（微生物学专业论文）苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种菌株ybt1765的质粒研究.pdf

摘要 苏云金芽胞杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) 菌株y b t - 1 7 6 5 是从粮食仓库中分离年导到 的一株拟步行甲亚种( s u b s p t e n e b r i o n i s ，h 8 a b ) 菌株。该菌株至少含有三个内生质粒， 本文对其可检测到的最大质粒p b m b l 6 5 的复制区和最小质粒p b m b l 7 5 的研究结果 如下： 1 质粒p b m b l 6 5 复制子的研究 克隆并分析了包含质粒p b m b l 6 5 复制子的一个2 0 k b 的d n a 片段( g e n b a n k 登 录号为：d q 2 4 2 5 1 7 ) 。通过缺失实验，将质粒p b m b l 6 5 的复制子缩短到一个3 ，6 k b 的片段上。同时证明，质粒编码的复制蛋白r e p l 6 5 和两个顺式作用因子( 复制起点 o r i l 6 5 和重复子i t e r o n s 区域) 为质粒复制必需因子。还发现了两个重叠的开放阅读 框：o r f 6 和o r f l 0 ，能参与控制质粒稳定性，为质粒稳定遗传必需因子。这是首例 报道的来源于拟步行甲亚种质粒复制子。 通过序列分析，质粒p b m b l 6 5 复制子与0 复制p a m l 3 1 家族质粒的复制子具有 同源性，该质粒也应属于p a m l 3 1 质粒家族。此外，芽胞杆菌群中p a m l 3 1 家族质粒 ( p b m b l 6 5 ，p b t 9 7 2 7 ，p a w 6 3 和p x 0 2 ) 复制区之间还表现出结构组成的相似性，但 是与其它细菌中的p a m p i 家族质粒复制子的结构组成不同，表现出该家族质粒复制 子的遗传可变性。 另一方面，在质粒p b m b l 6 5 复制子相邻区域含有五个可能的转座因子。其中， i s 2 3 1 u 为一种新的i s 2 3 1 类插入序列；根据序列的相似性，i s b t h l 6 5 、i s b t h l 6 6 和 i s 研 1 6 7 分别属于i s 5 、i s i i o 和i s 3 家族转座因子；t n 日 扭1 6 5 是一个不完整的i i 型转座子。这些转座因子的存在，可能引起遗传物质的交换和重组，从而导致质粒 或质粒复制子的进化，为研究p a m l 3 1 质粒家族质粒及其复制子的进化提供了有用的 遗传信息。 2 菌株y b t - 1 7 6 5 消除质粒突变株的筛选 将出发菌株y b t - 1 7 6 5 采用逐级升温培养以及十二烷基磺酸钠( s d s ) 处理的方 法，筛选得到两株质粒部分消除突变株，其中，突变株b m b l 9 3 消除了y b t - 1 7 6 5 中可检测的最大质粒p b m b l 6 5 ；突变株b m b l 7 5 则只含有出发菌株中的最小质粒 p b m b l 7 5 。 3 质粒p b m b l 7 5 的克隆和分析 克隆得到菌株y b t - 1 7 6 5 中大小为1 4 ，8 4 1 b p 的最小质粒p b m b l 7 5 ( g e n b a n k 登 录号为：d q 3 6 4 0 6 1 ) 。序列分析表明，p a m b l 7 5 含有1 8 个o r f s ( 大于7 0 个氨基 酸) 。其中，8 个o r f s ( 编码假定蛋白) 与苏云金亚种( s u b s p t h u r i n g i e n s i s ) 滚环复制质 粒p g l 3 的o r f s 有不同程度的网源性。 通过缺失分析，将质粒p b m b l 7 5 复制子定位在l ，1 5 1 b p 的肋口i c 协i 片段上， 该复制子只含有一个完整的o r f ( o r f 7 ) ，且为复制所必需。数据库搜索表明，o r f 7 的编码产物与任何已知蛋白没有显著的序列相似性，从而推测，o r f 7 可能编码一 种新的复制蛋白。通过核苷酸序列二级结构分析，预测了p b m b l 7 5 可能的双链复 制起点( 凼d ) 区域，该质粒可能的d s o 区与其它滚环复制质粒的d s o 区没有同源关系。 因此，p b m b l 7 5 可能属于一类新的质粒家族。 