（遗传学专业论文）醋酸棉酚对小鼠精母细胞中染色体配对行为的影响.pdf

中文摘要 y 7 31 j 3 9 5 联会复合体( s y n a p e o n e m a lc o m p l e x ，s c ) 是真核生物减数分裂前期i 同源染色体配对时形 成的一种核内临时结构。它与同源染色体联会、遗传交换、染色体分离密切相关。s c 的研究 不但丰富了人们对减数分裂过程亚显微细节的了解，而且在真核生物染色体重排、医学细胞 遗传学、遗传毒理学的研究中，也得到了普遍的重视和广泛的应用。 棉酚是我国科技人员首先证明的抗生精药物，己在临床试用多年，但迄今为止，对棉酚 是否导致s c 异常，进而导致同源染色体异常分离或不分离等问题尚无系统报道。本研究采用 常规骨髓细胞和性细胞制备染色体，表面铺展硝酸银染色技术制备s c 标本，利用光镜和电镜 观察染色体和s c 的结构和配对情况，分别对对照雄性小鼠( 未灌胃醋酸棉酚) 和处理雄性小 鼠( 灌胃醋酸棉酚) 体细胞和性细胞染色体以及s c 进行了分析。旨在从显徽和亚显微水平为 棉酚导致的不育机理提供依据。 主要研究结果如下： ( 1 ) 建立了对照小鼠精母细胞s c 组型，并与有丝分裂中期染色体组型进行比较，结果十 分吻合( 相对长度相关系数为o 9 7 5 4 ) 。说明s c 组型研究是精确鉴别精子发生过程中染色体 畸变的必不可少的基础工作，是探讨雄性不育的重要手段之一。 ( 2 ) 运用先进的染色体荧光显带技术对对照小鼠中期染色体进行分析获得精细的类似 于g 带带纹，由此建立了精确的小鼠中期染色体d a p i 带核型图，为小鼠的细胞遗传学研究提 供了一种新的方法。 ( 3 ) 通过对对照雄性小鼠常染色体和性染色体s c 形成过程晦电镜观察，不但为减数分裂 过程中同源染色体的配对行为提供直观依据，加深了对- 戚数分裂过程亚显微细节的了解，而 且为处理小鼠的s c 畸变类型提供对照参考。 ( 4 ) 棉酚能够引起s c 异常，s c s 畸变主要有以下几种：s c 断裂；侧轴断裂；不联 会；多价体；异源联会：x y 误配；x y 分离；联会紊乱。m i 期染色体畸变类型主 要有：常染色体单价体；常染色体等位染色单体断裂：常染色体多价体；性染色体 单价体。 a b s t r a c t s y n a p t o n e m a ic o m p l e x ( s o ) i s at r a n s i e n ts t r u c t u r ew h i c h h a p p e n e d i ne u k a r y o t i cn u c l e id u r i n g t h ef i r s tm e i o t i cd i v i s i o nw h e nh o m o l o g o u sc h r o m o s o m e sa r e p a i r i n g t h e s t r u c t u r ei s c l o s e l y r e l a t e dw i t hh o m o l o g o u sc h r o m o s o m e s s y n a p s i s ，r e c o m b i n a t i o n a n ds e g r e g a t i o n t h es t u d i e so ns c m a yn o to n l yc o n t r i b u t et ot h ek n o w l e d g eo fs u b m i c r o s c o p i cs t r u c t u r ei nm e i o s i sb u ta l s oh a sb e e n w i d e l yu s e di nt h es t u d i e so ne u k a r y o t i cc h r o m o s o m er e a r r a n g e m e n t ，m e d i c a lc y t o g e n e t i c sa n d g e n e t i ct o x i c o l o g y g o s s y p o lw a sr e p o s e dm a l ea n t i f e r t i l i t ya g e n tb yc h i n e s es c i e n t i s t s a tf i r s t i th a sn o tb e e n s y s t e m a t i c a l l ys t u d i e di ft h eg o s s y p o lr e s u l t e di nt h ea b e r r a t i o no fs c t h ec o n v e n t i o n a lm e t h o d s w e r ea p p l m di np r e p a r i n gc h r o m o s o m e sf r o mm a r r o wc e l la n ds e xc e l l ，t h es c sw e r e p r e p a r e db y s u r f