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猪瘟 CSF 1 病原学 猪瘟病毒 ClassicalSwineFeverVirus 属黄病毒科 瘟疫病毒属 有囊膜的RNA病毒 正股单链RNA病毒RNA全长12300个碱基 由11个基因组成 编码4种结构蛋白和7种非结构蛋白E2基因编码的外膜蛋白gp55是主要的免疫蛋白 可诱导机体产生有效的免疫保护 2 CSFV只有一个血清型 毒力变化很大强毒株可以引发急性疫病和高死亡率 中等毒力毒株一般引起亚急性或慢性传染 慢毒株可以引起猪胎儿和新出生的仔猪死亡CSFV的毒力特性不稳定 经过猪一代或多代传代后观察到毒力增强 3 培养猪瘟病毒最常用的是猪肾细胞 病毒在胞浆中复制 不引起细胞病变病毒可能在细胞胞浆内成熟 这与在感染细胞的表面检测不到病毒抗原相一致 4 病毒灭活取决于含有病毒的基质 60 10分钟 细胞培养液失去感染性 血液中病毒68 30分钟 不能使其灭活该病毒在pH5 10条件下相当稳定 高于或低于该pH时 病毒的感染性很快被破坏脂溶剂如乙醚 氯仿很快灭活病毒 病毒对于2 氢氧化钠 氯制剂和复合醛等药物敏感 5 流行病学 猪是CSFV惟一的自然宿主和重要的传染源 患病猪和可疑猪的直接接触是主要的传播方式CSFV可通过口 鼻 泪腺分泌物 尿液和粪便排泄出来怀孕母猪接触慢性CSFV毒株时 病毒可以传播给子宫中的胎儿 6 这种先天性感染造成死胎和弱胎出生 弱胎在出生后很快死亡如果先天感染的仔猪健康出生 并存活数月 这些猪无疑是病毒的扩散源新购进的表面健康的感染猪进入一个猪群 是最常见的CSFV暴发的原因 7 临床症状 病猪最初出现困倦 尾巴下垂 食欲下降 后期病猪明显厌食 感染CSFV6天内 体温可高达42 以上 病猪挤堆明显病程早期 眼睛出现明显的分泌物 伴有结膜炎 可能一直发展到两眼睑完全粘合 8 发热初期便秘 接着转变为水样的黄绿色下痢 常见病猪呕吐出带有很多胆汁的黄色液体病猪出现后肢麻痹 病程的最后阶段 腹部 耳 鼻和四肢内侧可呈现紫色公猪包皮发炎 有尿潴留 9 患急性CSF猪 大多数在10 20天内死亡患亚急性CSF猪 大多在30天内死亡患慢性CSF猪 生长严重受阻 形成矮小猪 皮肤出现病变 常见弓背站立 可存活100天以上 10 先天性CSFV感染可造成流产 木乃伊胎儿 畸形胎儿 死胎和有震颤症状的弱仔猪出生 或者产出外观正常的被感染的仔猪在子宫中感染的仔猪 皮肤常见出血 死亡率高先天性感染CSFV猪 在相当长时期内呈无病状态 数月后才表现出轻度的厌食 沉郁 结膜炎 下痢 局部运动失调 体温正常 患猪可存活6个月以上 最终导致死亡 11 耳 颈 胸腹部及后肢皮肤呈暗紫色 12 肢端皮肤斑点状出血 公猪包皮皮肤出血 13 患猪后肢皮肤出血斑点 14 患猪腹部皮肤出血斑点 15 患猪全身皮肤出血斑点 16 后期病猪腹泻 腹部等处皮肤发绀 17 猪群体表污脏 精神沉郁 共济失调 后肢麻痹 18 齿龈和唇粘膜溃疡 19 患猪眼发红 分泌物增多 20 发病机理 自然发病的条件下 CSFV侵入机体的途径为口 鼻 偶尔通过结膜 生殖道粘膜或皮肤擦伤侵入猪体经口腔感染后 扁桃体是病毒复制的最初部位病毒最初感染扁桃体腺窝的上皮细胞 随后通过淋巴管扩散到周围的淋巴网状组织病毒在局部淋巴组织复制后达到外周血液 出现病毒血症 强毒株一般5 6天扩散到猪的全身 21 急性CSF中出现的多发性出血 是由于血管内皮细胞变性 严重的血小板减少以及纤维蛋白质合成障碍急性CSF引起猪只死亡的最主要的原因可能是严重的循环障碍慢性CSF 病毒扩散的慢 在血清和器官中的滴度低 22 临床改善期 病毒在血清中的滴度低或缺乏 常常局限于扁桃体 唾液腺 空肠和肾上皮细胞内在血液循环中同时存在病毒抗原和抗体 