，如四氯化碳、氯仿、乙醚、苯、煤 油、三氯乙烯和三氯乙烷等，都能很好地溶解烟碱。在阳光下易分解，颜色变深，并有 特殊的烟臭味l ，j 。 1 2 利用生物技术来降烟碱的必要性 烟碱是烟草生物碱中的主要成分，占烟草生物碱总量的9 5 以上。在烟草中，烟碱 大部分是以有机酸( 如柠檬酸和苹果酸盐) 的形式存在，也有少量的以自由状态存在。 烟碱进入人体内，9 0 被肺部吸收，进入血液后6 秒内即可到达大脑【8 】，烟碱对人体最 显著的作用是对交感神经产生影响，通常表现为短暂的兴奋，紧接着就是抑制。烟碱的 作用除了增加烟味和感到刺激外，主要还在于它所产生的生理强度，通常称为“劲头， 所以人类长期保持着吸食烟草的习惯。一般来讲，烟碱含量高的烟叶，烟气劲头大，反 之则小。因此，烟气中含有一定量的烟碱对吸烟者来说似乎是必需的，但烟碱的含量也 不能过高，否则不但会增加烟气的刺激性，而且会影响卷烟吸味。然而，长期吸烟会导 致对烟碱的依赖性，而过量吸入烟碱则会抑制中枢神经，麻痹心脏，甚至有致命的危险 【l 】；在吸烟过程中烟碱还会被亚硝化，生成烟草中特有的强烈的致癌剂亚硝胺( t s n a ) 【6 】；烟碱也是一种环境有害物质，烟气环境中就含有大量的烟碱，同时烟草加工过程也 会产生许多高浓度烟碱等生物碱的废物，这种废物被认为是“有毒的危险废物【9 1 。 目前认为烟气中的焦油和烟碱都是主要的有害成分，这就是为什么许多国家政府立 法强制规定香烟盒上必须标明焦油和烟碱含量以及警告消费者吸烟有害健康的宣传语 的缘故。因此有效地控制卷烟和环境中的烟碱的含量，对于维护人类健康有着很深远的 意义。 江南大学硕士学位论文 吸烟与健康是烟草行业在生存过程中面临的主要挑战之一，以关注公众健康、促进 和谐发展、维护消费者利益、实现可持续发展为宗旨，把握“高香气、低焦油、低危害 原则，开展降低卷烟烟气主要有害成分技术及综合降焦技术研究，在生物材料、生物技 术开发利用等新材料、新工艺、新技术方面取得突破，构筑降焦减害综合配套集成技术 平台，培育中式卷烟代表品牌，已成为我国烟草科技工作的主攻方向。尽管近年来我国 部分烟区的烟叶外观质量已接近国际水平，但就其内在质量而言还有一定差距，其中一 个较普遍且较突出的问题就是烟碱含量偏高。目前，我国烤烟烟碱含量偏高，尤其上部 烤烟更加明显，烟碱达到3 一4 ，白肋烟烟碱含量甚至高达6 t l o 】，而美国烤烟的烟 碱含量在1 5 - - 3 5 之间，其白肋烟的烟碱含量约为2 9 t n 】。一般优质白肋烟的烟碱 含量在1 5 - - 4 o 之间，以3 o 为佳。国内卷烟企业目前贮存的上部烤烟较多，因其 烟碱含量较高而难以较多用于叶组配方中，这个问题已引起有关方面的重视。如何降低 这些烟叶中的烟碱含量是各卷烟企业所面临的现实问题，而当前国内研究较多的是通过 过滤、打孔稀释及使用烟草薄片等物理措施降低烟碱含量，但是这些方法会造成烟香气 的损失。 因此，在工业上开展利用微生物处理来降解烟碱，这种方法不会造成烟香的损失， 还可以改进烟气品质，可以提高烟叶资源的利用率，有研究开发价值，而且，在未来的 很长一段时间内，它仍将是烟草行业的一个热门研究课题和研究方向。 1 3 微生物降解烟碱的研究进展 对于烟碱的降解研究已经有很多年了，早在1 9 4 8 年，f r a n k e n b u r g t l 2 】首先在s c i e n c e 上发表了他的重要研究成果，指出在雪茄烟叶的自然发酵过程中有相当数量的烟碱降解 了。他连续做了多年的试验研究【l 弛o j ，开创了烟碱生物降解的研究领域，得到许多生物 学家得重视和积极参与，至今仍有一批研究人员活跃在这个领域。现在已经分别从烟叶、 烟草种子以及土壤中分离到数种可代谢烟碱的微生物。 如表1 1 ，1 9 4 7 年，c e n d e r s 4 3 j 等进行酵母对烟碱的分解研究，发现酵母不能完全 降解烟碱。