a c es p r e a d i n g - s i l v e r ss t a i n i n gt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) t e c h n i q u e t h es t r u c t u r e a n d p a i r i n g o fc h r o m o s o m e sa n ds c sf r o mc o n t r o lm a l e m i c e ( u n t r e a t e db yg o s s y p 0 1 ) a n d e x p e r i m e n tm i c e ( t r e a t e db yg o s s y p 0 1 ) w e r eo b s e r v e db yl i g h tm i c r o s c o p e ( l m ) a n dt e m t h e r e s u l t sa r er e p o s e da sf o l l o w s ： ( 1 ) t h es ck a r y o t y p ew 0 sc o n s t r u c t e di ns p e r m a t o c y t e so f u n t r e a t e d m i c ea g r e e dc l o s e l yw i t h t h a to f m i m t i cc h r o m o s o m e s ( r e l a t e dc o e f f i c i e n to f m e a nr e l a i v el e n g t h sw a s 0 9 7 5 4 ) ，i ts h o w e d t h a t s c s k a r y o t y p ea n a l y s i sw a si m p o r t a n t t or e c o g n i t i o nc h r o m o s o m a la b e r r a t i o n si ns p e r m a t o g e n e s i s i t w a so n eo f t h em o s t i m p o r t a n tm e t h o d s i ns t u d ym a l ei n f e r t i l i t y ( 2 ) m i t o t i cm e t a p h a s ec h r o m o s o m e s i nu n t r e a t e dm o u s ew e r ei d e n t i f i e dh yan e wc h r o m o s o m a l f l u o r e s c e n c eb a n d i n gt e c h n i q u ec o m b i n i n g4 ，6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e ( d a p i ) s t a i n i n gw i t h i m a g ea n a l y s i s c l e a rd a p im u l t i p l eb a n d sl i k eg - b a n d sc o u l db ep r o d u c e d b a s e do nt h er e s u l t s ， t h ec l e a ra n da c c u r a t ed a p i b a n d i n gk a r y o t y p eo fm o u s em e t a p h a s ec h r o m o s o m e sw a se s t a b l i s h e d ， t h e t e c h n i q u e w a sc o n s i d e r e da san e wm e t h o di ne y t o g e n e t i c ss t u d i e so f m o u s e ( 3 ) t h ea u t o s o m a la n ds e xs c sd e v e l o p m e n t si ns p e r m a t o c y t e so fc o n t r o lm a l em i c ew e r e i i i o b s e r v e db yt e m i tc o u l dn o to n l ys u p p l ys o m ee v i d e n c ef o rp a i r i n gb e h a v i o u ro f h o m o l o g ya n d d e e p e nt h ec o m p r e h e n s i o no fm e i o s i s ，b u ta l s oo f f e rr e f e r e n c e st ov i s i b l es c sd a m a g ee x a m p l e s a f t e rt r e a t m e