关键词：苏云金芽胞杆菌；拟步行甲亚种；质粒；复制子；质粒消除突变株 i i a b s t r a c t 丑t h u r i n g i e n s i ss u b s p t e n e b r i o n i sy b t - i7 6 5 ( h s 曲1w a si s o l a t e df r o maw a r e h o u s e t h i ss t r a i nh a r b o r e dt h r e ei n d i g e n o u sp l a s m i d s i nt h i ss t u d y , t h er e p l i c o no ft h el a r g e s t d e t e c t e dp l a s m i dp b m b l 6 5a n dt h es m a l l e s tp l a s m i dp b m b l 7 5o f s t r a i ny b t - 1 7 6 5w e r e c h a r a c t e r i z e d t h er e s e a r c hr e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w i n g ： 1 c h a r a c t e r i z a t i o no fp b m b l 6 5r e p l i c o n a2 0 k bd n af r a g m e n tc o n t a i n i n gp l a s m i dp b m b l 6 5r e p l i c o nw a si s o l a t e df r o m b a c i l l u st h u r i n g i e n s i ss u b s p t e n e b r i o n i sy b t - 1 7 6 5a n dc h a r a c t e r i z e d d e l e t i o na n a l y s i s r e v e a l e dt h a tar e p l i c a t i o ni n i t i a t i o np r o t e i n ( r e p l 6 5 ) ，a l lo r i g i no fr e p l i c a t i o n ( o r i l 6 5 ) a n da ni t e r o nr e g i o nw e r er e q u i r e df o rr e p l i c a t i o n i na d d i t i o n ，t w oo v e r l a p p i n go r f s ( o r f 6a n do r f l 0 ) w e r ef o u n dt ob ek e ye l e m e n t sf o rt h es t a b i l i t yc o n t r o lo fp l a s m i d r e p l i c a t i o n a sf a ra sw ek n o w , t h er e p l i c o no f t h ep l a s m i dp b m b l 6 5i st h ef i r s ti n s t a n c e o f a p l a s m i dr e p l i c o nb e i n gi s o l a t e df r o ms u b s p 耙珂e 6 r f d 丹捃a n dc h a r a c t e r i z e d s e q u e n c ec o m p a r i s o ns h o w e dt h a tt h er e p l i c o n o fp b m b l 6 5w a sh o m o l o g o u st o r e p l i c o n so f t h ep a m 3 1f a m i l y , i n d i c a t i n gt h a tp b m b l 6 5r e p l i e o nb e l o n g st ot h i sf a m i l y f u r t h e r m o r e ，t h ep a m b if a m i l yr e p l i c o r t st h a th a v es of a rb e e ni d e n t i f i e df r o mt h eb e e ，e g $ g r o u p ( p b m b l 6 5 ，p b t 9 7 2 7 ，p x 0 2a n dp a w 6 3 ) h a v eb e e ns h o w nt os h a r et h e s a m eo r g a n i z a t i o n ；h o w e v e r , t h i so r g a n i z a t i o ns c h e m ei sd i s t i n c t l yd i f f e r e n tf r o mt h eo n e f o u n di nt h ep a m b if a m i l yr e p l i c e n st h a ta r eo fo t h e ro r i g i n i tw a ss u g g e s t e dt h a t g e n e t i cv a r i a b i l i t yi sp r e s e n ta m o n gt h ep a m b if a m i l yr e p l i c o n s t h e r ew e r ef i v et r a n s p o s a b l ee l e m e n t so rr e m n a n t st h e r e o fi nc