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食品中脱氢乙酸检测方法研究进展 摘要：脱氢乙酸（dha）是一种高效的防腐、防霉剂，在酸、碱条件下均有一定的抑菌能力，尤其对酵母、细菌、霉菌有较强的抑制能力，常用于果汁、酱菜、糕点、淀粉制品、肉制品、发酵豆制品、复合调味料等食品和食品添加剂防腐、防霉。但因其毒性及对人体健康的危害，对其含量的检测日益受到人们的重视。本文针对dha的多种检测方法进行阐述，旨在为dha的检测研发提供一定的参考。 关键词：脱氢乙酸 检测 气相色谱 液相色谱 气相色谱质谱联用 脱氢乙酸学名3-乙酰基-6-甲基-脱（2）氢吡喃-2，4脱（3）氢二酮，是继苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类之后又一代新的广谱食品防腐防霉剂，它基本不受ph的影响，抑菌能力很强，尤其对酵母、细菌、霉菌有较强的抑制能力，常用于果汁、酱菜、糕点、淀粉制品、肉制品、发酵豆制品、复合调味料等食品和食品添加剂防腐、防霉。工业上还用于饲料、日用化妆品、纤维制品、医药以及齿科材料的防腐。但是脱氢乙酸半数至死量大鼠口服为1000mg/kg体重，大量食用脱氢乙酸对人体健康将产生严重的危害。许多国家对脱氢乙酸在食品中的使用量都有明确的规定：日本规定其在食品中添加量不得超过0.5g/kg；美国规定其在食品中最高残留限量为65mg/kg。我国gb 2760-2011 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准中规定：脱氢乙酸可用于果汁、酱菜、糕点、淀粉制品、肉制品、发酵豆制品等几类食品，最大使用量为0.31.0mg/kg。因而，准确地测定食品中脱氢乙酸的含量，有利于指导企业生产，规范企业行为；同时也有利于维护消费者权益，减少不良危害。 检测食品中脱氢乙酸的国标方法有气相色谱法、液相色谱法等，方法各有优缺点。本实验在多种样品前处理方法上进行改进，并相对应建立有效的气相色谱、液相色谱、气相色谱质谱联用等检测方法，为今后食品中脱氢乙酸的检测研发提供一定的参考。 1、气相色谱法 该方法是在gb/t 5009.121-2003食品中脱氢乙酸的测定标准方法上进行改进：将样品酸化后，用乙醚提取脱氢乙酸后浓缩，用气相色谱（附氢火焰离子化检测器）进行分离测定，与标准系列比较定量。 1.1实验部分 1.1.1仪器与主要试剂 气相色谱仪：gc-2010（附氢火焰离子化检测器 fid），日本岛津公司。 脱氢乙酸标准品：纯度99.6%，购自美国。 乙醚：色谱纯，重蒸。 丙酮：色谱纯，重蒸。 脱氢乙酸标准工作溶液：准确称取脱氢乙酸标准品50mg，以丙酮溶解定容于50ml容量瓶中，再以丙酮分别稀释至1g/ml、10g/ml、40g/ml、80g/ml 120g/ml、160g/ml 200g/ml，配制标准工作溶液。 色谱条件： 色谱柱：db-5毛细管柱（30m0.25mm0.25m）； 分流比：10：1，柱流速1.0ml/min 进样口温度：250、检测器温度：300、柱温165； 气流条件：氢气50ml/min、空气400ml/min、氮气40ml/min。 应用上述色谱条件，脱氢乙酸标准品溶液进样，色谱图如下： 1.1.1样品处理 称取510g试样（准确至0.0001g），加10ml饱和氯化钠溶液，2ml盐酸溶液（1+1）酸化，分别以50ml、20ml、20ml乙醚提取三次，合并乙醚层于100ml容量瓶中定容后，分别用20ml饱和氯化钠溶液、50ml碳酸氢钠溶液（10g/l）各洗涤一次，加10g无水硫酸钠，室温下放置30min，取50ml在60水浴下用旋转蒸发仪浓缩至近干，用丙酮定容后供气相色谱测定。 1.1方法讨论 1.1.1色谱条件的选择 脱氢乙酸用气相色谱法测定，与其他同类功能的防腐剂如山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸酯类都有很好的分离度，且在非极性柱、弱极性柱和极性柱中都有很好的响应值。但在实验显示，脱氢乙酸在非极性柱中因低柱温有色谱峰拖尾现象，在极性柱中因柱流失有基线漂移现象，为使定性定量准确，选用了弱极性柱db-5。 1.1.1线性关系 在本实验条件下，脱氢乙酸标准工作液在0.5100g/ml范围内与响应值峰面积有良好的线性关系，相关系数r=0.99995。脱氢乙酸的最低检出浓度为0.2g/ml。 1.1.1准确度与精密度 选用含脱氢乙酸的辣椒酱样品，在样品中添加不同浓度的脱氢乙酸标液，按本方法测定，每一浓度重复测定6次，取平均值，计算平均回收率及变异系数，结果见下表。实验结果显示，本方法回收率满意，相对标准偏差范围小于10%，重复性好，符合检测要求。 