n t b yg o s s y p 0 1 ( 4 ) s ca b e r r a t i o n si ns p e r m a t o e y t eo ft r e a t e dm a l em i c ec o u l db ei n d u c e db yg o s s y p 0 1 s c a b n o r m a l i t i e sw e r ec l a s s i f i e da sv a r i o u sf o r m so f b r e a k a g ea n ds y n a p s i se r r o t s i ti n c l u d e dv a r i o u s f o r m sa sf o l l o w s ：b r e a k a g eo ft h es c ；l a t e r a le l e m e n tb r e a k ；a s y n a p s i s ；m u l t i a x i a l c o n f i g u r a t i o n ( m a c ) ；n o n h o m o l o g o u ss y n a p s i s ；x y - m i s p a i r i n g ；x ys e p a r a t i o n ( xa n d yi ns e p a r a t ea r e a so ft h en u c l e u sw h e n t h e ys h o u l db ep a i r e d ) ：s y n a p s i si r r e g u l a r i t y t h e c h r o m o s o m e sa b n o r m a l i t i e si nm is t a g ew e r es h o w e da sf o l l o w s ：u n i v a l e n t so fa u t o s o m e s ； i s o c h r o m a t i db r e a ko f a u t o s o m e s ；m u l t i v a l e n t ；u n i v a l e n to f x y ( 5 ) i ti so b v i o u st h a tm o r es e r i o u sd a m a g e sc o u l db eo b s e r v e da st h ei n c r e a s e dd o s a g eo r p r o l o n g e dt r e a t e dt i m eo fg o s s y p o l ，b u tn os p e c i a la b e r r a t i o nf o r m sw e r ep r o d u c e di nh i 曲d o s a g e g o s s y p 0 1 ( 6 ) i ti sc o n c l u d e dt h a tw ec a l le v a l u a t et h eg e n e t i cr i s ki n d u c e db yg o s s y p o li nm a l e sb ys c a n a l y s i s t h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h eb e h a v i o ro fs ca n dt h em e c h a n i s mo fi n f e r t i l i t yw a s d i s c u s s e d o u rr e s u h sa r ec o n s i d e r e da sar e l i a b l ee v i d e n c ef o r c y t o l o g i c a l s t u d i e so f g o s s y p o l i n d u c e di n f e r t i l i t y k e yw o r d s ：m o u s e ；g o s s y p o l ；s y n a p t o n e m a lc o m p l e x ；c h r o m o s o m ea b e r r a t i o n s ；i n f e r t i l i t y i v 1前言 1 1 联会复合体概述 联会复合体( s y n a p t o n e m a lc o m p l e x ，s c ) 是指同源染色体在减数分裂前期配对形成的一 种特殊结构。s c 的亚显徽结构包括两个侧 “4 ：组5 ：3 ( 1 a t e r a le l e m e m ，l e ) 和一个中央组分( c e n t r a l e l e m e m ，c z ) ，在l e 和c e 之间有横纤丝( t r a n s v e r s ef i l a m e n t ，t f ) 相连，染色质纤维以l o o p 形式排列在s c 两侧，中央组分上分布有电子密度高的球状或椭圆形小体。