导致抗原 抗体复合物在肾脏沉积 引起肾小球肾炎 23 病理变化 急性到亚急性病例中 病理变化为败血性疫病特征 表现为多发性出血另外还有消化道 呼吸道和泌尿生殖道的卡他性 纤维素性和出血性炎症反应 24 淋巴结和肾脏最常观察到病变 淋巴结肿胀和出血 呈现大理石样外观 淋巴细胞排空和网状细胞增生 颌下 腹股沟和肠系膜淋巴结 肾脏肿大 点状到斑状出血 常发生在皮质表面 呈雀斑肾 髓质水肿卡他性到纤维素性支气管肺炎和胸膜炎口腔粘膜 心脏 肺脏 胃 肠 膀胱有出血点或出血斑 甚至形成溃疡 25 脾脏梗死被认为是CSF最具诊断性的病变 梗死是由血管栓子栓塞阻塞血流所致 血管栓子是由变性的血管内皮细胞与红细胞形成 血泥 状物梗死呈黑色 脾脏边缘形成梗死灶脑炎病变 血管周围套形成 内皮细胞增生 小胶质细胞增生结节和局灶坏死胆囊 扁桃体出血 坏死 喉头 会厌软骨出血 坏死 26 持续性CSF最主要的病变为胸腺萎缩和外周淋巴器官中淋巴细胞排空以及滤泡明显持续性CSFV感染造成肾上腺皮质增生 其特征为带状区增宽 球状区和网状区萎缩常见回肠和结肠坏死 形成溃疡 成纽扣状 27 淋巴结出血 28 患猪颌下淋巴结肿大 出血 29 患猪腹股沟淋巴结肿大 出血 30 患猪肠系膜淋巴结肿大 出血 31 患猪肾脏肿大 点状出血 32 患猪肾脏皮质出血 髓质水肿 33 左 肾脏小点出血右 肾皮质区域小点出血 肾盂粘膜出血斑块 34 患猪扁桃体出血 35 患猪喉头点状出血 36 患猪喉头坏死 37 患猪肺脏点状出血 38 患猪胃粘膜斑点状出血 39 左 肺散在出血斑点右 胃粘膜有出血斑点 40 混合型猪瘟 肺大理石样变化 41 左 心外膜出血右 心内膜出血 42 患猪肠浆膜点状出血 胶样渗出 43 结肠粘膜上的单个 纽扣状肿 44 盲 结肠粘膜上单个及融合溃疡 45 肠道粘膜出血 46 盲结肠扣状肿 47 患猪膀胱粘膜点状出血 48 患猪脑水肿 脑脊液增多 49 脾出血性梗死 脾脏边缘呈紫黑色 边界清楚的隆起斑块 50 诊断 尸体剖检中 诊断性的病理变化为淋巴结 肾脏和其它器官的出血以及脾脏梗死实验室诊断方法包括 血清学诊断 分子生物学诊断 51 一 血清学诊断方法 琼脂扩散试验 AGP 荧光抗体试验 FAT 间接血凝试验 IHA 正向和反向中和试验 兔体 荧光病毒抗体 过氧化物酶联中和试验酶联免疫吸附试验 ELISA 免疫胶体金技术 IGSS 52 琼脂扩散试验 可用病猪脾 淋巴结作为抗原进行检测 琼扩试验操作简单 不需特殊仪器 费用低但特异性和敏感性差 现在猪瘟的诊断一般不采用此方法 53 2 荧光抗体试验 荧光抗体检测猪瘟是一种灵敏而又特异的方法可用FAT直接检测扁桃体 脾脏 肾脏和回肠远端冰冻切片中的抗原也可将病猪扁桃体和脾混合匀浆后接种无猪瘟病毒污染的猪源细胞 如PK 15 24h 72h后进行飞片FAT试验 检查细胞中是否存在CSFV 这种方法比冰冻组织切片法更为敏感 54 3 间接血凝试验 正向间接血凝试验 利用CSFV致敏红细胞 将待检血清梯度稀释后进行抗原抗体反应 根据红细胞的凝集判断结果 此法能够测出猪瘟抗体效价 操作简单 可用于免疫抗体的监测 但此方法的缺点是不能区分抗体水平是由于疫苗免疫还是野毒感染所引起反向间接血凝试验 用猪瘟免疫血清提取IgG 致敏绵羊红细胞 用之检测CSFV 此法能够检测组织病料如脾脏 淋巴结 扁桃体中的CSFV抗原 但由于对组织病料处理方法有差异 而且组织中的血细胞易造成干扰 非特异性凝集使得结果判定困难 因而现在己很少应用 55 4 中和试验 兔体中和试验将猪瘟病毒与待检血清中和后接种兔体 观察体温变化曲线当待检血清稀释度大于1 32时 则表明待检血清能够保护猪群免受CSFV感染当待检血清稀释度小于1 32时 应当对猪群进行免疫接种 56 荧光抗体病毒中和试验 