l o s ep r o x i m i t yt oa n d w i t h i nt h er e p l i c o nc o n t r o lr e g i o n a ni s 2 3 1 一l i k ee l e m e n tw a si d e n t i f i e da n dn a m e d i s 2 3 1 u ；i s b t h l 6 5 ，i s b t h l 6 6a n di s b t h l 6 7 w e r et e n t a t i v e l yc l a s s i f i e da sb e l o n g i n gt ot h e i s 5 ，i s l l 0a n di s 3f a m i l yo ft r a n s p o s a b l ee l e m e n t s ，r e s p e c t i v e l y , o nt h e b a s i so ft h e i r s e q u e n c es i m i l a r i t i e s ；t n b m b l 6 5w a sar e m n a n tc l a s si ii x a n s p o s o n ，t h ep r e s e n c eo f t h e s el x a n s p o s a b l ee l e m e n t so rr e m n a n t sp r o v i d e dt h eu s e f u lg e n e t i ci n f o r m a t i o na n dl e d 璐t os p e c u l a t et h a tg e n e t i ce x c h a n g ea n dr e c o m b i n a t i o nt i l ep o t e n t i a l l yr e s p o n s i b l ef o r t h ed i v e r g e n c ea m o n gt h er e p l i c o n so f t h ep a m l 3 1f a m i l y 2 。s c r e e n i n go fp l a s m i d - c u r e dm u t a n to f y b t - 1 7 6 5 b yg r a d u a l l ye l e v a t i n gg r o w t ht e m p e r a t u r ea n da d d i n gs o d i u md o d e c y ls u l f a t e ( s d s ) a st h ep l a s m i d - c u r i n ga g e n t ，w eo b t a i n e dt w op a r t i a l l y p l a s m i d - c t t r e d m u t a n to f y b t - 1 7 6 5 i nw h i c h , b m b l 9 3h a r b o r e dt w ol a r g ep l a s m i d s ( p l a s m i dp b m b l 6 5w a s c u r e d ) a n db m b l 7 5h a r b o r e do n l yt h es m a l l e s tp l a s m i dp b m b l 7 5 i i i 3 c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o na n a l y s i so fp b m b l 7 5 a c r y p t i cp l a s m i dp b m b l 7 5w a st h es m a l l e s tf r o mb a c i l l u st h u r i n g i e n s i ss u b s p t e n e b r i o n i sy b t - 1 7 6 5w a si s o l a t e da n dc h a r a c t e r i z e d s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a t p b m b l 7 5 ( 1 ，4 8 4 1b p ) c o n t a i n e da tl e a s te i g h t e e np u t a t i v eo p e nr e a d i n gf r a m e s ( o r f s ) ， a m o n gw h i c hn i n e o r f sd i s p l a y e dt h eh o m o l o g y 、i t l lt h eh y p o t h e t i c a lp r o t e i n si n r o l l i n g c i r c l er e p l i c a t i o np l a s m i dp g l 3 d e l e t i o na