g i o v a i l n o z z l - 1 4 4 1 应用d e h a r y o m y c e sn i c o t i a n a e 和m i c r o c o c c u sn i c o t i a n a e 两种菌 种的培养液对烟草进行工业发酵处理的试验结果表明，这两种菌液除了能够改善烟草的 风味和香气外，还分别使烟草的烟碱含量降低了o 4 5 和0 8 3 个百分点，而用以上两种 菌液混合处理过的烟草烟碱含量则降低了0 6 1 个百分点。1 9 5 2 年，w gf r a n k e n b u r g 等【4 副通过改进烟叶的发酵处理过程，不仅降解了5 0 旷2 0 的烟碱，而且加速了烟叶的其 它氧化反应，改善了烟草的吸味质量；1 9 5 8 年，他们【19 】还对雪茄烟叶晾制过程中烟碱的 降解进行了研究，发现烟碱主要是在晾制的初始阶段被降解。同年，w a d ae 等【删将从 土壤中分离出来的假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 第4 1 小种对烟碱溶液进行了2 4h 处理，结 果烟碱含量大幅度降低，溶液的p h 值也由6 4 降至4 6 ，但由于p h 值的降低和菌落数 的增大，烟碱的分解停止，约有3 5 的烟碱未发生降解。 第一章绪论 表1 1 从土壤和陈化烟叶中分离鉴定的能够有效降解烟碱得微生物 t a b 1 - 1m i c r 0 0 r g a n i s mi s o l a t e da n di d e n ti f l e df o rd e g r a d i n gn i c o ti n ef r o ms o lla n d a g i n gt o b a c c o 菌种来源 发表时间报告者 假单胞杆菌 p s e u d o m o n a ss p n o 41 p c o n v e x a p p u t i d a 节杆菌 a r t h r o b a c t e ro x i d a n s a o x i d a n sp - 3 4 ( d s m 4 19 ) a o x i d a n sp a 0 1 a g l o b i f o r m i l s 纤维单胞菌 c e l l u l o m o n a ss p 争论产碱菌 土壤 土壤 雪茄烟 土壤 土壤 土壤 烟叶 雪茄烟 1 9 5 4 1 9 7 8 1 9 7 7 1 9 5 5 1 9 5 8 1 9 6 5 1 9 7 6 1 9 7 7 w a d a l 2 1 ，2 2 】 t h a e k e l s 2 3 】 g e i s s ，n e w t o n l 2 4 乃i s g u r o s l 2 6 1 h o c h e s t e i n ， f r e u d e n b e r g t 2 6 ，2 7 2 9 1 d e c k e r ，b r a n d s c h ， k o d a l n a 【3 0 扎琊3 】 u c h i d a ，k o l e n b r a n d e r l 3 4 , 3 5 g e i s s t 5 7 】 a l c a l i g e n e sp a r a d o x u s 烟叶 19 7 6u c h i d a l m l 阴沟肠杆菌 e n t e r o b a c t e rc l o a c a ee 1 5 0 烟叶 1 9 8 3g u t i e r r e z l 3 7 】 微球菌 m i c r o c o c c u sn i c o t i a n a e 雪茄烟 1 9 4 7g i o v a n n o z z i 3 8 】 其它细菌 d e h a r y o m y c e sn i c o t i