（水生生物学专业论文）文蛤对塔玛亚历山大藻毒性响应的研究.pdf

上海水产大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文孛已经甓确注鹗帮弓l 震豹内容铃，本论文不毽含锰侮箕 龟个入或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学佼论文律鬻签名：穗肇 日期；1 叻年6 月k 日 上海水产大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了鳃学校有关保鐾、使用学位论文的援定， 间意学校保留并向园家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 舨，竞许论文被粪阕或誊阙。本入授权上海承产大学可戳将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 绦密 蜀，在年勰密嚣逶蠲本舨投蕊。 本学位论文属子 不保密 留 学位论文作者签名；枷 l a 期：、茹薛6 a - k a 指导教师签名：场奴，少数身星 麟。垆钼朔 上海水产大学硕士学位论文 文蛤对塔玛亚历山大藻毒性响应的研究 摘要 实验室条件下，以文蛤( m e r e t r i xm e r e t r i xl i n n a e u s ) 为研究对象，采用静水试验 法，研究了塔玛亚历山大藻对文蛤的呼吸、排泄等生理活动的影响。以显微摄影 技术观察了文蛤对塔玛亚历山大藻似l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ) a t h k 株、海洋小球藻 ( c h l o r e l l am a r i n e ) 、等鞭金藻( i s o c h r y s i sg a l b a n a ) 和青岛大扁藻( p l a t y m o n a s h e l g o l a n d i c a ) 的表观消化状况，采用灰化法测定了文蛤对四种单胞藻的同化率， 以期为贝类的人工染毒净化提供理论基础。通过人工定量投喂塔玛亚历山大藻的 方法，研究了麻痹性贝毒( p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n , p s p ) 毛e 文蛤体内的累积规律及 其毒素浓度与摄食藻类数量之间的关系，并用“内排外解”法对文蛤体内p s p 的 净化规律进行了初步研究和综合评价，综合地研究了文蛤对塔玛亚历山大藻的毒 性响应状况。 研究表明：塔玛亚历山大藻对文蛤的呼吸和排泄活动有明显影响。当藻细胞 浓度为1 0 x l o 3 c e l l m l ，文蛤的单位体质量耗氧率和排磷率最大，其最大值分别 为2 7 6x 1 0 - 3 h 和0 3 3 9 z m o l g h ，其排氨率在该藻浓度为0 5x 1 0 - 3 c e u m l 时达到 最大值5 7 1 m m o l m l 。耗氧率与排氨率的比值( o n ) 显示在较低塔玛亚历山大藻 浓度下( 0 5x 1 0 3 c e n m l ) ，文蛤由蛋白质和脂肪提供机体能量，而当该藻浓度 较高时( 1 0 x l o o c e l l m l ) 则由脂肪和碳水化合物共同提供机体代谢所需能量： 另外，试验中还发现高浓度的塔玛亚历山大藻细胞表面产生的胞外物质能使文蛤 出现应激现象( 双壳紧闭，停止滤食) 。 在摄食消化试验中发现：文蛤对海洋小球藻、等鞭金藻和青岛大扁藻的同化 率随着藻类浓度的升高而降低，该结果与表观消化状况相符。其同化率变化范围 分别为8 7 9 6 7 4 、8 3 4 5 8 7 和6 7 5 3 7 9 。当塔玛亚历山大藻浓度 低于5 0 x 1 0 3 c e l i m l 时，文蛤不会产生假粪，该藻能够被文蛤利用。同时还发现， x o x t 0 3 c e l l m l 到3 0 x 1 0 3 c e l l m l 的藻浓度下，文蛤的生理状态比较正常，在 4 o x l 0 3 c e l l m l 到5 0 x 1 0 3 c e l l m l 的浓度内的吸收率曲线却与其他的四种单胞藻的 吸收曲线存在着很大的差异，可能是由于3 o x l 0 3 c e l l m l 浓度的塔玛亚历山大藻是 一个分界点，超过这一浓度后，将对文蛤的生理活动产生较大的干扰，导致其摄 食率突然降低，而4 o x l 0 3 c e l l m l 和5 o x l 0 3 c e l l m l 浓度下的吸收率却同步上升。 上海水产大学硕士学位论文 文蛤对麻痹性贝毒的累积能力较弱，累积试验末期( 1 5 d ) 内脏累积毒素仅为 8 8 4 f l g s t x e q 1 0 0 9 ，内脏中累积的毒素含量高于肌肉，占全贝的7 7 3 8 9 1 。 1 5 天的解毒试验中，三组文蛤的毒素量都有所下降，毒素排出明显分为短期的快 速阶段和长期的慢速阶段。臭氧处理能加快快速阶段毒素的排出，投喂等边金藻 能提高慢速阶段的排毒效率。试验结束时，对照组排毒量为3 0 6 ，臭氧处理) 组为3 2 7 ，b ( “内排外解”法处理) 组排毒量最高为4 7 2 。