n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ep b m b l 7 5m i n i r e p l i c o nl o c a t e di nan o v e l1 ，1 5 7 b p f r a g m e n t t h i sf r a g m e n tc o n t a i n so r f 7c o d i n gs e q u e n c e ，w h i c he n c o d e sap r o t e i n ( r e p l 7 5 ，1 4 9a m i n oa c i d s a a ) i n d i s p e n s a b l ef o rp l a s m i dr e p l i c a t i o n r e p l 7 5h a sn o ta n y s i g n i f i c a n ts i m i l a r i t yw i t hk n o w np r o t e i n s f u r t h e r m o r e ，ap u t a t i v ed o u b l es t r a n do r i g i n ( g s o ) ，i l a v 血gn od n as i m i l a r i t y t oc h a r a c t e r i z e dd s oo fo t h e rr e p l i c o ns of a r , w a s i d e n t i f i e di nt h i sm i n i - r e p l i c o nf r a g m e n t t h e s ef e a t u r e ss h o w e dt h a tp b m b 17 5c o u l db e p l a c e di n t oa n e w p l a s m i df a m i l y k e yw o r d s ：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ；s u b s p t e n e b r i o n i s ；p l a s m i d ；r e p l i c o n ；p l a s m i d 。c u r e d m u t a n t i v 缩略语表 a b b r e v i a t i o n v v i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：童军拖 时间：j 纫彳年2 月侈日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文，本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名：董年把导师签名：玄o ，1 1 飞 签名日期：j 阳彳年让月肠日 签名日期：孔彤否年，z 月f 弓日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 1 前言 1 1 细菌质粒的基本特征 在细菌中，有一些重要的基因并不是染色体d n a 的结构成分，而是定位在核 外遗传物质上，这种独立于染色体d n a 的核外遗传物质就是质 r ( p l a s m i d ) 。质粒通 常是共价闭合环状d n a ( c e c d n a ) 双链分子，在细胞中以超螺旋形式存在，也有部分 质粒是线状d n a 分子( 邓子新，1 9 9 3 ) ，在宿主细胞内通常具有一定的拷贝数。一般 认为，质粒并不是其宿主细胞生存所必需的结构组成，但是质粒的存在往往可以赋 予宿主细胞一些重要的特性，例如：( 1 ) 致育性；( 2 ) 对药物的抗性；( 3 ) 对重金属 离子的抗性；( 4 ) 产生抗生素；( 5 ) 产生细菌素；( 6 ) 产生昆虫毒素；( 7 ) 分解型质 粒；( 8 ) 对动物的致病性；( 9 ) 对植物的致病性：0 0 ) 生物固氮：( 1 1 ) 限制一修饰系 统：( 1 2 ) 形成原噬菌体：( 1 3 ) 转座子( t r a n s p o s o n , t n ) 或插入序歹l j ( i n s e r t i o ns e q u e n c e ，i s ) ； 此外，还有一类质粒，它们究竟赋予寄主细胞何种表型，目前仍不清楚，因此称这 类质粒为隐蔽质粒( c r y p t i cp l a s m i d ) 。质粒还可以通过重组或转座等方式，将其携带 的遗传信息参入染色体中，或者通过接合转移、转导等方式在群体之间进行遗传物 质的交换。 由于质粒是一种相对简单的遗传物质，携带丰富的遗传信息，并且容易分离提 纯和在体外进行操作，加上其相对独立，不影响宿主的生存，因此是一种很好的研 究材料。在d n a 克隆技术的发展中，质粒有着极其重要的作用。质粒作为载体在 细菌中扩增并表达许多外源基因的方法和技术已得到广泛的应用。 1 1 1 质粒的复制方式 质粒能利用寄主细胞的d n a 复制系统进行自主复制，与质粒复制有关的酶大 部分是由宿主染色体编码的，但质粒本身所携带的基因在控制质粒复制起始以及决 定己复制的质粒在子代细胞内的分配等方面都起到必要的作用。