a n a e雪茄烟 19 4 7g i o v a n n o z z i 3 s 】 n i c o t i a n a ep l u m b a g i n i f o l i a 烟草 2 0 01f r a n c o i s 【3 9 】 a c h r o m o b a c t e rn i c o t i n o p h a g u m 土壤 1 9 5 9 h y l i n 4 0 1 真菌 c u n n i n g h a m e l l ae c h i n u l a t a 烟叶 1 9 9 5e b e r h a r d t 【4 1 1 p e l l i c u l a r i a f i l a m e n t o s a 烟叶 1 9 9 5e b e r h a r d t 【4 l 】 m i c r o s p o r u mg y p s e u m 土壤 19 7 9s i n d e l a r t 4 2 】 s e p e d o n i u mc h y r o s p e r u m 土壤 19 8 3u c h i d a t 2 8 】 s t r e p t o m y c e sg r i s e u s 土壤 19 8 3u c h i d a 【2 叼 s p l a t e n s e s - 十壤 19 8 3u e h i d a | 2 3 j 最近二、三十年，有关微生物降解烟碱方面的研究也较多。1 9 7 8 年，b r o w n & w i l l i a m s o n 烟草公司【4 7 】就开展了利用纤维单胞菌来降低烟草中烟碱和硝酸盐含量的研 究。1 9 8 1 年，日本m a e d a 等h 8 1 研究了利用来源于烟叶表面的细菌来降解烟碱n 氧化物。 u c h i d a 等人阱】还利用0 2 烟碱作为唯一碳源的培养基，从烟田土壤和烟叶表面上分离 一 出能够降解烟碱的细菌，经过鉴定，这些细菌为争论产碱菌0 f c n z f i 妒玎p s p 甜口d 缸螂) 和球 形节杆菌( a r t h r o b a c t e rg l o b i f o r m i l s ) ，若培养基中有葡萄糖存在，它们会具有高降解烟碱 活性，但在烟碱浓度为0 5 条件下该菌的生长会受到抑制；把争论产碱菌喷洒到潮湿的 3 江南大学硕十学位论文 烟叶上后，5d 内没有产生明显的降解，但若同时在培养基中加入葡萄糖，则在2d 之内 就会产生明显的降烟碱效果；1 9 8 3 年，r u i zg u t i e r r e 等【3 7 】从干烟叶表面分离出一种能够 降解烟碱的菌株，经鉴定为阴沟肠杆菌( e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ) e 1 5 0 。在含有烟碱( 小于5 g l ) 的培养基中( 3 4 ，p h 7 条件下) 进行发酵的过程中，该菌降解烟碱的能力得到诱导。 另外，这种细菌还能代谢烟酸，但不能降解去甲基烟碱和新烟碱。1 9 9 6 年，t a s h i r o 等1 4 9 从4 4 个含有烟碱的土壤和废水中获得5 7 种细菌，这些菌都呈短棒状，用烟碱作为唯一 碳氮源，在两周内能降解浓度为1 0 1 0 。3 e m l 的烟碱。2 0 0 1 年，f r a n c o i s 等【3 9 】在n i c o t i a n a p l u m b a g i n i f o l i a 细胞悬浮培养液中加入等量( r ) - 烟碱和( s ) 烟碱，通过g c 和h p l c 分析 发现前者比后者降解更迅速。2 0 0 2 年，d e b o r a h a r a t h b o n e 等【5 0 】对烟碱微生物代谢进行 了研究，发现了一些新化合物和中间产物，可以用作新药的合成或药物的改进。