虽然三组文蛤内毒 素含量仍高于8 q “gs t x e q d l 0 0 9 ，但“内排外解”方法能加快文蛤体内p s p 的排 出。 关键词：塔玛亚历山大藻；麻痹性贝毒；文蛤；耗氧率；排氨率；排磷率；表观 消化状况；同化率；累积；摔出；内排外解。 上海水产大学硕士学位论文 t h et o x i t yr e s p o n s eo f a l e x a n d r i u mt a m a r e n s eo n m e r e t r i xm e r e t r i xl i n n a e u s a b s t r a c t u s i n gd i n o f l a g e l l a t ea l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ( as p e c i e so fp s pp r o d u c i n ga l g a e ) a n d h a r dc l a mm e r e t r i xm e r e t r i xl i n n a e u sa sm o d e l s ，t h ee f f e c to ft h ea l e x a n d r i u m t a m a r e n 圬eo nh a r dc l a m ，d i g e s t i o n ，r e s p i r a t i o na n de x c r e t i o nw e ms t u d i e di nl a bs t a t i c s s y s t e m t h ea b s o r p t i o ne f f i c i e n c y o fh a r dc l a mo na l e x a n d r i u mt a m a r e n s ea n d o t h e rt h r e ek i n d so fm i c r o a l g a es u c ha sc h l o r e l l am a r i n e , i s o c h r y s i sg a l b a n a , p l a t y m o n a sh e l g o l a n d i c aw e r ed e t e r m i n e dt h r o u g ht h ep r o p o r t i o no fa s hw e i g h tm e t h o d , m e a n w h i l e , t h ea p p a r e n td i g e s t i o no fm i c r o a l g a ew a so b s e r v e dw i t hp h o t o m i c r o g r a p h y t h r o u g hf e e d i n ga l g a e lq u a n t i f i c a t i o n a l l y , t h er e l a t i o n s h i p a sw e l la sd e t o x i f i c a t i o no f p s pi nh a r dc l a m ，b e t w e e na c c u m u l a t i o na n da m o u n to fa t a m a r e n s ew e ms t u d i e d p r e l i m i n a r y i nt h em e a nw h i l e ，t h en c wd e t o x i f i c a t i o nm e t h o dh a sb e e ns t u d i e da n d e v a h a t e dp r i m a r i l y - t h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w , c u l t u r eo f d i n o f l a g e l l a t e a t a m a r e n s es h o w e do b v i o u s i m p a c tt or e s p i r a t i o na n de x c r e t i o no f h a r dc l a m t h eh i g h e s to x y g e nc o n s u m p t i o nr a t e a n dp h o s p h a t ee x c r e t i o nr a t ew a s2 7 6 x 1 0 3 ha n d0 3 3 9 z m o l g - 1 h 1i nt h ea l g a e c o n c e n t r a t i o no f1 0 0 0 c e l l m l ；t h em a x i m u ma m m o n i ae x c r e t i o nr a t ew a s5 7 l “m o l m l i nt h e a l g a ec o n c e n t r a t i o no f 5 0 0 c e l