质粒分子中为质粒 自主复制并维持正常拷贝数所必需的最小区段称为复制子。复制子是一个遗传单位， 包括d n a 复制起点( o r i ) 及其相关的调控元件。一般说来，一个质粒d n a 只有一个 复制起点，但少数质粒d n a 可能存在多个复制起点，如r 6 k 质粒有伍p 和y 三个复 制起点三个复制起点( c r o s s , 1 9 8 0 ) 。 目前，质粒最理想的分类法是依据质粒各自自主复制的特性进行分类。细菌中 的环状质粒通常有三种复制方式：滚环复甫1 ( r o l l i n g - e i r c l er e p l i c a t i o n ，r c r ) ，e 复制以 及d - 环复制( 或称链置换型) 。研究结果显示，革兰氏阴性( g ) 细菌的质粒多遵循e 复 制，而革兰氏阳性( g 3 细菌的质粒多以滚环方式进行复制，以d 环复制的质粒多为 l n c q 族广宿主范围的质粒。 1 1 1 1 滚环复制及其分类 以滚环方式进行复制的质粒多数是来源于革兰氏阳性细菌的一些多拷贝小质 粒，近年来，在许多革兰氏阴性细菌和古细菌中也发现了以这种方式进行复制的质 粒( k h a n ，1 9 9 6 ) 。 遵循滚环复制的质粒( 简称为r c r 质粒) 的复制需要质粒上的三个必需因子：( 1 ) 复制蛋白( r e p ) ，它是一种解螺旋酶，能够与前导链发生特异性结合并利用a t p 水解 的能量松开双螺旋，参与前导链复制的起始和终止；( 2 ) x 2 链复制起点( d o u b l es t r a n d o r i g i n ，简称d s o ) ，是前导链的复制起始位点，多位于r e p 蛋白开放阅读框架的上游 或其内部，常常具有多个茎环或十字形结构( d e ls o l a re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。该区域包括p e p 蛋白识别位点( b i n d 位点) 和切割位点( n i c k 位点) ，而n i c k 位点则位于其中一个茎环 结构的环上；( 3 ) 单链复制起点( s i n g l es t r a n do r i g i n ，简称s s o ) ，是后随链复制起始位 点，大小一般介于1 3 0 b p 2 2 0 b p 之间，具有大的发卡结构。到目前为止，根据渤 区域序列及二级结构的保守性可以分成5 个类型：s s o a 、s s o u 、s s o w 、s s o t 和 s s o l ( a n d r u pe ta 1 ，2 0 0 3 ) 。此外。一些r c r 质粒还具有促进复制的增强子，如金黄 色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ) 质粒p t l 8 1 的c m p 因子，可以增强r e p 蛋白与d s o 的结合( k h a n , 1 9 9 7 ) 。 滚环复制的基本过程如图1 1 所示。首先，质粒编码的p e p 蛋白结合在d s o 的 b i n d 位点上，接着r e p 在位于d s o 的n i c k 位点切开一个切口，并通过其活性位点上 的一个酪氨酸残基共价结合在缺口的5 p 端。同时宿主编码的解旋酶以一种蛋白与 蛋白问的特异性相互作用置换到链上，并解开d n a 双螺旋结构。与此同时，单链 d n a 结合蛋白( s s b ) 结合在置换出的单链d n a ( s s d n a ) 上。前导链的复制开始于n i c k 切口处游离的3 - o h 端，d n a 聚合酶i i i 以其为引物进行链的延伸，产生了一个先 导链和s s d n a 连在一起的共价体。随着延伸的进行，当复制叉到达终止位点( c o 新 产生的a l s o ) ，r e p 蛋白识别d s o 上的终止信号，导致对链的第二次切割，使得s s d n a 游离出来s s d n a 中间体的存在是滚环复制质粒的一个重要特征。释放的s s d n a 利用s s o 和宿主相关因子转换成双链d n a ( d s d n a ) ，而d s d n a 的产生标志着一个复 制循环的完成。 到目前为止，根据r e p 蛋白和d s o 区的同源性，r c r 质粒被分成了十七个不同 的家族( h t t p ：w w w , e s s e x u k b s s t a 彤o s b o r n d p rh o m e h t m ) 。同一个家族的质粒具 有相似的r e p 蛋白和d s o ，但是册区的差异却很大，表现出宿主特异性。在非特异 性宿主中，质粒仍可存在，但仅仅是以s s d n a 累积物的形式存在。此时。由s s d n a 向d s d n a 的转变是非特异性的，且效率降低。某些质粒的船d 缺失还可导致质粒不 稳定存在和拷贝数降低( b o ee la 1 ，1 9 8 9 ) 。 以滚环方式复制的质粒维持其稳定性多依靠高拷贝，此类质粒复制时若出现多 聚体，会因拷贝数降低而在子代细胞中丢失。 