2 0 0 1 年，王革等【5 1 】从烟叶上分离获得了3 株降解烟碱和蛋白质能力较强的菌株。 1 4 微生物降解烟碱的机制 降解烟碱的微生物大多能以烟碱为唯一碳、氮源进行生长，他们主要通过四种不同 的途径代谢烟碱。 第一种为节杆菌属细菌中存在的吡啶途径( p y r i d i n e p a t h w a y ) 该途径从烟碱吡啶环的6 位羟基化开始，然后吡咯环被氧化脱氢并自发水解打开， 接着吡啶环通过羟基化被打开。( 图1 1 ) h o c h s t e i n 和r i t t e n b e r g 5 2 , 5 3 j 研究了菌种p 3 4 转化烟碱的情况，发现先生成6 羟基 烟碱( 6 o h n ) ，进一步通过吡咯环脱氢形成6 羟基- n 甲基麦斯明 ( 6 - h y d r o x y - n - m e t h y l m y o s m i n e ) 。1m o l 烟碱转化成6 羟基烟碱需要0 5m o l 氧，可是， 产物中包括l m o l 氧，这表明氧来源于水而非分子氧瞰】。 m a e d a 等1 5 5 j 报告另一种细菌j t s 0 0 0 6 代谢烟碱的方式与菌种p 3 4 类似，在培养基 中先后生成6 羟基烟碱、6 羟基- n 甲基麦斯明和6 羟基假氧化烟碱 ( 6 - h y d r o x y p s e u d o o x y n i c o t i n e ) 。 h o c h s t e i n 和d a l t o n i s 6 1 分离的氧化节杆菌( a r t h r o b a c t e ro x i d a n s ) 能将水分子中的氧 结合到烟碱中生成6 羟基烟碱。这是水和功能的氧化酶起的作用。6 羟基假氧化烟碱已 经在6 羟基烟碱被进一步氧化之后分离得到【5 引。6 羟基假氧化烟碱进一步氧化后生成2 ， 6 - - - 羟基假氧化烟碱( 2 ，6 - d i h y d r o x y p s e u d o o x y n i c o t i n e ) 5 7 , 5 9 j 。2 ，6 二羟基假氧化烟碱 转化成2 ，6 - - - 羟基吡啶( 2 ，6 - d h p ) 和丫- 甲氨基丁酸( y m e t h y l a m i n o b u t y r i c ) 1 2 7 。一 个单一酶催化2 ，6 二羟基吡啶生成2 ，3 ，6 三羟基吡啶【5 9 1 。在氧存在和没有催化酶的 情况下，这个三羟基吡啶迅速自动氧化形成蓝色素。在氧化节杆菌粗酶存在下，蓝色素 不能形成而2 ，3 ，6 三羟基吡啶呗裂解酶转化成琥珀酸【6 0 l 。2 ，6 二羟基吡啶生成琥珀 酸至少需要两个酶，即氧化酶和裂解芳香环的酶( 图1 1 ) 。 2 ，6 二羟基假氧化烟碱作为6 羟基假氧化烟碱的不稳定的中间产物，在缺少适当酶 组分情况下形成2 ，6 - z 羟基- n 甲基麦斯明( 2 ，6 - d i h y d r o x y - n m e t h y l m y o s m i n e ) 1 5 7 , 5 羽。 2 ，6 - 二羟基- n - 甲基麦斯明不再进一步代谢，它好像是烟碱降解过程中由于不完全的酶 系而产生的新陈代谢人造品n t s 7 , s s l 。 4 第一章绪论 w a d a 6 1 , 6 2 1 发现假单胞菌既能代谢烟碱也能代谢降烟碱( n o r n i c o t i n e ) 。降烟碱与烟碱 的区别在于l 位上的结构不同( 降烟碱为h ，烟碱为c h 3 ) 。在降烟碱的降解途径中， 从培养基中已经鉴定出6 羟基麦斯明( 6 h y d r o x y m y o s m i n e ) 和6 一羟基3 琥珀酰吡 ( 6 h y d r o x y - 3 s u c e i n o y l p y r i d i n e ) 。