lm l 1 f u r t h e r m o r e t h eo nr a t i oi n d i c a t e dt h a tt o m a i n t a i ni t ss t a n d a r d m e t a b o l i s m ，h a r dc l a m sc o n s u m e dm o r ef a ta n dp r o t e i n c a r b o h y d r a t eu n d e rl o w e rc e l lc o n c e n t r a t i o n ( = 5 0 0 ) ，w h i l em o r ef a ta n dc a r b o h y d r a t e u n d e rh i g h e rc e l lc o n c e n t r a t i o n ( - 1 0 0 0 ) i na d d i t i o n ，t h ee x t r a c e l l u l a rp r o d u c t sp r o d u c e d b yd i n o f l a g e l l a t e a t a m a r e n s ec a nm a k et h eh a r dc l a m ss t r e s s e d t h ea b s o r p t i o n e f f i c i e n c y ( a e ) o fh a r dc l a mm e r e t r i xm e r e t r i xl i n n a e u s o n a l e x a n d r i u mt a m a r e n s ea n do t h e rt h r e ek i n d so fm i c r o a l g a e l ( c h l o r e l l a m a r i n e ， l s o c h r y s i sg a l b a n a ，p l a t y m o n a sh e l g o t a n d i c a ) w e r ed e t e r m i n e dt h r o u g ht h ep r o p o r t i o n o fa s hw e i g h tm e t h o d ，m e a n w h i l e ，t h ea p p a r e n td i g e s t i o no fm i c r o a l g a ew a so b s e r v e d w i t hp h o t o m i c r o g r a p h y t h ea ew a sc o r r e l a t e dn e g a t i v e l yw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n o f a l g ；, ee x c e p t a t a m a r e n s e t h ec a l m sd i d n tp r o d u c ep s e u d o f e c e s i nt h ec o n c e n t r a t i o n o f a t a m a r e n s eb e l o w5 0 0 0 c e l lm l 1a tt i l ew a t e r m p e r a t u r e2 2 ( 2 f u r t h e r m o r e ，t h e 1 上海水产大学硕士学位论文 a eo fh a r dc l a mw a sr a n g e df r o m8 1 8 t o5 1 3 i nac o n c e n t r a t i o no f a l e x a n d r i u m t a m a r e n a ef r o m1 o x l 0 s c e l lm l - 1l o3 0 x 1 0 c e l lm l - 1 t h ea ei nt h ec o n c e n t r a t i o no f 4 o x l 旷c e l lm l 1i n c r e a s e dt o6 7 6 t h e ni td e c r e a s e dt o5 2 4 w h e nt h e c o n c e n t r a t i o n5 o 1 矿c e l lm l 1 i tw a sc o n s i d e r e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no f3 0 x l o jc e l l m u lw a saw a t e r s h e d ，o v e rw h i c ht h ef d t e r f e e d i n ga c t i v i t yo fh a r dc l a mw i l lb eg r e a t l y d i s t n r b e da st h ei n g e s t i o nr a t ei nt h ec o n c e n t r a t i o no f4 o x l o