萨园为蚩移 b 是+ 最艿 图1 1r c r 质粒复制模型( k h a n ，2 0 0 5 ) f i g 1 1m o d e lf o r t h er e p l i c a t i o no fr c rp l a s m i d s 1 1 1 20 复制及其分类 e 复制是d n a 复制的通常形式，是很多g 。细菌质粒包括c o l e l 、r k 2 、f 和p 1 质粒以及染色体的复制方式。但一些g + 细菌如链球菌( s t r e p t o c o c c u s ) 、肠球菌 ( e n t e r o c o c c u s ) 、乳球菌( l a c t o c o c c u s ) 及芽胞杆菌( b a c i l l u s ) 属中的大质粒( 大于1 5 k b ) 的复制机制也属于0 复制。 e 复制的过程如图1 2 所示。首先，在一个复制起点或同时从多个复制起点打开 双链d n a ，在电子显微镜下，复制中间体呈现类似于希腊字母“0 ”的形状( 也称复 制泡1 。随后，分别以质粒双链d n a 中的一条链作模板，形成两个方向相反的复制 叉或仅形成一个单向的复制叉。单向复制中复制叉沿着d n a 分子移动直至再次遇 到复制起点。两个子链分开：双向复制中，两个复制叉以相反的方向从起点区开始 延伸，直至在d n a 分子某处相遇结束复制，复制的结束需要宿主编码的复制终止 蛋白识别d n a 上的对应片段。 除少数例子外，以0 机制进行复制的质粒通常需要一个质粒编码的r e p 蛋白； 有些还需要宿主d n a 多聚酶l ( p o l l ) 参与早期前导链的合成。在0 复制质粒中，质粒 复制起点( o r i ) 提供质粒自主复制的最小顺式作用区段，是d n a 链发生解链及起始 d n a 复制的区段，也是前导链合成的起点。此外，在某些0 质粒复制起点( o r i ) 还包 括了一段正向重复序列( 重复子：i t e r o n s ) ，d n a a 起始蛋白的结合位点( d n a ab o x e s ) 及一段富含a + t 的区域，将该区域称为o r i a 。目前，根据质粒是否自身编码r e p 蛋白及r e p 蛋白氨基酸序列的同源性关系，是否存在o r i a 区域和是否依赖宿主编码 的d n a 多聚酶l 。将0 复制子分为五个家族( g r o u p a g r o u p f ， h t t p ：w w w e s s e x ，扯u k b s s t a f f o s b o r n d p r _ h o m e ，h t m ) ，参见表1 1 。其中，研究最清 楚的g + 细菌0 复制质粒是来源于粪肠球菌( e n t e r o c o u u sf a e c a l i s ) 的p a m l 3 1 ( b r u a n de t a 1 。1 9 9 3 ) ，它属于d 家族，又称为p a m l 3 1 家族。 0 0 一一o b 一号。 图l ，2 质粒0 复制模型( s n y d e ra n dc h a m p n e s s ，19 9 7 ) f i g 1 2m o d e l f o r t h e0r e p f i c a t i o no f p l a s m i d s ( a ) 单向复制( u n i d i r e c t i o n a lr e p l i c a t i o n ) ( b ) 双向复制( b i d i r e c t i o n a lr e p l i c a t i o n ) 表1 1e 复制子的分类 t a b l e l 1c l a s s i f i c a t i o no ft h e t ar e p l i c a t i o n ( h t t p ：w w w e s s e x a c u k b s s t a f f o s b o r n d p r _ h o m e h t m ) 家族例子 r e p 蛋白 o r m 区域对d n a 多聚酶1 的依赖 鱼翌坚巳 星苎垒里仑! 呈! 垦皇巳巳! 旦! 型璺2 型生! ! g ! 旦翌垒型垒壁! ! ：皇呈巳曼翌璺! 里! a f r 6 k ，r 1 ，r k 2 ， ，4 p w v 0 2 b c o i e i c c o i e 2 x， d p a m a l p i p 5 0 1 _1 i_ e p l s 2 0 p h t l 0 3 0 ， f p l s 3 2 p a d l 町此家族质粒中o r i 4 区域存在但是为复制非必需 4 1 1 1 3d 一环复制 质粒的d 环复制( 或称链置换复制) 方式主要是从i n c q 族质粒中发现的，该族质 粒因在复制过程中形成典型的字母“d 的形状而得名( 图1 3 ) 。l n c q 型质粒的复制需 要三种复制蛋白r e p a ，r e p b ，r e p c 的参与( s c h e r z i n g e re la 1 ，1 9 9 1 ) 。复制蛋白在复 制起点处启动d n a 的双向复制，以链置换的方式进行双链的复制。该质粒的复制 起点是在存在三种复制蛋白的情况下可支持双向复制的最小区段。