6 羟基麦斯明的形成表明假单胞菌的代谢途径包含了 芳香环的羟基化作用优先于生成假氧化烟碱。这也说明同一种细菌以不同的途径来降解 烟碱。 嗍盟朋 6 羟纛飙 _ 耪纂一n 一中墓壹斯碉 l 毫确 i 舻= 眷 昝：鼍篓幔鼬：羟劓浪 桷嬲 黧 9 嘈 l 鼻二羟蔫峨嚷 l 碍来囊董芑蠢 t 翻柚 图1 - 1a t h r o b a c t o ro x y d a n s 降解烟碱的途径【2 7 】 f i g 1 1p r o p o s e dp a t h w a yf o rt h em e t a b o li s m o fn i c o t i n eb ya t h r o b a c t o ro x y d a n s n d h ，烟碱脱氢酶；6 h n o ，6 一羟基烟碱氧化酶； k d h ，酮脱氢酶；2 ，6 一二羟基- 3 - 羟基化酶 第二种为以假单胞菌属细菌为代表的吡咯途径( p y r r o l i d i n e p a t h w a y ) 该途径从烟碱的吡咯烷被脱氢而打开开始，然后通过羟基化打开毗啶环( 图l - - 2 ) ； 舭艘稳0 一 c 江南大学硕十学位论文 钾一一唧 烟藏 n 甲基麦耘明 假氧化烟城 一一秽 6 - 羟差3 玻璃崴毗嚏3 琥珀酰毗睫 2 孓= 羟基毗啶 图卜2p s e u d o m o n a sp u ti d a 降解烟碱途径【5 5 ，6 3 】 f i g 1 2p r o p o s e dp a t h w a yf o r t h em e t a b o li s mo fn i c o ti n eb yp s c u d o m o n a ss p a n dj t s 一0 0 6 有几种微生物通过首先修饰吡咯环来转化烟碱( 图1 2 ) 。g h e m a 和r i t t e n b e r 9 1 6 3 , 6 4 1 报道假单胞菌能够氧化烟碱、n 甲基麦斯明、假氧化烟碱、3 一琥珀酰6 羟基吡啶。假单 胞菌细胞适应烟碱也同时适合2 ，5 - - - 羟基吡啶( 2 ，5 - d i h y d r o x y p y r i d i n e ) 的氧化【6 5 , 6 6 】。 因此，作者提出在3 琥珀酰6 羟基吡啶的3 位裂解生成2 ，5 二羟基吡啶和琥珀酸。 w a d a 和y a m a s a k i 2 1 用从土壤中分离的细菌转化烟碱形成不同的产物如n 甲基麦 斯明、假氧化烟碱和3 琥珀酰吡啶被鉴定。假单胞菌转化烟碱和降烟碱都是首先进攻吡 咯环开始，其中间产物假氧化烟碱、3 琥珀酰吡啶及6 羟基3 琥珀酰吡啶是相同的。 菌种j t s 0 0 0 6 能够利用烟碱- n 氧化物作为唯一的碳氮源【5 5 1 。在生长细胞的培养基 中鉴定的中间产物有假氧化烟碱和3 琥珀酰吡啶。这些代谢产物表明菌种j t s 0 0 0 6 转 化烟碱- n 氧化物途径与假单胞菌转化烟碱的途径类似。 第三种途径为第一种和第二种的混合途径，这表现在a c h r o m o b a c t e rn i c o t i n o p h a g u m 降解烟碱的过程中。 a n i c o t i n o p h a g u m 以两种不同的途径降解烟碱【4 0 】。在对数生长期，烟碱被代谢成 6 一羟基烟碱，然后进一步生成脂肪族物质。当细胞停止分裂，烟碱代谢为脂肪族物质 被抑制而改变代谢途径，通过假氧化烟碱和3 一琥珀酰吡啶路径生成6 一羟基一3 一琥珀 酰吡啶。6 一羟基一3 一琥珀酰吡啶不再进一步转化( 图1 1 ) 。 第四种途径为存在于真菌中的脱甲基化途径( m ep a t h w a y ) 1 2 8 , 4 2 】 该途径从烟碱的吡咯烷脱甲基生成降烟碱( n o m i c o t i n e ) 开始，微生物沿这些途径 将烟碱转化为羧酸和氨基酸，为细胞的生物合成提供碳氮源和能源，因而它们具有降低 烟草中烟碱含量和处理卷烟加工产生的有毒废弃物。 