jc e l lm l 1a n d5 o x l 0 3 c e l l m l 1d e c r e a s e ds u d d e n l y , w h i l et h ea b s o r p t i o ne f f i c i e n c yi n c r e a s e ds i m u l t a n e o u s l y t h eh a r dc l a mu s e di nt h ee x p e r i m e n t ，w i t hn oh i s t o r yo fe x p o s u r et op s eh a sal o w a b i l i t yt oa c c u m u l a t ep s ei tr e a c h e dt o8 8 4 “gs t x e q l o o gi na f t e r1 5 de x p o s e dt o t o x i ca t a m a r e n s e ，a n dt h et o x i nf o u n di nt h em a s si sh i g h e rt h a ni no t h e rt i s s u e ， a c c o u n t i n g7 7 3 8 9 1 o ft h et o t a l d u r i n gt h ep e r i o df o r1 5 dd e t o x i f i c a t i o n , a t w o - s t a g e dd e p u r a t i o nk i n e t i c sw a so b s e r v e dt h r o u g h o u tt h ed e p u r a t i o np e r i o d af i r s t r a p i dl o s so fu n a s s i m i l a t e dt o x i n sp r e s u m a b l yt h r o u g hg u te l i m i n a t i o nf o l l o w e db ya s u b s e q u e n ts l o w e rr e l e a s eo fa s s i m i l a t e dt o x i n s t h ea m o u n to ft o t a lp s pd e c r e a s e di n t h r e eg r o u p sw i t ht h ee l i m i n a t i o nr a t eo fc o n t r o lg r o u p3 0 6 ，ag r o u p3 2 7 ，bg r o u p 4 7 2 i nt h ee n do fd e t o x i f i c a t i o ne x p e r i m e n t k e y w o r d s ：a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ；m e r e t r i xm e r e t r i xl i n n a e u s ；o x y g e nc o n s u m p t i o n r a t e ；a m m o n i ae x c r e t i o nr a t e ；p h o s p h a t ee x c r e t i o nr a t e ；a p p a r e n td i g e s t i o n ；a b s o r p t i o n e f f i c i e n c y ( a e ) ；a c c u m u l a t i o n ；d e t o x i f i c a t i o n 4 上海水产大学硕士学位论文 1 1 赤潮简介 第一章前言 赤潮( r e dt i d e s ) 又称作藻华( a l g a lb l o o m s ) ，是指在特定环境条件下，某 些浮游生物、原生动物和细菌暴发性繁殖和高度聚集，引起海水变色的现象，根 据引起赤潮的浮游生物种类，分为有害赤潮和无害赤潮( h a r m f u la j i g a lb l o o m s ， h a b ) 【1 1 。赤潮并不一定是红色的，随着发生的原因、种类和数量的不同，水体会 呈现不同的颜色，有红色、橘红色、绿色、黄色、棕色等，由夜光虫引起的赤潮， 呈粉红色或深红色，由某些双鞭毛藻引起的赤潮，呈绿色或褐色，某些赤潮生物 ( 如膝沟藻、裸甲藻、梨甲藻等) 引起赤潮有时并不引起海水呈现任何特别的颜 色【2 1 。现阶段，各国学者所研究的赤潮主要是能导致毒害的有害赤潮。有害赤潮发 生的频度、强度以及广度逐渐增加，对公众健康及社会经济的影响日益加剧。因 此，对赤潮的研究已逐渐成为全球性海洋环境问题中的热点。图1 ( 资料来源于网 络) 为世界赤潮爆发情况： l ? 霉一一卅，_ 图1 世界赤潮分布状况 f i g 1d i s t r i b u t i o no fr e dt i d eo v e rt h ew o r l d 1 2 赤潮成因及研究历史 赤潮的成因较复杂，有生物和化学方面的原因，还受海况、潮流和气象条件的 影响。