些实验证明这些 电子密度商的小体与基因重组有关，称之为重组节( r e c o m b i n a t i o nn o d u l e ，r n ) “1 ( 图1 ) 。1 。 其主要成分是蛋白质 3 - 5 os c 开始形成于偶线期，成熟于粗线期，解体于双线期( 图2 ) “1 ， 图版1 联会复合体结构模型( 引自p a g e 等) t 3 示侧生组分，中央组分，横纤丝；底部为横纤丝蛋白( z i p l p 和s c p i 蛋白) ； 蓝色( c o h e s i n s c o n d e n s i n s 蛋白) 和绿色代表侧生组分上的蛋白 f i g 1m o d e lo fs cs t r u c t u r e s h o w ni sac l o s ss e e t b no fas e g m e n to ft h es cw i t hl a t e r a le | e m e n t s ( l e ) t r a n s v e r b ef i l a m e n t s c e n t r a l e l e m e n t c e ) 。a n dc e n t r a lr e g i o n t h ea r r a n g e m e n to ft r a n s v e r s ef i l a m e n tp r o t e i n s a sd e t e r m i n e d e x p e r i m e n t a l l yf o rz i p l pa n d s c p l i ss h o w na tb o t t o m a l s os h o w ni sah y p o t h e t i c a la r r a n g e m e n t 。f e o h e s i n s c o n d e n s i n s ( b l u eo v a 坤a n do t h e rl ep r o t e i n s ( g r e e no v a 埘a l o n gt h el e s 母本姐妹 染色单体 父本姐妹 染色单体 图版2 联会复合体形成过程( 引i 自a l b e d s 等) ”1 细线期( 同源轴心相互靠近) ，偶线期( 联会开始) ，粗线期( 联会完成) 双线期( 解联会) ，终变期( 完全解联会) f i g 2a s c h e m a t i cf i g u r es h o w i n gt h es u c c e s s i v es t a g e so fm e i o t i cp r o p h a s sa sd e f i n e do nt h eb a s i so f m o r p h o l o g i c a lc h a n g e so ft h es c ：l e p t o t e n e ( p m t a i n a c e o u sa x e ss t a r tt of o r ma l o n gt h ec h r o m o s o m e s ) z y g o t e n e ( s t a r to f s y n a p s i so f t h eh o m o l o g u e s ) p a c h y t a n e ( s y n a p s l si sc o m p l e t e da n dt h es c e x t e n d sf m m t e l o m e r at ot e l o m e r e ) d i p l o t e n e ( s cd i s a s s e m b l e s ) a n dd i a k i n e s i s ( s c sa r ec o m p l e t e l yd i s a s s e m b l e d ) ( f r o ma l b e r t se ta 1 9 8 9 ) s c 的形成标志着同源染色体联会的顺利实现而s c 的解体则和同源染色体的逐步分离相联系 “。”。s c 的生物学功能主要有两个方面：一是作为同源染色体联会时二价体的轴心，染色 质以s c 为支架以 o o p 环的形式向四周呈放射状排列s c 的作用类似于间期细胞核中核骨架 和中期染色体的染色体骨架，在稳定真核生物减数分裂中染色体配对起很重要作用；二是s c 参与同源染色体的联会和交换。为染色体重组提供了结构基础“。1 。 近些年来，人们对s c 的研究主要集中在s c 的形成、同源染色体配对及重组的分子机制”1 ， s c 蛋白及其编码基因的筛选，克隆鉴定和特性分析“o 。”等方面，同时s c 在遗传毒理学方面 的应用研究也得到了长足的发展“1 。下面就国内外在该方面的研究做一概述。 1 2 s c 分析在遗传毒理学中的应用 在遗传毒理学测定工作中，环境诱变剂对减数分裂染色体的影响，特别是诱发的相互易 位，是一类稳定型畸变。以往常通过观察初级精母细胞终变期中期i 染色体畸变来进行。 但是这种常规方法有一定的局限：一些损伤严重的细胞往往停滞在前期，在中期i 时无法 检测到它的存在；终变期中期i 染色体高度浓缩某些畸变类型不易识别；较复杂的 染色体易位、微小的缺失或重复也难以确认。