复制蛋白r e p a ， 具有5 寸3 解旋酶活性，r e p b 具有引发酶活性，而r e p c 具有起始子活性( s a k a ia n d k o m a n o ，1 9 9 6 ) 。 d 一环复制质粒的两条链具有各自的复制起点。质粒的复制通常从前导链的复制 起点开始，在复制蛋白的作用下形成新的d n a 链以置换后随链，并形成d 环形状。 随着新链的延伸，d 一环也逐渐加大。当新链的合成到达后随链的复制起点位置时， 引起新的前导链的合成，并最终形成两个完整的子代质粒d n a 。 由于复制蛋白r e p a ，r e p b ，r e p c 是由宿主r n a 聚合酶( r n a p ) 独立转录。并 且宿主复制因子( d n a a ，d n a b ，d n a c 和d n a 6 ) 参与了质粒的早期复制。这些因素造 成了i n c q 类质粒具有广宿主范围的特性( d e ls o l a re t a l ，1 9 9 8 ) 。 ；一 。囝 图1 3 质粒d 环复制模型 f i g 1 3m o d e lf o rt h ed l o o pr e p l i c a t i o no fp l a s m i d s 1 1 2 质粒拷贝数和质粒的不相容性 1 1 2 1 质粒拷贝数 质粒拷贝数( c o p yn u m b e r ) 是指在正常生长条件下，每个细菌细胞或每条染色体 所对应的平均质粒数。根据寄主细胞所含质粒拷贝数的多少，可将质粒分为两种类 型：种是严谨型复制控制的质粒( s t r i n g e n t p l a s m i d ) ，每个寄主细胞中仅含1 3 个拷 贝；另一种是松弛型复制控制的质粒( r e l a x e dp l a s m i d ) ，每个寄主细胞中可高达1 0 2 0 0 个拷贝。质粒拷贝数一般与其分子量成反比关系，严谨型质粒一般分子量较大，而 松弛型质粒分子量较小。 严谨型质粒的复制是与寄主细胞染色体同步进行，除了受本身的复制子的控制 外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少，仅依靠特殊的与膜结合的分配机制 来保证质粒在子细胞中的均匀分配。松弛型质粒的复制不与寄主细胞染色体同步， 仅受其自身复制子的控制。当用蛋白质合成抑制剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞 时。染色体d n a 复制受阻，但松弛型质粒仍可继续扩增，经过几个小时的扩增。 有的松弛型质粒在细胞内的拷贝数甚至可以达到2 0 0 0 3 0 0 0 个。松弛型质粒因拷贝 数较高而以随机分配的方式来保证向子代细胞的传递。 1 1 2 2 质粒拷贝数的控制 实验证明，细胞中每种质粒拷贝数的多少是通过控制质粒d n a 复制起始频率 来调节的，质粒的复制子决定其拷贝数。目前，对质粒拷贝数控制的三种负调控机 制已经深入地开展过研究( d e ls o l a ra n de s p i n o s a , 2 0 0 0 ) 。 第一种类型是通过反义r n a 来调节质粒的拷贝数，如c o l e i 、r i 、r 1 0 0 质粒。 在c o l e l 的复制中，是通过控制r n a 引物( r n a i i ) 与模板的结合，对质粒d n a 复 制进行控制。质粒d n a 前导链的合成以r n a i i 为引物，质粒d n a 的合成依赖于复 制起点处稳定的d n a r n a i i 杂合体的形成。r n a i 是由r n a i i 基因的反义链编码 的1 0 8 个碱基小分子转录物。它折叠成可与新生r n a i i 前体结合的三叶草结构从 而阻止r n a i i 折叠成形成d n a r n a i i 杂合体所必需的稳定二级结构( t o m i z a w a , 1 9 9 0 ) ，因此，r n a i 作为质粒d n a 合成起始的负调节物控制质粒拷贝数。另外， r 1 质粒是利用反义r n a 抑制质粒编码的、复制所必需的复制蛋白( r e p ) 的合成，从 而控制质粒的拷贝数。 第二种类型是通过反义r n a 和阻遏蛋白来调节质粒的拷贝数，如p m v l 5 8 、 p i p 5 0 1 。除了反义r n a 参与了质粒的拷贝数的控制，在p m v l 5 8 、p i p 5 0 1 等质粒中， 质粒还编码一种阻遏蛋白抑制了其下游p e p 的转录，阻遏蛋白编码基因的突变或缺 失导致了质粒拷贝数的增n ( d es o l a r e l a l ，1 9 9 8 ) 。 第三种类型是通过一段d n a 多次正向重复序列即重复子( r e r o n s ) 来调节质粒的 拷贝数，如f 、p 1 、r 6 k 、r k 2 等质粒。这类质粒的拷贝数控制依靠两种机制：其 一是当宿主中质粒拷贝数达到一定数量时，p e p 蛋白能与自身启动子区结合阻止其 进一步被转录，其二是复制蛋白能通过与两个质粒的h e r o n s 序列相连，从而将质粒 连接起来阻止转录起始，即所谓的“h a n d c u f f i n g 模型( l a r r y , 1 9 9 7 ) ，这种拷贝数的调 控机制多见于严紧型质粒的复制。 