殷说来，近泐水域有机污染引起海水富营养化是形成赤潮的j 三要原因f 3 1 0 上海水产大学硕士学位论文 随着现代化工农业生产的迅猛发展，沿海地区人口的增多，大量工农业废水和生 活污水排入海洋，其中相当一部分未经处理就直接排入海洋，因此导致近海和港 湾地区富营养化程度日趋严重。同时，沿海开发程度的提高和海水养殖业的扩大， 也带来了海洋生态环境和养殖业自身污染的问题。另一方面，海运业的发展导致 外来有害赤潮种类的引入。此外，全球气候的变暖也导致了赤潮的频繁发生【2 】。 赤潮是一种自然现象，人类早就有相关记载。据载，中国早在2 0 0 0 多年前就 发生过赤潮。一些古书文献或文艺作品里已有一些有关赤潮方面的记载，如清代 蒲松龄在聊斋志异中就形象地记载了与赤潮有关的发光现象。国外如旧约出 埃及记中就有关于赤潮的描述。在日本，早在滕原时代和镰时代就有赤潮的记 载。1 8 0 3 年法国人马克莱斯卡波特记载了美洲罗亚尔湾地区的印第安人，根据 月黑之夜观察海水发光现象来判断贻贝是否可以使用。1 8 3 1 - - 1 8 3 6 年，达尔文在 贝格尔航海记录中也记载了在巴西和智利近海发生的束毛藻引发的赤潮事件。 中国研究赤潮起步较晚，1 9 3 3 年费鸿年首次报道有关镇海至台州、石浦等海 域发生的夜光藻赤潮，其后有关赤潮的报道直到2 0 世纪7 0 年代才开始增加。表1 列举了1 9 5 2 - - 2 0 0 5 年中国沿海发生赤潮次数： 表1 中国各海区赤潮发生频次比较( 1 9 5 2 2 0 0 5 ) t a b 1t h es t a t u so f o e c o r r e n c eo fh a r m f u la l g a lb l o o m si nc h i n e s ec o a s t sf r o m1 9 5 2t o2 0 0 5 资料来自“邹最忠，2 0 0 4 ”、中国海洋火害公报 上海水产大学硕士学位论文 1 3 赤潮的危害 1 3 1 赤潮造成的经济损失 随着海水养殖业的发展，海洋渔业资源的严重衰退，养殖海域富营养化日趋 严重，频发的赤潮给全世界的海水养殖业造成了极大的损失： 1 9 7 1 年，日本濑户内海发生1 3 3 起“赤潮事件”；1 9 7 2 年8 月1 7 e 至2 1 日，日本 发生一次严重赤潮，死鱼达1 4 2 8 万尾，损失约7 1 亿日元：1 9 8 9 年1 月，新西兰发生 异弯藻赤潮，造成鲑鱼大量死亡，经济损失达1 2 0 0 万新元；1 9 9 4 年，日本发生大 规模膝沟藻赤潮，造成8 亿日元经济损失：欧盟出于食品安全卫生的考虑，曾于1 9 9 1 年中止过从中国进口贝类。1 9 9 8 年，日本广岛湾的异球藻赤潮，使以牡蛎为主的 养殖业损失达3 8 亿日元 4 1 。墨西哥沿海的环境问题中有4 5 是赤潮造成的，仅仅在贝 类方面，每年的损失就达几百万美元；在南非西海岸，仅1 9 9 7 年一次叉角藻( c e r a t i u m f u r c a ) 赤潮灾害就造成2 0 0 0 t 龙虾死亡，价值达5 0 0 0 万美元；在北欧、北海及北大西 洋沿岸，定鞭藻赤潮灾害的频发，使海洋动物遭受巨大损失，并使渔业受损【5 l o 近2 0 年来，随着我国沿海地区经济的迅猛发展和城市化进程的加快，大量工 农业废水和生活污水排放入海，致使近岸水体富营养化加剧，为赤潮爆发提供了 必要的物质条件，致使赤潮发生频次和规模逐年上升，危害之大令人震惊。据统 计，自1 9 5 0 年以来，有记载的赤潮2 5 0 余次，累计影响面积数十万k m z 。由于营养 盐污染和有机污染逐年加重，9 0 年代以来，我国近海赤潮发生频率加大，1 0 年间 累计发生2 0 0 余起【6 】，平均每年达2 0 起。一次赤潮的面积从几平方公里扩大到几千 甚至上万平方公里，发生区域从近岸局部海域发展至整个近岸海域和部分近海海 域，灾害损失从9 0 年代初期的近亿元增至9 0 年代末期的近十亿元。 1 9 8 9 年8 月- l o c i 在渤海沿岸，特别是河北省黄骅县海域发生的大面积赤潮使 鱼虾贝类大量死亡，导致养虾业遭受空前的损失，所造成的直接经济损失逾3 亿元。 1 9 9 8 年3 - - 4 y j ，在珠江口粤港海域发现的米氏裸甲藻( g y m n o d i n i u mm i k i m o t o i ) 赤潮， 造成粤港两地的海水养殖鱼类大量死亡，直接经济损失3 5 亿元，其中广东o 5 亿元。 1 9 9 8 年，渤海又发生了历史上罕见的赤潮，面积达5 0 0 0 余k m 2 ，直接经济损失5 亿 多元1 7 _ l m 。 1 3 2 赤潮造成的健康威胁 上海水产大学硕士学位论文 大规模的有害赤潮的发生，不仅直接危害鱼、虾、贝、藻的健康生长，造成 巨额的经济损失，而且赤潮毒素还可通过食物链导致人体中毒，危害人体生命健 康。 在所有的贝类产品食物中毒事件中，麻痹性贝毒中毒被公认为是对健康危害 最严重的情形之一。据统计在全球范围内每年报道p s p 弓i 起人类中毒事件约有2 0 0 0 起，其中死亡率为1 5 【l l 】。