1 5 微生物及其酶在烟草加工中的应用 可代谢烟碱的微生物具有降低烟草中烟碱含量的潜能，尤其针对烟碱含量较高的烟 叶，同时经微生物处理还可增加香气，降低刺激，提高吸烟的安全性删。据专利文献报 6 第一章绪论 道【3 6 , 6 7 1 将c e l l u l o m o n a ss p 和p s e u d o m o n a s p u t i d a 采用营养培养基、含硝酸盐的培养基、 含烟碱和硝酸盐的培养基来培养，然后用这些培养物或细胞在好氧条件下处理已经烘烤 过的白肋烟，采用高温浸提烟叶的水提物来培养细胞，烟草提取液中烟碱降解后，再经 过浓缩回加到已经风干的原烟叶上，这些处理方式可以降低烟草中的硝酸盐和烟碱含 量，而不损失烟草的香气和吃味，同时产生柔和的香气，降低了烟气中一氧化碳、氰化 氢和烟碱的含量，达到了理想的效果。 b r o w n & w i l l i a m s o n 烟草公司瞄j 利用假单胞杆菌( p s e u d o m o n a sp u t i d ) 对烟草中的 烟碱进行降解，发现用假单胞杆菌液对白肋烟和烤烟的混合烟丝( 1 ：1 ) 进行1 8 h 处理 后，烟碱含量平均从2 0 0 降到了0 8 5 ，通过烟气分析发现，每支卷烟的烟碱含量从 1 5 8m g 降到了0 9 8m g 。同时，该公司【6 8 】还筛选出纤维单胞菌和假单胞茵两种细菌，他 们将菌体首先进行琼脂斜面培养，接着在烟草一烟碱液体培养基中生长，在3 0 、2 2 0 r m i n 条件下培养2 4 4 8h ，以达到最佳生长状态。然后用菌液处理去梗的烟叶，保持 含水率6 8 一7 0 ，处理完后再将烟叶干燥到1 4 5 ，经此处理后，烟叶的烟碱含量从 3 5 降至1 6 5 。 b r o w n & w i l l i a m s o n 烟草公司【4 7 j 利用纤维单胞菌来降低烟草中的烟碱和硝酸盐含 量。方法是在微生物培养过程中，在培养基成分中加入一定量的烟碱或白肋烟的提取液 和硝酸盐，对纤维单胞菌属的降烟碱和硝酸盐的能力进行诱导，得到最大降解活性。然 后将接种的细菌培养液在3 0 厌氧条件下对白肋烟叶片进行2 4 h 处理，发现硝酸盐和烟 碱的含量分别从3 5 4 和1 4 2 降至0 2 2 和0 3 2 ，在此过程中，水分保持在7 5 左 右。最后，将经过处理的白肋烟和其它烟叶混合，与未经处理的自肋烟叶片相比，混合 烟丝的硝酸盐含量从1 6 3 降至1 0 4 ，烟碱从1 7 9 降至1 3 2 。将这些经过处理的 混合烟丝制成卷烟后，烟气分析标明，硝酸盐、氰化氢和烟碱各降低了3 8 8 、1 9 7 和1 5 3 。 2 0 世纪7 0 年代末，随着人们对吸烟安全性的重视，国外烟草商开始系统研究造纸 法薄片工艺技术，并在2 0 世纪8 0 年代进行了大范围的推广应用，将其作为降低卷烟产 品焦油量的一个有效手段。其发展经历了辊压法一稠浆法一造纸法3 个过程。美国菲利 普一莫里斯公司的s p a n n 等眇】对烟草薄片的酶处理进行过研究，他们将烟梗含量约为 5 0 的烟末制成固形物含量为1 2 一1 8 的稠浆，加入0 0 7 5 - - 0 7 5 ( 按干烟末重 量计) 的纤维素酶，用乙酸或柠檬酸调p h 值至4 5 ( 酶活性最高) ，于室温下放置过夜 发酵，然后按稠浆法制成烟草薄片。化学分析标明，此中薄片的水溶性物质、总还原性 物质和还原糖的含量均高于原来的烟草原料，草酸铵可溶物、氯化钠和纤维素的量均较 低，总灰份、苯一乙醇可溶物和半纤维素的含量不变。评吸结果标明，用少量酶、甘油 和乙酸处理的烟草薄片的身份最厚、刺激性较小、甜味较重，但缺乏“万宝路 卷烟重 的生物碱劲头。