1 1 2 3 质粒的不相容性 在没有选择压力的情况下，两种质粒在同一宿主中不能共存的现象称为质粒的 不相容性( p l a s m i di n c o m p a t i b i l i t y ) 。引起质粒不相容现象的原因目前尚未明确，可能 是不相容的质粒之间亲缘关系密切，携带的复制子基本相似，复制系统也相同，在 复制和分配到子细胞的过程中相互竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，必定 有一种在细胞的增殖过程中，被逐渐排斥( 稀释) 掉。 由于所有天然分离的质粒都具有这一特性，因此，可根据质粒间的不相容性对 质粒进行分群。彼此不相容的质粒属于同一个不相容群，而彼此能够共存的相容质 粒，则属于不同的不亲和群。现已发现3 0 多个不亲和群。 1 1 3 质粒分离的稳定性 质粒的稳定遗传需要忠实的复制系统和精确的分配系统，通常所说的质粒的不 稳定性( p l a s m i di n s t a b i l i t y ) 包括结构的不稳定性( s t r u c t u r a li n s t a b i l i t y ) 和分离的不稳定 性( s e g r e g a t i o ni n s t a b i l i 动两个方面因素。 质粒结构的不稳定包括自身d n a 的丢失、重组以及外源d n a 的插入等，大多 数都是因为质粒上有一些短的重复序列发生了重组。重组分为分子间和分子内两种 形式。分子间重组包括质粒和染色体之间的同源序列重组及同源质粒之间的重组。 分子内重组主要是质粒内部一些同源序列之间发生重组。 分离不稳定是整个质粒都发生丢失，是由于在细胞分裂过程中，有一个子细胞 没有获得质粒d n a 并最终增殖成为缺失质粒的优势群体。质粒具有一些机制避免 被消除，包括位点特异性重组系统( s i t e s p e c i f i cr e c o m b i n a t i o ns y s t e m s ) 、主动分配系 统( a c t i v ep a r t i t i o ns y s t e m s ) 和质粒沉溺系统( p l a s m i da d d i c t i o ns y s t e m s ) 。 1 1 3 1 位点特异性重组系统 对高拷贝数质粒而言，主要是通过多拷贝的随机分配，保证子细胞获得质粒。 但是，高拷贝质粒在复制时易形成多聚体影响分配，在细胞分裂过程中质粒丢失的 可能性就会增加( z i e l e n k i e w i c za n dc e g l o w s k i ，2 0 0 1 ) 。一个多聚体是由多个单体相互 连接面成的。多聚体的形成可能是由于在复制终止时发生错误或者是由于单体间重 组的结果。由于多聚体在细胞分裂时将作为一个质粒进入子细胞，这样，多聚体的 7 形成就大大降低了质粒的有效拷贝数，因此，多聚体也就大大增加了细胞分裂时质 粒丢失的机会。为了避免这种情况的发生，很多质粒都具有位点特异性重组系统系 统，使多聚体在分配之前分解成单体，以保证每个子细胞都能获得质粒，从而保证 质粒的稳定遗传，因此又称为多聚体解离系统( m u l t i m e rr e s o l u t i o ns y s t e m ) 。 1 i ，3 2 主动分配系统 低拷贝的某些质粒通过一种主动分配系统来防止在细胞分裂过程中质粒的丢 失，这种机制保证质粒在细胞分裂过程中精确分配到子细胞中。质粒中发挥这种作 用的区域称为分i 叉( p a r t i t i o nr e g i o n ) ，一般由三个组分组成，包括两种蛋白( p a r 蛋 白) 和一个起顺式作用的、与染色体着丝粒类似的分配位点( p a r 位点) 。其中一种p a r 蛋白是一种位点特异性的d n a 结合蛋白，能识别并与p a r 位点结合；另一种p a r 蛋 白是一种a t p a s e ，根据a t p a s e 的同源性，可以将质粒的分配系统分成两个家族 ( f u r ) n e l l ，2 0 0 5 ) 。质粒主动分配系统在细胞分裂前将质粒推向细胞两边，通过p a r 位 点与细胞膜结合，在细胞分裂时，由于膜的生长，质粒就分配到两个子细胞中。 l ，1 3 3 质粒沉溺系统 即使质粒具有主动分配功能，质粒也会从增殖的细胞中丢失。某些质粒还编码 产生特殊的致死蛋白( 或者称为毒素蛋白) 杀死细胞分裂后出现的无质粒细胞的方式 来维持质粒的稳定性，这种控制质粒在细胞中稳定遗传的机制称为质粒的沉溺系统 ( p l a s m i da d d i c t i o ns y s t e m s ) 。质粒沉溺系统至少需要两个质粒基因的存在，一个是编 码稳定毒素蛋白的毒素基因，另一个是编码不稳定解毒剂的解毒基因，所以质粒沉 溺系统又称为毒素一抗毒素系统( t o x i n a n t i t o x i ns y s t e m s ，t a 系统) 。解毒剂既可以是反 义r n a ( 反义r n a 可以抑制毒素m r n a 的翻译) 也可以是蛋白质( j e n s e