亚太地区从1 9 3 4 年至i j l 9 9 4 年发生的有害赤潮事件中p s p 中毒事件占4 1 7 1 1 2 1 。资料报道1 9 7 2 1 9 8 2 年日本中毒患者达1 1 9 2 人；1 9 8 1 年西 班牙有5 0 0 0 人中毒；在菲律宾，从1 9 8 3 年以来有毒藻类造成很多中毒事件，仅麻 痹性贝毒( p s p ) 中毒事件就逾2 0 0 0 例，造成1 1 5 人死亡【1 3 l 。 我国已发生多起疑为p s p 弓i 起的中毒事件，据不完全统计己导致2 4 人中毒死亡 【1 4 1 ，中毒事件主要发生在南方的福建、广东、香港和台湾沿海地区l 堋。1 9 8 6 年1 2 月发生在福建省东山海域的裸甲藻( g y m n o d i n i u ms p ) 赤潮，造成1 3 6 人中毒、1 人死亡的重大恶性事件。 1 4 麻痹性贝毒素简介及产毒甲藻 1 4 1 麻痹性贝毒的发现 麻痹性贝毒是海洋赤潮生物毒素中最普遍的一种，其最初来源于甲藻类。人 类食用贝类所引起的中毒国内外历史文献中早已有所记载，但其确切发病原因一 直不为人们所知，直到1 9 2 7 年美国加州大学的研究员观察到一种特殊的双鞭甲藻 在贻贝壳上开花，很多人在食用了这种贻贝后就发生麻痹甚至死亡，因此研究人 员推测这种双鞭甲藻是有毒的，并且发现从双鞭甲藻阻c a t e n e l l a 或g o n y a u l a x c a t e n e l l a ) 提取出的酸性水，与有毒贻贝都能够导致小鼠以同一种方式死亡。当 研究人员把无毒贻贝放在含有双鞭甲藻培养基的广口瓶中数日，短期内贻贝迅速 具有毒性，当把它们转移到有无毒生物体的广口瓶中时，有毒贻贝在一周到两周 内能排泄或消除毒素，从而最后确定了双鞭甲藻与有毒贻贝的关系【1 6 切。1 9 6 6 年， 美国科学家s c h a n t z 最先提出了证据证明贻贝( m y t i l u sc a l i f o r n i a n ) 和白塔蛤 g f i 弘h f p w ) 中石房蛤毒素( s a x i t o x i n ，s x x ) - 与亲代麻痹性贝毒素分子的同一性【1 8 】。 1 4 2 产毒甲藻种类 自从1 9 2 7 年美国j 日金山报道了这种毒索的流行病协并指出引起中毒的毒素来 上海水产大学硕士学位论文 自贝类的饵料甲藻以来，科学家不断发现产生p s p 的藻类，日前已知产生p s p 的 主要藻类有双鞭甲藻( d i n o f l a g e l l a t c ) 的亚历山大属c a l e x a n d r i u m ) 中的a c a t e n e l l a 、 at a m a r e n s e 、ap j o n e n s 、a f u n d y e n s e 、am h a u m 、a e o h o r f i c u l a ，裸甲藻属的 c a 蛔觑小s p ，旋沟藻属c o c h l o d i n i u ms p ，p y r o d i n i u mb a h a m e n s e 和生活在淡水区 的蓝绿藻门( b l u e - g r e e na l g a l ) 的水华束丝藻( a p h a n i z o m e n o f l a s e q u a e ) 等，毒素 通过食物链累积于贝体内，进而被人们食用后引起中毒，由于其分布广泛、危害 严重，已成为当今海洋科学研究的热点。 1 4 3 麻痹性贝毒的化学结构及种类 p s p 是由石房蛤毒素及其衍生物组成的一类赤潮生物毒素，是带胍基的三环化 合物，是一种非蛋白性质的毒素，在酸性环境中对温度呈稳定状态，目前已知的 有二十多种，如图2 所示。它们的基本结构是四氢嘌呤环，易溶于水，微溶于甲 醇和乙醇。根据r 4 基团的不同，可将p s p 分为五大类即：氨甲酸酯类毒素( s t x ， n e o ， g t x l 柳、n - 磺酸氨甲酸酯类毒素0 3 1 b 2 ，c 1 c 4 ) 、脱氨甲酰类毒素( d c - ) 、 脱氧脱氨甲酞类毒素( d o - ) 及n - 羟基氨甲酞类毒素( h y ) 【1 9 j ，见表2 。其中氨甲酸酯 类毒素的毒性最强。那些p s p 基本的中毒症状很可能是由它们所引起。n _ 磺氨甲 酸酯类毒素经常存在于肇事的甲藻或贝类中，但由于其较弱的毒性，所以对贝类 整体的毒性贡献不大。脱氨甲酰类毒素经常在某些特定的地理区域被发现，或在 贝体内由前述两类毒素代谢转化而来，它的毒性介于前两者之间。 s t x 对脊椎动物骨髓神经组织及骨胳肌组织有特殊活性，作用部位是细胞膜 的钠通道，s t x 引起钠通道的阻塞从而阻止钠的流入，抑制神经元及感觉神经元 兴奋性。表现为四肢肌肉麻痹、头痛恶心、流涎发烧、皮疹等，牙床、舌、唇和 面部有紧缩感的麻痹症状，逐渐扩展到颈部及四肢，然后扩展至呼吸系统，造成 呼吸肌麻痹，最终窒息死亡。这种阻塞作用不仅对钠离子而且使那些可以取代钠 的其它离子也同样受到影响，其作用机理与河豚毒素极为相似 2 0 l 。p s p 毒性强， 其毒性是眼镜蛇毒性的8 0 倍，其毒力与神经毒气沙林相同，在国际条约中已被列 为化学武器。 