此法是国际贸易指定方法飞片培养PK 15细胞 将待检血清56 30min灭活后做适当稀释 与等体积的200TCID50 0 1ml的病毒液混合感作2h 最后接入飞片上吸附1h 然后加入维持液孵育2d以上采用直接免疫荧光方法进行荧光观察 并设立对照组 可发现对照组有翠绿色光斑 而试验组光斑消失其优点是特异性强 操作简便 不足之处是仅能定性 不能定量 57 过氧化物酶联中和试验 此法也是国际贸易指定方法NPLA是将待检血清稀释后与200TCID50 50ul的病毒液混合培养一定时间后接入细胞 待细胞长成单层后固定 加入高免猪抗CSFV血清 最后加入辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG IgG HRPO 作用后加入底物显色 根据颜色就可以判定结果NPLA的优点在于无需飞片 对结果可通过肉眼进行判定 58 5 酶联免疫吸附试验 ELISA免疫检测技术应用很广 发展很快 是检测抗体的主要免疫学方法 也是监测猪群抗体水平的主要技术手段 常用于规模化养猪场的监测根据ELISA的基木原理 发展出了间接ELISA Dot ELISA 微波快速ELISA 竞争ELISA以及抗原捕获ELISA其中竞争ELISA的敏感性和特异性都较高 59 6 免疫胶体金技术 这一技术以其灵敏度高 简便易行 试剂价廉无毒 样品可较长期保存等优点得到了广泛的应用该方法最大的特点是简单快速 特异灵敏 不需要辅助仪器和辅助试剂 几分钟内就可用肉眼观察到试验结果 并可长期保存试验结果 60 二 分子生物学诊断方法 RT PCR技术核酸探针技术 61 七 疫苗研究进展 近年来国内外应用单克隆抗体对C株检测时发现有不同的反应模式 猪瘟兔化弱毒疫苗免疫失败也有报道 提示随着传代次数的增加和对不同细胞的适应性繁殖 疫苗毒株可能发生异质性或抗原漂移加之数十年来猪瘟病毒在大规模免疫接种压力下出现抗原变异 现有的传统疫苗己不能完全适应新形势的需要研究和开发新型猪瘟疫苗已成大势所趋 而分了生物学技术的发展 为新型猪瘟疫苗的研究和开发奠定了基础 62 1 传统疫苗 经兔传代 C株 或细胞传代 日本GPE株和法国THIVERVAL株 弱毒化疫苗用于控制CSF与强毒株相比 C株在3 端非转录区插入13个核苷酸C株是应用最广泛的疫苗 C株病毒生长仅限于淋巴组织 特别是扁桃体C株病毒抗原可以通过胎盘 但不引起感染胎儿任何发育异常 对怀孕母猪和新生仔猪无害 63 C株病毒可以传给与之相接触但没有免疫的猪 该毒株在猪体内连续传代20 30次后 仍然保持其弱毒特性免疫接种1周后产生免疫力 免疫接种不仅能抵抗疫病 并且在感染强毒时能够抑制CSFV的复制和向接触猪的横向传播母源抗体对免疫接种后的主动免疫反应有抑制作用 通过适当增加疫苗病毒量可以降低母源抗体对免疫的抑制作用 64 猪瘟兔化弱毒疫苗分为乳兔苗 脾淋苗和犊牛睾丸细胞苗猪瘟兔化弱毒疫苗具有免疫原性优良 免疫谱广 安全高效 遗传稳定性良好等优点由于弱毒疫苗干扰猪瘟血清学诊断 使人们难以区别猪瘟感染猪和免疫猪弱毒活苗还有可能与野毒重组或进行自然突变而造成毒力返强 并可通过母猪胎盘感染造成胎猪死亡 弱仔 先天性感染仔猪 导致出现免疫耐受现象 65 2 新型疫苗 猪瘟病毒基因缺失型弱毒疫苗猪瘟病毒亚单位疫苗猪瘟病毒活载体疫苗猪瘟病毒核酸疫苗猪瘟病毒全长感染性cDNA标记疫苗 66 猪瘟病毒基因缺失型弱毒疫苗 当某些与病毒复制无关的毒力基因缺失突变后 病毒毒力丧失或明显减弱 但病毒复制能力并不丧失 同时还保持着良好的免疫原性因此 通过基因工程技术使病毒基因组中的毒力基因缺失 可以获得基因缺失型弱毒疫苗株 67 猪瘟病毒亚单位疫苗 对猪瘟病毒编码蛋白的功能研究表明 囊膜糖蛋白E2是其主要的保护性抗原蛋白E2蛋白单独免疫即可保证猪不发生猪瘟 