所以其实际应用价值有一定的限制。因而寻找 更精确的鉴别方法是十分必要的 1 6 1 o 1 。2 ，1 国外研究情况 8 0 年代中期，国外已开始把联会复合体结构畸变作为辐射遗传学及遗传毒理学的一项重 要指标。c a w o o d 等人利用s c s 方法检测x 射线照射后的叙利亚仓鼠精原干细胞的易位率， 其检出率较常规方法高近一倍“”。k a l i k t n s k a y a 等人分别对正常雄鼠的不育f 1 代和受辐射 的雄性小鼠进行了s c s 和常规染色体分析，结果也表明s c s 分析的多价体发生率明显高于常 规方法的分析结果 1 8 1 0 随后，a l l e n 等人于1 9 8 7 年利用s c s 方法检测了化学药物诱发雄性小 鼠生殖细胞内各种s c s 畸变 1 9 , 2 0 并将所观察到的s c 畸变类型分为三类：侧生组分断裂、 断裂和片断化；联会失败、不完全联会解联会；多轴构型以及异源联会。从而验证了化 学药物可以诱发非整倍性以及染色体配对紊乱的观点。b a c k e r 等人。”利用环磷酰胺处理雄小 鼠，评估s c 畸变和随后的分裂中期( 包括mi 和m i i ) 染色体畸变之间的定性和定量关系： s c 畸变和mi 期、m i i 期的畸变与剂量呈正相关； s c 断裂片段化、等位染色单体断裂 片段化和mi 期成链成环呈正相关；不联会和mi 期染色单体断裂片段化里正相关：s c 多轴式构型和mi 期成链成环、m i i 期超倍性呈正相关。从而证明了s c 可以作为分析染色体 畸变的一项高度敏感的指标。在上述工作的基础上，s c 分析已开始应用于检测不同化学药物、 电离辐射等所造成的各种染色体畸变，从而发现一些减数分裂中未观察到的畸变类型，获得了 许多富有启发性的结果。 p o o r m a n - a l l e n 等人采用腹腔和睾丸内注射两种方式分析了拟辐射化台物一争光霉素 ( b l e o m y c i nb l m ) 对于雄小鼠s c 和mi 期染色体配对的影响。”。研究发现，利用s c 分析能够 灵敏检测出极微量化合物对于小鼠生殖细胞中遗传物质的损伤证明了这种畸变与辐射所造 成的畸变类型相似。b a c k e r 等人进一步探讨了s c s 分析方法在辐射遗传研究中的应用价值， 以及s c 畸变与染色体畸变之间的可能对应关系 2 3 3 。他们在电镜下比较系统地研究了辐射引起 的初级精母细胞的s c s 畸变类型及发生频率。与mi 期染色体畸变分析结果相比较发现：处于 前减数分裂s 期和前期i 的生殖细胞受照射后，s c s 畸变类型及发生频率与mi 染色体畸变不 一致，s c s 畸变更为复杂、类型更多。精原干细胞受照后，在随后分裂的初级精母细胞中s c s 检测到的畸变率明显高于mi 染色体检测到的畸变率，出现了其它一些在mi 期没有检测到的 畸变类型。a l l e n 利用s c s 方法主要检测x 射线照射后的亚美尼亚仓鼠( a r m e n i a n h a m s t e r s ) 性染色体的假常染色体区的变化。发现端粒和或交换区出现联会畸变的频率较高1 ，出现 断裂、桥、不联会等特定畸变类型。b o r o d i n 等人。”发现小鼠减数分裂前间期受到低剂量辐 射预处理之后。可以明显地改变高剂量辐射对于小鼠s c s 的影响，即减少了粗线期可见的碎 片，多轴构型等。 另外，t a p i a 等人“和p i n a - c a l v a 啷1 分别检测了龙舌兰酒( t e q u i l a ) 和白兰地对于小 鼠s c s 的影响主要观察到兰种畸变类型，不联会、断裂和多轴结构。与常规检测方法所得 结果相比，s c 畸变率显著高于对照组。 干扰微管形成的化合物引起的遗传效应与由烷基化试剂所产生的效应相似。t e p p e r b e r g 等人- ”1 发现秋水仙素不仅阻止了植物减数分裂中同源染色体的联会，也造成染色体单价化 以及交叉频率的减少，而且在动物中，尤其是在雄小鼠的粗线期诱发了多种异常联会类型。 秋水仙素诱发的s c 畸变包括单价体，异源联会和联会阻遏。并且证明粗线期可见的单价体以 及m 【期同源染色体的不分离和m i i 的超倍体是由秋水仙素诱发细线期偶线期联会失败产生 的。在早粗线期所获得s c 畸变率( 每个细胞内的数量和类型以及受损细胞的频率) 都超出了 晚粗线期畸变率的3 5 倍。大部分严重受损细胞存在丢失现象，表明在早粗线期存在减数分 裂控制点。 b h a g i r a t h 等0 0 ，川用棉酚( 3 0 m g k g d 剂量) 处理雄大鼠7 0 天，然后恢复1 0 2 4 天之后， 在光学显徽镜下研究了s c 的畸变情况，未发现异常。 随着研究工作的深入，科学家开始探讨诱变剂对雌性动物自身和其后代减数分裂染色体 的影响。j o h a n n i s s o n 等人研究了电离辐射所造成雌小鼠中的联会畸变 3 2 3 。怀孕1 6 。1 7 的小 鼠受到辐射( 2 g y ) 出现s c 碎片化现象，导致育性降低。