上海水产大学硕士学位论文 图2p s p 的分子结构 f i g 2 m o l e c u l a rs t l u c t u r eo f p s p 表2p s p 的种类及名称 t a b 2 s o n o f p s p r 4 r 1r 2r 3 0 0 c n h 2- o o c n i - i s 0 3 。 o o c n h o h0 hh hhhs t x ( g t x s ) b 1h y s t x d e s t xd o g t x l 0 hhhn e 0 ( g t x 6 ) b 2 h v n e o d c n e 0 | o ho s 0 3 hg t x lc 3 |d c g t x l| ho s 0 3 。h g t x 2c 1|d c g 陇d o g t x 2 hh o s o fg 1 x 3 c 2 |d ：g 3d o g t x 3 0 hh o s 0 3 。 g r x 4c 4 | d c g t 4 | n e o ：新石房蛤毒素( n e o s a x i t o x i n ) , d e ：脱氨基甲酰类毒素( d e c a r b a m o y l ) ： g t x ：漆沟藻毒素( g o n y a u t o x i n )d o ：脱氧脱氨基甲酰类毒素( d e o x y d e c a r b a m o y l ) s t x 、n e o 、g t x l - 4 ：氨基甲酸酯类毒素( c a r b a m a t c ) b 1 、b 2 ，c 1 - c 4 ：n 磺酰氨基甲酰类毒素( n - s u l f o c a r b a m o y l ) 。 1 5p s p 的检测 1 5 i 小自鼠生物试验法 1 9 3 7 年由s o m m e r 和m e y e r 建立了p s p 的小白鼠生物试验法( m o u s eb i o a s s a y , m b a ) ，该方法是目前惟一得到国际公认的a o a c 标准生物检测p s p 的方法。目前 世界上大约有8 1 的国家采用小白鼠生物试验法检澳j j p s p 和d s p ( d i a r r h e i cs h e l l f i s h p o i s o n ) ，对t n s p ( n e u “l f o x i cs h e l l f i s hp o i s o n ) 和a s p ( a m n e s t i cs h e l l f i s hp o i s o n ) 酐, j 1 0 上海水产大学硕士学位论文 检测有的国家也采用该方法【2 1 1 。小白鼠生物试验法的检测依据是将结构差异较大， 化学性质也不尽相同的毒素，通过不同的毒素提取技术提取后，对小鼠进行腹腔 注射，根据注射后小鼠的存活时间和中毒症状来对毒性进行评价。由于该方法检 测程序简便、操作时间短、实验费用低等优点，目前已被大多数国家接受并用于 麻痹性贝毒的监测。但利用小白鼠法测p s p 毒素的缺点也非常明显，例如，实验小 鼠需要专门的驯养场所和人员，需要牺牲大量的动物；检出限根据小鼠品系的不 同而有所变动：小鼠死亡时间与毒素水平呈非线性关系；精确度较差；可能有假 阳性的存在；且无法提供毒素的种类、组成及含量等信息。小鼠生物检测法检出 限约1 6 0 r i gs t x e q m 蜮嘶gs t x e q 1 0 0 9 贝肉。 除了小鼠法外还有家蝇生物检测法( h o u s e f l yb i o a s s a y ) 、蝗虫生物分析 法( l o c u s tb i o a s s a y ，l b a ) 以及泥鳅生物检测法。 1 5 - 2 高效液相色谱( i t p l c ) 高效液相色谱法能对p s p 的成分及毒力进行准确的分析和测定，主要有过柱 氧化法和柱前氧化法，其原理基本一致，都是基于毒素在碱性条件下氧化生成荧 光物质，进行荧光检测；区别在于采用的不同洗脱体系和洗脱方法。柱前氧化和 过柱氧化的差别不仅是衍生化前后的分离对象不同，而且氧化手段也不同柱后氧 化比柱前氧化更有前途，此方法无论是谱图、灵敏度还是回收率都比较可取1 2 2 - 2 4 1 与其它方法相比，h p l c 法有着明显的优越性：( 1 ) 灵敏度高，专一性强，检 出限低；( 2 ) 在酸性条件下不稳定的基团如氨甲酰基n 磺基在分析的过程中不会解 离；( 3 ) 缩短了分析时间，通过自动注射技术，能处理更多的样品，便于进行毒素 监控：( 4 ) 能提供关于毒素的更多信息，能测出每1 个组分的具体含量及毒性的大 小，从而有助于比较或了解毒素种类的差异【捌。 h p l c 法是唯一能定性、定量检测出各种毒素组分的技术，h p l c 法发展非常 迅速并极有可能代替小鼠检测法成为主要的检测方法。但该法也存在一些如测定 时需要昂贵的仪器、专业知识和费时等缺点，标准样品的缺乏也妨碍了此方法的 推广。 h p l c 法的检 限比小鼠生物检测法低，h p l c 法的灵敏度是小白鼠分析法的 4 4 0 0 倍，平均灵j z 度小于耻gs t x e q 1 0 0 9 ，最低检测值为o 5 7 5 n gs t x e q 1 0 0 9 1 2 6 i 。 