b r o w n & w i l l i a m s o n 公司1 3 6 j 选择微生物e r w i n i a c a r o t o v o r a 降解烟梗中 的果胶，目的是为了替代某些机械加工步骤来降低薄片制备过程中的烟末粒度。处理是 将烟梗末悬浮于此微生物的营养液中，浓度为1 0 ( w ) 。最佳操作条件为：温度2 8 - - 3 0 ，p h6 5 7 0 ，通风以便有足够的溶解氧使微生物繁殖生长。耐受烟碱量可高达 7 江南大学硕士学位论文 0 6m g m l ，微生物的菌落数一般为1 0 1 1 0 9 c f u m l 。与传统法生产的烟草薄片相比， 由微生物消化的烟梗制备的烟草薄片p h 略高，糖和硝酸盐的量降低，感观评价略优。 烟草加工过程中常会产生许多固态或液态废物，这些废物一般不能再被回收利用， 它们主要含有大量的烟碱等生物碱类有毒物质，不利于保护环境，平均含量达1 80 0 0 m g k g 干重，尤其在生产一些烟碱含量较低的卷烟产品时废弃物中烟碱含量特别高。当 烟碱含量高于5 0 0m g k g 干中，欧盟法律规定把他们划为“有毒的危险废物 ，这些废物 如不及时处理会给人们的生存和生活带来极大的危害。1 9 9 7 年，c i v i l i n i 等【4 】报道采用 微生物的方法来处理这种废物，先用热水浸洗装在柱子中的烟草固形废物，使其中烟碱 含量达到标准，然后采用嗜烟碱微生物p p u t i d a 、a o x i d a n sp a 0 1 和a o x i d a n s q2 处 理固形废物的渗洗液，结果表明尸p u t i d a 有较好的处理废液的能力，采用嗜烟碱微生物 来处理这种废物或废水有很好的应用前景。1 9 9 4 年，m e t e r 等【7 0 】用一种微生物对这些废 料进行连续1 5d 处理，结果降解其中大部分的烟碱和其他有害物质。2 0 0 2 年，s p o n z a 等 p l 7 2 j 研究了烟碱对烟草工业废水生物处理过程中细菌活性的抑制作用。 1 6 课题研究意义和内容 1 6 1 本课题研究意义 现在，大家都知道烟碱对人的健康是有害的，烟碱主要是通过吸烟被摄入体内的。 吸烟能够广泛流行主要原因是烟碱对于人的神经系统的刺激。但是不能因为烟碱所带来 的刺激，而忽视了它对人体的破坏作用，烟碱刺激并阻止那些产生冲动和抑郁的神经节 细胞，并且间接地破坏人体的各个器官，如心脏，肾上腺组织等。目前的现状是，虽然 每盒香烟的外包装上都标上了“吸烟有害健康”的字样，但是全世界人就约有1 0 亿的 烟民。 既然我们不能劝说所有的人戒烟，那么有什么办法能够在减少香烟中烟碱的含量的 同时给予吸烟者一种在相对高的烟碱含量的香烟中所获得的相同的感觉呢? 于是我们 提出了利用现代生物手段来降解烟草中所含有的烟碱，也就是利用微生物来降解烟碱， 从而达到这一目的。 1 6 2 本课题研究内容 1 ) 筛选一株具有降烟碱能力的细菌； 2 ) 研究菌株的生长和降烟碱特性( 生长曲线、培养基组分、温度、p h 值、接种量、 摇床转速) ： 3 ) 研究所筛选的菌种对烟丝的降烟碱效果。 8 第二章降烟碱微生物的分离及鉴定 第二章降烟碱微生物的分离及鉴定 2 1 引言 目前发现在烟株、土壤和陈化烟叶中存在的能够降解烟碱的微生物主要有假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sp u t i d ) 、纤维单胞菌( c e l l u l o m o n a ss p ) 、烟草节杆菌( a r t h r o b a c t e r n i c o t i a n a e ) 、球形节杆菌( a r t h r o b a c t e rg l o b r m i l s ) 、嗜烟碱节杆菌( a r t h r o b a c t e r n i c o t i n o v o r a n s ) 、氧化节杆菌( a r t h r o b a c t e ro x y d a n s ) 、争论产碱菌( a l c a l i g e n e s p a r a d o x u s ) 以及n i c o t i a n a p l u m b a g i n i f o l i a 等菌种。