p u j o l 等人b ”进一步研究了怀孕大 4 鼠( r a t t u sn o r v e g i c u s ) 内胎儿受到高剂量x 射线( 5g y ) 照射后所诱发的s c 畸变，畸变类 型主要有联会异常、染色体重排和核仁裂解。m a r t i n e z f l o r e s0 4 1 等人分别对受电离辐射的 幼年和成年雌鼠( r a t t u sn o r v e g i c u s ) f 1 代进行了s c s 和常规染色体分析，也表明s o s 分析 的育性降低发生率明显高于常规方法的分析结果。m a r t i n e z f l o r e s 等人利用s o s 方法精确检 测青春期( 年龄在1 6 2 0 天) 雌大鼠受不同剂量( 0 ，1 ，2g y ) x r a y s 照射后，其f 1 代雌 性胎儿受辐射后s c s 畸变类型，预测f l 雌鼠育性受到影响的可能情况 3 5 3 。 由化学药物所诱发雌性哺乳动物联会畸变资料首先来自于c u s i d o 等人所作的环磷酰胺对 妊娠期雌大f l l l l 自jl , 联会复合体结构的影响( 3 6 q 当雌鼠内的大部分生殖细胞处于增生期时，在 妊娠的第十六天注射环磷酰胺可以明显地增加s c 、核仁裂解频率。并且频率随剂量增加而增 加。随后，j o h a n n i s s o n 等人深入研究了环磷酰胺对于卵母细胞联会复合体的损伤程度 3 7 i 在雌鼠妊娠的第十三天，注射了高，中，低三种不同剂量的环磷酰胺( 1 0 ，3 0 ，5 0 m g k g 体重) ， 发现在第十七天粗线期细胞中，s c 畸变量明显高于对照组。在中、高剂量下，单价体频率和 处理剂量之间呈线性正比关系。 1 2 2 国内研究情况 我国近年也有少数有关电离辐射，激光及化学毒物诱发联会复合体畸变的报导。冯蜀举 和施立明。”曾以1 0 0 0 伦琴y 一射线照射德国蜚蠊( b l a t t e l l ag e r m a n i c a ) ，在表面铺展的s c 标本上，可以观察到辐射诱发s c 的缺失、重复、倒位、易位、提前分离等各种畸变，畸变率 和照射剂量呈线性正比关系。吴成仓等以激光诱导家蚕孤雌生殖，利用s c 分析在浓普斑雌蚕 个体中发现染色体易位片段f 3 9 王亚梅n 6 , 4 ”用x 射线诱变小鼠生殖缅胞，在表面铺展精母 细胞制备的s c 标本上，可观察到s c 多种畸变类型。主要有s c s 断片、s c s 的侧生组分断裂； x 、y 配对异常： 常染色体s c s 联会阻滞；不联会联会失败；缺失；桥一一条、两 条或多条s c s 侧生组分之问的丝状纤维联系 多轴连接： 三价体：四价体或多价体； 常染色体s o s 与x 、y 末端或中部连接，在与中期i 染色体畸变结果相比发现：处于前减数 分裂s 期和前期i 的生殖细胞受x 射线照射后，s c s 畸变类型的发生率明显高于中期i 染色体 检测的畸变率，说明一些畸变类型在未达到中期i 细胞时，就已死亡。周汝敏等“”以抗有丝 分裂化合物秋水仙素和对苯= 酚分别处理雄性小鼠，二种化合物都诱发减数分裂前期各种特 殊倾向性的联会复合体损伤，如联会复合体断裂、联会异常等李鸿业等h 2 3 以高于临床治疗 常用剂量的h e n e 激光照射两组雄性小鼠左侧睾丸电镜观察以微铺展技术制备的精母细胞 联会复合体，联会复合体的畸变类型，包括断裂、单侧侧生组分( le ) 断裂、不联会、联会紊 乱及圆环等。曹能等“”用氩离子和h e - n e 激光分别照射活体雄性小鼠睾丸，光镜下观察了精 母细胞中联会复合体异常变化。亚离子激光照射后诱发的s c s 畸变类型，有同源染色体异常配 对和倒位，联会复合体断裂等，而h e n e 激光诱发s c s 畸变主要有染色体断裂、缺失以及特殊 的“8 ”形和圆形。 1 2 3s c 分析技术的优越性 综上所述，s c 损伤是染色体损伤的信号之一，s c 畸变分析，可以作为监测减数分裂过程 中同源染色体联会异常所引起的染色体异常分离和染色体结构畸变的手段。在遗传毒理学研 究中，s c 分析要比中期i 染色体分析灵敏得多：一方面是因为粗线期时多价体的存在不依赖 于交叉的发生，只需要联会事件本身3 。另一方面粗线期染色体较长，微小的缺失或重复、 复杂的易位更易于识别。同时光镜与电镜相结合分析染色体畸变精确性大大提高。这些原因 使得s c s 检测到更多的染色体畸变。随着s c 分析技术的不断改进，在研究环境诱变剂对染色 体配对以及和配对有关的d n a 合成的影响方面，s c 分析有可能成为一种新的常用的灵敏的 检测指标。 1 3 研究目的、意义及方案 2 0 世纪5 0 年代在我国河北、河南、山东、湖北、江苏等产棉地区流行一种“烧热病”， 患了这种病的人浑身发烧，无力，消瘦，劳动力丧失，女病人严重时，会发生闭经常常有许多家 庭不能生儿育女。经过大量研究，才发现是生棉籽油造成的，经济条件越好的家庭，食用棉籽 油越多，发病人数越多，病情越严重。1 9 5 7 年我国首次报道了在食用粗制生棉籽油的人群中发 生不育的现象，并指出这可能与棉籽油含棉酚有关。2 0 世纪7 0 年代，从棉籽油中提炼出抗生育 的有效成分一棉酚，经动物实验证实，确实能引起男性不育。从此，研究棉酚作为一种男性避孕 药成为国内外的一个研究热门4 “”。 