而且E2蛋白上的中和表位在猪瘟病毒毒株中是保守的在E2蛋白基础上开发的亚单位疫苗可以对抗CSFV野毒株感染 68 猪瘟病毒活载体疫苗 用于表达外源性病毒蛋白的载体包括伪狂犬病毒 痘病毒 腺病毒 疱疹病毒和小RNA病毒等以无致病力或低毒力的活病毒为载体 将猪瘟病毒E2基因与之重组研制出的基因重组疫苗 免疫动物后可对2种病毒产生良好的保护力但目前对此类疫苗的安全性和实用价值还有争议 69 猪瘟病毒核酸疫苗 核酸疫苗是指注入动物体内后能够诱导机体产生免疫反应的重组表达质粒 以配有原核复制组件和真核表达调控组件的质粒为载体 将免疫原基因插入该质粒中 用裸核酸接种动物即可产生免疫保护 70 猪瘟病毒全长感染性cDNA标记疫苗 全长cDNA标记疫苗是在分子水平上 将具有选择性标记的基因 替换或克隆到致弱病毒全长cDNA中 获得了重组病毒以重组病毒接种动物可以区分抗体来自于自然感染还是标记疫苗免疫 从而鉴别出感染猪群和免疫猪群标记疫苗的开发有可能成为猪瘟疫苗发展的一个主要方向 71 八 猪瘟免疫失败的原因 疫苗质量问题 质量差的疫苗免疫猪后 抗体水平不能达到防止亚临床感染的水平 可引起亚临床感染此猪不表现明显的临床症状 但终身带毒或散毒 成为猪瘟病毒主要贮存宿主 72 母源抗体的干扰 母源抗体对初生仔猪有保护作用 但也会影仔猪的免疫效果 即母源抗体的双重性因此 在给仔猪注射高质量猪瘟疫苗时 能否起到良好的免疫效果与母源抗体滴度有关当母源抗体滴度高时 免疫接种疫苗 病毒会被抗体中和而起不到保护作用 73 所以在实施免疫接种前要考虑母源抗体的滴度 同时又要注意母源抗体的整齐度具体做法是 免疫接种前检测母源抗体滴度 调整母源抗体整齐度 保证空怀母猪猪瘟抗体水平不低于1 64 分娩母猪猪抗体水平不低于1 32对反复接种抗体水平仍然很低的母猪及带毒母猪应彻底淘汰 74 疫苗运输和保存不当 疫苗在运输 保管过程中 温度控制不当 会使疫苗效价降低 猪瘟疫苗应在8 以下冷藏运输冻干苗稀释后 如气温在15 以下 6h内用完 如气温在15 27 时 则应在3h内用完严禁反复冻融疫苗 以免造成疫苗效价降低或影响真空度 75 免疫程序问题 免疫程序的关键是排除母源抗体干扰 确定合适的首免日龄仔猪首免日龄最好选择在仔猪持有的母源抗体不会影响疫苗的免疫效果 而又能达到预防病毒的感染的期间进行猪瘟免疫要常进行免疫抗体检测 才能制定最佳的免疫程序和方案 同时免疫程序要根据各自的具体情况而定一般是要求母猪在配种前注射猪瘟疫苗8头份 仔猪可于生后25日龄左右和60日龄左右各注射1次 可保护仔猪较安全出栏 76 免疫抑制疾病的影响 传染病是引起畜禽免疫抑制的主要原因 如猪伪狂犬病 猪繁殖与呼吸综合症 圆环病毒等在猪身体中存在 会使猪免疫力下降有此病毒侵袭猪的淋巴器官和免疫细胞 诱发某些细胞因子的释放 激活抑制性细胞 从而影响猪瘟的免疫效果当发生其它传染病时 不能进行猪瘟免疫 77 药物的影响 一般情况下 使用病毒疫苗前后一段时间 不应使用某些抗菌药物 如链霉素 新霉素 四环素及磺胺类药物这些药物对猪体内抗体形成有抑制作用 从而影响免疫的效果 78 饲养管理和饲料质量的影响 饲养生猪密度大 栏舍不卫生 通风不良 空气中有害气体浓度过高 使猪群长期处于应激状态 免疫应答力下降 造成免疫失败饲料营养物质缺乏或不足 会影响免疫抗体的生成速度或生成数量 从而导致免疫滞后长期或大量饲喂霉变饲料 发霉变质饲料会产生大量黄曲霉毒素等有毒物质 这此有毒物质在体内蓄积 达到一定浓度 不仅会引起中毒 而且会抑制猪的免疫应答能力 造成免疫失败 79 注射疫苗时操作不规范 接种疫苗时一个针头用到底 健康猪 病猪一起注射 这样造成猪的相互感染接种时 要一头猪一个针头 同时不能打 飞针 要准确打在肌肉内 并做好接种器械的消毒工作有的疫苗没有按说明书