其中嗜烟碱节杆菌( a r t h r o b a c t e rn i c o t i n o v o r a n s ) 和假单胞菌( p s e u d o m o n a s p u l i d ) 是较优良的能够降解烟碱的菌株【冽。 由于降解的微生物不同，烟碱的降解产物也不同。f r a n k e n b u r gw g 等用3 种烟籽 表面的微生物降解烟碱的研究均表明，烟碱降解生成了甲酰胺、氨、草酸以及微量的丙 二酸和琥珀酸。c a s i d at e jr 等从烟叶中分离出可将烟碱氧化成y 一氨基丁酸的细菌， 他们认为，这种菌先作用于烟碱的吡啶环，获得谷氨酸，然后使其脱羧。o i o v a n n o z z i 从 烟叶仓库中分离出一种烟草节细菌，该茵可在烟碱一琼脂上大量繁殖并使烟碱降解，其 降解产物为黄色，随后又变成类似葡萄酒的红色。 本章试图从土壤中筛选能够降解烟碱的菌株并对菌株进行鉴定。 2 2 材料和方法 2 2 1 材料 土壤取自芜湖卷烟厂废弃物堆放处、湖南张家界烟草种植地。 2 2 2 试剂 牛肉膏生化试剂中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 蛋白胨生化试剂中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 n a c l 分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 n i c o t i n e 9 8 洛阳天科生物工程有限公司 y e a s te x t r a c t 生化试剂中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 k e h p 0 4 3 h 2 0分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 ( n h 4 ) 2 8 0 4分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 k h 2 p 0 4 化学纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 m g s 0 4 7 h 2 0 分析纯中国上海兴塔美兴化工厂 m n s 0 4 4 i - 1 2 0 化学纯中国上海兴塔美兴化工厂 c a c l 2 2 h 2 0 分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 f e s 0 4 7 h 2 0化学纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 2 2 3 主要仪器和设备 仪器名称型号 生产厂家 超净工作台s w - c j - 1 f d 苏州安泰空气技术有限公司 p h 计 3 2 0 - s m e t l l e r - t o l e d o 公司 9 江南大学硕十学位论文 移液枪 电子天平 e l 一2 0 4 回转式恒温调速摇床h y g i i 紫外分光光度计 u v - 2 1 0 0 2 2 4 培养基 e p p e n d o r f 公司 m e t l l e r - t o l e d o 公司 上海新星自动化控制设备成套厂 u n i c o 公司 2 2 4 1 烟碱培养基 1 3 3g k 。