棉酚是锦葵科植物棉花的根、茎和种子所含的一种黄色多元酚类有毒化合物。棉酚在棉 籽中含量为0 1 5 i 8 ，其中棉壳中含0 0 0 5 0 0 1 ，棉仁中含0 5 2 5 “”。棉酚最初 由l o r l l d e l e 于1 8 8 6 年以精练冷榨棉籽油的皂脚中分离出来，其后于1 8 9 9 年 f a c e l y t e n 通过利 用醋酸沉淀棉酚而得到纯化的醋酸棉酚，而棉酚的结构是4 0 年后由a d a m s 和他的学生于1 9 3 8 年通过大量的化学实验推导出来的，二十年后e d w a v d s 首次合成了棉酚，并验证了a d a m s 得出 的结构式。1 9 3 8 年a d a m s 等提出棉酚化学结构是8 ，8 一二醛基一1 ，l ，6 ，6 ，7 ，7 一六羟基- 5 ，5 一二异丙基一3 ，3 一二甲基一2 ，2 一联蔡。这个结构在1 9 5 7 1 9 5 8 年e d w a r d 等用全合成棉酚所 证实嘲。它的分子量为5 1 8 5 4 ( c 。h 。o 。) ，化学结构式如下所示。 ：擎潍 鼬舞冁m 八孙 式1 作为多元酚类的化合物，棉酚可以通过对膜基质及蛋白质分子的结合，以及通过负离子 自由基机制对膜相结构的破坏和对电子传递体系的干扰，从多方面干扰细胞的代谢，尤其是 与c a ”依赖性蛋白激酶有关的代谢。棉酚表现有抗生育，抗炎，抗肿瘤，抗血管内皮依赖性血 管扩张，抗病毒，抗寄生虫活性及多种不同的毒性”，”。1 。 自2 0 世纪7 0 年代至今人们对棉酚能否用作男性避孕药及其抗生育作用机制进行研究。 雄鼠在摄用棉酚期间，先后发生精子活动度下降，附睾尾精子淤积，精子线粒体膜结构异常 或丢失，胞浆膜及尾部微管结构损伤或丢失。继以精子发生障碍，睾丸及副性腺重量下降， 睾丸三磷酸腺苷( a t p ) 酶，丝氨酸脱氨酶( s d b ) ，乳酸脱氢酶( l d h ) ，果糖酶，葡萄糖l ，6 二磷酸酶活性下降。睾丸及副性腺对z n “摄入明显减少，以翠酮为底物的5 。还原酶及3 a 羟类固醇脱氢酶活性显著降低。在体外，棉酚可以直接馊精子活动度丢失，抑制糖子对蔼萄 7 糖的摄入和利用，并使l d h - x 活性及顶体酶活性下降，精浆唾液酰转移酶活性下降。棉酚也 可以抑制雌性动物的生殖。肌肉注射妊娠后期的大鼠，棉酚可以明显降低胎盘组织内的单胺 氧化酶活性，大剂量棉酚扰乱雌性哺乳动物的动情周期，阻止受精卵发育降低着床率对 卵巢内分泌及子宫，胎盘的毒性均已见报道。 在亚细胞水平的观察显示精子细胞和精母细胞可出现超微结构损伤，核膜皱缩变形：内质 网扩张和小泡化：胞质水肿和出现溶酶体：顶体一核帽系统肿胀、颗粒溶解和脱落。其中线粒体 ( 尤其是睾丸特有的乳酸脱氢酶x ) 对棉酚最为敏感 $ 3 , 5 4 ) 6 1 3 o 棉酚可导致大鼠和人精子细胞及 附睾精子线粒体肿胀、空泡化脊变形、消失。螺旋鞘线粒体排列紊乱，以至螺旋鞘不能正常形 成酷”。同时，棉酚可以选择性地抑制人、小鼠和其它啮齿类动物睾丸中各种酶的活性，棉酚能 使线粒体中乳酸脱氢酶一x 以及谷胱甘肽s 一转移酶活性明显降减或消失。 棉酚在遗传毒性方面的研究主要有| 三l 下这些方面h ”。棉酚对d n a 结构和复制的影响。 当棉酚体外加入到大鼠肝d n a 或核的制各产物中时，可导致d n a 降解及消失。棉酚还可在体 外抑制中国仓鼠卵巢细胞，人的淋巴细胞和肿瘤细胞的d n a 合成，体内抑制服用棉酚的大鼠 精原细胞，并使这些细胞滞留于s 期。棉酚所做的微生物检测发现醋酸棉酚不是突变剂。 染色体畸变。在人的白细胞，中国仓鼠成纤维细胞或c h o 细胞培养中，棉酚不诱导产生染 色体倍性改变或畸变。在有7 例男性参加的棉酚临床实验中，服药前后的淋巴细胞染色体畸 变率相似，u 例健康人服用标准剂量的棉酚3 0 4 8 个月，棉酚对其核仁组织区数目或近端着 丝粒分布无明显影响。总之棉酚在低的或临床相关剂量不诱导染色体畸变或倍性变化。 姊妹染色单体交换( s c e ) 。用1 4 0 u g m l 棉酚处理人外周血白细胞，细胞增殖显著下降，所 有细胞的s c e 率都在正常范围内。利用不同动物所做的棉酚实验中，其s c e 率变化各不相同。 微核( 心) 实验。人白细胞与4 0 u g m l 棉酚共同培养，其心有轻微增加，但所有值都在正 常范围内。用数m n 的方法检测到，棉酚对雄性小鼠生殖细胞染色体由亚硝基甲基脲( 用烷化 剂f o t r i n 致染色体断裂效应加强) 引起的致突变效应有明显保护作用。 近年来，利用比较先进的研究手段，对棉酚的研究进入了一个更广泛的领域。最突出的 是棉酚诱导的生精细胞调亡的研究以及对非正常生理状况机体的药物效应研究。棉酚与细胞 捅亡的研究成果主要有以下“”：诱导生殖细胞调亡的棉酚浓度都在1 o o u m 以上的高剂量水 8 平。即高浓度棉酚通过与细胞生长相关的酶或功能蛋白相互作用使细胞凋亡致死，但至今没 有诱发细胞恶性增生的报道。棉酚诱发生精细胞凋亡的诱因( 抑制p k c 活性) ，凋亡过程中 c f o s 和c m y c 蛋白的双向反应( 下调和上调) 及对细胞周期蛋白的影响性都与体细胞发生的 凋亡类似，说明生殖细胞可能与体细胞菇享同一凋亡机制，目前尚未发现生殖稀薄阿有特殊 的凋亡步骤。