上海水产大学硕士学位论文 1 5 3 液质联用法( l c m s ) e i k e 等印】采用高效离子交换色谱，样品柱后电化学氧化，平行使用荧光和m s 检测器分析p s p 毒素，检测限为8 0 n g s t x e q d l 0 0 9 。该方法的优点是使用 n i - h c o o c h 3 水溶液作为流动相进行阴阳离子交换联合层析，这种流动相能够进行 在线l c m s 分析，并且能够在一次进样层析中分离s t x 、g t x s 、n e o s t x 、d c s t x 等p s p 毒素，省去了a o a c 传统色谱分析方法中烦琐的毒素分离前处理过程。e i k e 还对此方法做了改进，使用叫毛细管电泳) 代替荧光检测器，采用c e m s 联用技 术，分析p s p 毒素，结果比只使用带荧光检测器的l c 高一个数量级。 i - i p i _ c 监测技术往往需要标准毒素，而目前已发现2 0 多种p s p 毒素，多数缺乏 标准毒素，这限制了h p l c 的进一步应用。l c m s 技术很好地解决了这一问题，即 使没有标准毒素，只要知道这种毒素的分子量，就可对其进行定性，而且l c - m s 技术亦可对毒素进行精确定量。 1 5 4 免疫学方法 免疫( i m m u n i t y ) l 拘现代概念是指机体识别和排除抗原性异物的功能，即机体区 分自身与异己( s e l f - n o n s e l f ) 的功能，包括防御、自身稳定和免疫监测三个部分【拥。 免疫学方法如e l i s a ( e n z y m el i n k c di m m u n o s o r b c n ta s s a y ，酶联免疫吸附检测) 、 r i a ( r a d i oi m m u n o a s s a y ，放射免疫分析1 、e i a ( c o m p e t i t i v ee n z y m e i m m u n o a s s a y ，竞争性酶免疫分析) 及s p i a ( s o l i d p h a s ei m m u n o b e a da s s a y ，固态 免疫珠检测1 是以功能性抗原( f u n c t i o n a la n t i g e n ) 刺激兔子产生抗体，然后从兔血清 中提取抗体。抗体可用放射性或荧光物质标记。提取的贝毒加入标记，然后检测 抗体抗原混合物中放射性或荧光强度以测定样品中的毒素含量1 2 9 l 。免疫方法检测 限低于gs t x e q 1 0 0 9 ，根据方法不同有所差异。 对于p s p 的免疫检测技术，自上世纪6 0 年代就有人开始研究；8 0 年代末，建 立了放射性免疫和酶联免疫吸附技术，但都因交叉反应低，不能充分检测所有的 毒素而未能得到广泛的应用：9 0 年代初，c e m b e l l a 删等应用偶联到合成载体上的 s t x 诱导产生多克隆抗体，建立了酶联免疫吸附检测技术。该方法以固定在聚苯 乙烯柱上的s t x 竞争结合与待测样品共存的多克隆抗体，再以辣根过氧化物酶系 统闭塞法指示样品中s t x 含量。 e l i s a 法是检测麻痹性贝毒最常用的一种，该法对s t x 有较高的敏感性，但 上海水产大学硕士学位论文 对一些主要的g t x 类衍生物也有交叉反应，不过对氨酯类的硫酸盐衍生物，如 b i ( g t x - 5 ) 及c 1 一c 4 则不敏感，对n e o s t x 也会产生假阴性反应，但对贝肉中的 s t x 、g t x 一2 、g t x - 3 及d c s t x ，在8 0 m gs t xe q 1 0 0 9 贝肉或低于这个水平都能 检出。 目前国外的一些化学试剂公司( 如r - b i o p h a r m 的r i d a s c r e e n r ； s a x i t o x i nn ! s 1 矗1 已有商品化的成套试剂盒出售。 1 5 5 细胞毒性试验 麻痹性贝毒的细胞毒性测定是利用毒素对细胞的毒性作用来监测毒素是否存 在的一种方法。其实验原理如下：当加入乌本营这种物质时，可增加钠的流入， 此时小鼠的成神经细胞瘤扩张并最后溶解暴露在藜芦丁中。但在麻痹性贝类毒素 存在时，这两种物质的作用可得到抑制，麻痹性贝类毒素通过对细胞钠通道的阻 断，可使细胞形态保持完整1 3 1 皿i 。2 4 h 后，用- - 7 , 酸荧光素和溴化乙锭等荧光分别 处理细胞。在荧光灯下，存活的神经细胞呈亮绿色，而死亡细胞的细胞核显红色。 根据存活细胞占总细胞的百分率可以计算出提取物中毒索含量，该方法的检测最 低限度约为0 4 5 9 9s t x e x i 1 1 0 0 9 ”l 。 采用的细胞为培养的小鼠成神经瘤细胞，根据加入p s p 毒素后其对钠离子内 流的阻滞将拮抗钠通道活化剂的作用，使得细胞不致于因钠离子内流过多而肿胀 死亡的原理，来确定毒素的存在。细胞测定方法的关键问题之一就是保持生活细 胞品系有相当难度。 细胞检测法是建立在贝类毒素对生物细胞影响的基础上。许多实验已证明麻 痹性贝类毒素的致病机理是通过对细胞钠通道的阻断，造成神经系统传输障碍而 产生麻痹作用，在a o a c 的赞助下，