加标浓度（mg/kg） 平均回收 率（%） 精密度 rsd（%） 1.0 83.2 6.8 5.0 89.6 5.6 10.0 90.3 4.7 30.0 91.6 3.6 50.0 102.4 3.4 2、液相色谱法 该方法是在gb/t 23377-2009食品中脱氢乙酸的测定 高效液相色谱法标准方法上进行改进：用氢氧化钠溶液提取试样中的脱氢乙酸，经脱脂、去蛋白处理后，用高效液相色谱紫外检测器测定，与标准系列比较定量。 2.1实验部分 2.1.1仪器与主要试剂 液相色谱仪：lc-1260（二级管阵列检测器 dad），美国安捷伦公司。 脱氢乙酸标准品：纯度99.6%，购自美国。 甲醇：色谱纯。 乙酸铵溶液（0.02mol/l）：分析纯，称取1.54g乙酸铵用氨水（1+1）调节ph至9.0，加水至1000ml溶液，经0.45m滤膜过滤。 2.1.2色谱条件 色谱柱：ecosil-c18柱 （5m，250mm4.6mm）； 流动相：甲醇+0.02mol/l乙酸铵（5+95，v/v） 流速：1.0ml/min 柱温：40 检测波长：293nm 应用上述色谱条件，脱氢乙酸标准品溶液进样，色谱图如下： 2.1.3样品处理 称取510g试样（准确至0.0001g），加50ml水，用氢氧化钠溶液（8g/l）调节ph至7.2，加入5ml乙酸锌溶液（220g/l），5ml亚铁氰化钾溶液（106g/l），超声提取40min，定容至100ml，静置30min过0.45m滤膜，供液相色谱测定。 2.2方法讨论 2.2.1色谱条件选择 在gb/t 23377-2009国标方法中，流动项的选择为甲醇+0.02mol/l乙酸铵（10+90，v/v）。在实际样品的检测中，考虑到食品中其他添加剂对于脱氢乙酸检测（如山梨酸、糖精钠等）的影响，能过对不同比例流动相的实验，发现流动相比例为甲醇+0.02mol/l乙酸铵（5+95，v/v）优于国标方法条件，结果见下表。 2.2.2线性关系 在本实验条件下，脱氢乙酸标准工作液在0.5100g/ml范围内与响应值峰面积有良好的线性关系，相关系数r=0.99999。脱氢乙酸的最低检出浓度为0.1g/ml。 2.2.3准确度与精密度 参照1.2.3，选用同一辣椒酱样品，按本方法测定，做加标实验，每一浓度重复测定6次，结果见下表。实验结果显示，本方法回收率满意，相对标准偏差范围小于10%，重复性好，符合检测要求。 3、气相色谱质谱联用法 目前尚无气相色谱质谱联用测定食品中脱氢乙酸的国标方法，笔者是根据本实验室进行实验建立的方法：试样经乙醚提取，用气相色谱进行分离，特征离子峰进行定性定量。 3.1实验部分 3.1.1仪器与主要试剂 气质联用仪：gcms-7890a-5975c，美国安捷伦公司。 脱氢乙酸标准品：纯度99.6%，购自美国。 正已烷：分析纯。 乙醚：色谱纯，重蒸。 脱氢乙酸标准工作溶液：准确称取脱氢乙酸标准品50mg，以乙醚溶解定容于50ml容量瓶中，再以乙醚分别稀释至1g/ml、10g/ml、40g/ml、80g/ml 120g/ml、160g/ml 200g/ml，配制标准工作溶液。 3.1.2色谱条件 载气：高纯氦气（99.999%）； 色谱柱：db-5ms毛细管柱（30m0.25mm0.25m）； 柱流速：1.0 ml/min； 汽化室温度：250、柱温程序：初始温度150，保持0.5min，以10/min速率升温至180，保持6min。 3.1.3 质谱条件 传输线温度：220；离子源温度：200；离子化方式：ei；电子能量：70ev；延迟时间2.0 min；检测方式：全扫描，质量范围：m/z 25300。 应用上述质谱条件，脱氢乙酸标准品溶液进样，质谱图如下： 3.2.1样品处理 称取510g试样（准确至0.0001g），加35ml水、2ml氢氧化钠溶液（20g/l），超声提取20 min，用水定容至50ml，加10ml正己烷提取一次，弃去正己烷层，再加1ml盐酸（1+1）酸化，准确加入10ml乙醚振摇5min，静置10min，取上清液供质谱测定。 3.2方法讨论 3.2.1质谱条件的选择 根据脱氢乙酸在气相色谱上的良好响应情况，用质谱测定时，仍选用的弱极性柱db-5ms柱。检测方式选择全扫描、选择离子扫描皆可，本文选择了全扫描。 3.2.2线性关系 在本实验条件下，脱氢乙酸标准工作液在0.5100g/ml范围内与响应值峰面积有良好的线性关系，相关系数r=0.99997。脱氢乙酸的最低检出浓度为0.2g/ml。 3.2.3准确度与精密度 选用同一辣椒酱样品，按本方法测定，做加标实验，每一浓度重复测定6次，结果见下表。实验结果显示，本方法回收率满意，相对标准偏差范围小于10%，重复性好，符合检测要求