棉酚极有可能与p k c ，c - f o s c - m y c 蛋白的功能结构域直接作用 5 b , 6 2 o 另外 棉酚对非正常生理状况个体作用的研究结果表明，如有必要服用棉酚，应该了解个体的生理 状况，诸如：常饮酒否，营养状况，有无血液寄生虫及服用其它药物的情况等等，否则会对 生殖能力造成不必要的损伤，也可减弱棉酚的抗受精药效。 从上可看出，棉酚对哺乳动物雄性生殖细胞的影响方面，已从组织学，组织化学及细胞 学水平三方面进行了研究。但棉酚对于s c s 的研究目前虽有b h a g i r a t h 等( 1 9 8 5 ) 3 6 j 7 1 所作 的大鼠灌服棉酚后精母细胞中联会复合体恢复情况的初步工作，但他们未作电镜的定量分析。 对于不同剂量( 正常和高于临床剂量) 的棉酚是否引起s c 的结构改变和联会异常进而导致 同源染色体异常分离或不分离等问题尚无系统报道。本研究采用常规骨髓细胞和性细胞制各 染色体和表面铺展硝酸银染色技术制备s c 标本，利用光镜和电镜观察染色体和s c 的结构和 配对情况，分别对对照雄性小鼠( 未灌胃醋酸棉酚) 和处理雄性小鼠( 灌胃醋酸棉酚) 体细 胞和性细胞染色体以及s c 进行了分析。旨在从显微和亚显微水平为棉酚导致的不育机理提供 依据。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 实验动物 性成熟的健康雄性小鼠，体重( 2 5 0 0 5 9 ) 。购自于郑卅大学医学院。 9 2 1 2 受试药物及其剂量 醋酸棉酚购置于西安北方药业有限责任公司。用前以1 羧甲基纤维素钠配制。受试剂量 分别为3 0m g k g ，浓度为4m g m l ；6 0m g k g 。浓度为8m g m l 。 2 。 3 动物处理 将动物随机分成对照组和服棉酚组。每组8 只。对照组每天用羧甲基纤维索钠灌胃。服 棉酚组每天取上述药物按3 0m g k g d ，6 0m g k g d 灌胃。每周调整灌胃量。连续给药4 周、 1 0 周后将全部小鼠脱臼处死取样。 2 2 方法 2 2 1s c 制备及分析 2 2 1 1s c 制备 参照刘静宇等实验方法“”，具体为：取睾丸，去膜，放入2 柠檬酸钠等渗液中冲洗。 取生精小管放入小培养皿中，用眼科弯剪充分剪碎，加入0 7 柠檬酸钠低渗溶液，室温下 低渗3 0 一5 0m i n ，取上层细胞悬液i - 2 滴涂于干净的载波片上，待其自然干燥，在p h8 1 0 新 配置的4 多聚甲醛中固定l o m i n ，取出，蒸馏水冲洗，自然干燥。标本按h o w e l l 和b l a c k “” 的快速银染法进行银染，随后冲洗，干燥，渡膜。普通光学显微镜下观察找到需要的图像， 上网，漂膜，干燥。透射电子显微镜观察( h 6 0 0 一z 型，电压7 5 k v ) ，拍照，分析。 2 2 1 2s c 分析 每一动物分析5 0 个第一次减数分裂前期细胞的s c ，对s c 配对和结构异常进行分类计数。 分析指标包括：( 1 ) s c 损伤百分率，为s c 配对和结构异常的细胞在所观察细胞中所占百分数， i 个细胞内包含多个s c 损伤和结构异常时，也仅做次计数。( 2 ) s c 损伤总数，系所有受损 l0 细胞内s c 损伤事件的总和。( 3 ) s c 损伤类型，分为双侧侧向成分在同一部位同时断裂 ( b r e a k a g e ) ，单侧侧向成分( l a t e r a le l e m e n t ，l e ) 断裂，同源染色体不联会( a s y n a p s i s ) ， 异源联会( n o n h o m o l o g o u ss y n a p s i s ) ，x y 误配( x ym i s p a i r i n g ) 。x y 不联会( x ys e p a r a t i o n ) ， 多价体( m u l t i l e n t s ) ，联会紊乱( s y n a p s i si r r e g u l a r i t y ) 等。以聊检验法做统计学分析。 2 21 ，3s c 长度的测量和统计 选s c 形态完整的3 2 个粗线期细胞的电镜放大照片，用一根细铜线，沿照片上s c 的径迹 弯曲，然后拉直测量其长度。把各组数据输入电脑，计算平均值和标准差，1 9 个常染色体按 它们的长度编号作图。 2 2 2 初级精母细胞终变期一中期i 染色体标本制备及分析 参照吴鹤龄的实验方法晰1 。 ( 1 ) 取另一侧睾丸用2 柠檬酸钠溶液洗净，去自膜后，将所得的细胞悬液1 0 0 0r 加j n 离 心，弃上清，加k c l ( o 0 7 5m o l l l ) 低渗3 0m i n ，再次离心。用固定液( 甲酵乙酸v v = 3 1 ) 固定三次。滴片。空气干燥。 ( 2 ) 所得染色体用1 0 吉姆萨染色2 0m i n ，流水冲洗，空气干燥。 ( 3 ) 光镜下拍照，放大倍数以台微尺刻度为准。 2 2 3 有丝分裂中期染色体制备及分析 参照吴鹤龄的实验方法1 。 ( 1 ) 成年健康小