毕业设计（论文）--光照对番红花侧芽愈伤组织的影响.doc

南 阳 理 工 学 院本科生毕业设计（论文） 学院（系）：张仲景国医国药学院 专 业： 中药学 学 生： 指导教师： 完成日期 2017年 4 月 南阳理工学院本科生毕业设计（论文）光照对番红花侧芽愈伤组织的影响 Effect of light on the sprout of Crocus sativus callus 总计： 毕业设计（论文）12 页表 格： 5 个插 图： 0 幅 南 阳 理 工 学 院 本 科 毕 业 设 计（论文） 光照对番红花侧芽愈伤组织的影响 Effect of light on the sprout of Crocus sativus callus 学 院（系）： 张仲景国医国药学院 专 业： 中药学 学 生 姓 名： 学 号： 指 导 教 师（职称）： （讲师） 评 阅 教 师： 完 成 日 期： 南阳理工学院 Nanyang Institute of Technology光照对番红花侧芽愈伤组织的影响光照对番红花侧芽愈伤组织的影响中药学专业 摘 要目的：比较光照和黑暗对番红花侧芽愈伤组织的影响，为扩大资源种植提供资料。方法：实验采用对照法，通过不同的光暗条件下诱导番红花侧芽愈伤组织，观察光暗条件对番红花诱导愈伤组织的影响。结果：光暗之间有显著的差异。番红花的侧芽愈伤组织在光照和暗中前提下均能成功诱导。但在暗中前提下番红花侧芽愈伤组织诱导率高。结论：番红花侧芽愈伤组织诱导在光暗条件下的诱导成功率不同，番红花侧芽愈伤组织在黑暗条件下的诱导率高于光照条件下的。 关键词 番红花；组织培养；愈伤组织；侧芽.Effect of light on the sprout of Crocus sativus callusChinese Pharmacy Major Fu-quan CHENAbstract: Objective: Comparison of light and dark on the sprout of Crocus sativus callus influence，To provide information for the expansion of resource cultivation.Method: The control method, induction of saffron bud callus under different light dark conditions, to observe the effect of intensity of light and dark conditions on callus induction of saffron. Result: Saffron bud callus were successfully induced in light and dark conditions. The dark conditions sprout of Crocus sativus callus induction rate is high. There is a significant difference between the light and dark. Conclusion: The successful induction of saffron bud callus induction in the dark under different rates of saffron bud callus under dark condition was higher than that induced by light conditionsKey words: Crocus sativus;Tissue culture;Callus;Lateral bud.目 录1 引言11.1概述11.2 番红花的形态特征11.3 西红花的栽培技术11.4 番红花主要的化学成分21.5 西红花的药理作用21.5.1 对肿瘤的抑制作用21.5.2 对炎症和镇痛的作用21.5.3 对肝脏的作用21.6 组织培养概述32 研究目的及意义33 实验材料和方法33.1 实验材料33.2方法43.2.1 配方43.2.2 配制53.2.3 灭菌53.3接种53.3.1 番红花外植体的选择和前处理53.3.2 接种前准备53.3.3 接种63.4 统计学分析63.4.1 不同激素及浓度下侧芽的萌动数63.4.2 不同激素和浓度下侧芽的诱导率73.4.3 不同激素和浓度下侧芽愈伤组织的质地73.4.4 不同激素和浓度下侧芽愈伤组织的颜色73.4.5 不同激素和浓度下侧芽愈伤组织的生长量84 结果与分析85 讨论与结论85.1 暗培养对侧芽愈伤组织的影响：95.2 活性炭对愈伤组织的影响：95.3 暗培养对球茎愈伤组织的影响：95.4 番红花其他部位的愈伤组织的培养：9参考文献10致谢111 引言1.1概述番红花（学名：Crocus sativus L.）鸢尾科番红花属的多年生草本，以花柱入药，又称西红花、藏红花，是一种常见的香料。来自西班牙等国家，经由西藏传入我国，现我国各地均有栽培。地下球茎半径约2厘米，呈扁球状，外有如大蒜般的鳞片包被。本草纲目上李时珍说过番红花来自于欧洲国家1。番红花早在元朝时就已做药用，番红花入药部位为花柱，即西红花。中医著作里记载着其有活血化瘀、镇痛、健胃的功效2。经研究西红花中具有的西红花苷、西红花总苷、番红花酸等成分在抗炎镇痛、加强免疫、抑制肿瘤以至对某些癌症抑制的方面都有很好的作用3。不仅如此番红花还可作为食品添加剂和染料等。由此可见番红花在药用以及其他方面的的价值十分巨大，但由于自然前提下的番红花繁殖困难和栽培时易出现退化现象。以及其严苛的开花条件使得西红花的产出量一直很低。由于组织培养是在室内培养不受气候、地域、虫害等的影响，因而组织培养成为解决番红花来源的主要途径。1.2 番红花的形态特征 番红花为多年生草本植物，根茎半径大约2cm，呈扁球状，球茎外包有褐黄色似大蒜外鳞片包裹。叶从基部长出，呈长条形，深绿色，有4-10片，宽1-3mm；花顶生，花茎很短，不伸出地面；开花后花裂为6瓣，花瓣呈倒卵形；每株番红花开1-2朵花，花长4-6cm，花呈淡紫色；雄蕊粗短，布满淡黄色花药，长1.5-2cm；柱头呈扇形，边沿如齿轮般，边沿回卷，呈线形；花柱橙黄色，向上逐渐变红。花期10月下旬。（观赏的番红花结果）果实为蒴果，呈椭圆形1。1.3 西红花的栽培技术 黄河以南进行番红花的栽培时，应在8月底至9月初，此时番红花是先发根后发芽，后期植株长得壮。番红花对环境的要求苛刻，番红花需要在凉爽，湿润、阳光充足的条件下种植。早期的适宜温度为24-29。花期以15-18为宜。番红花种植时为保持球茎的质量达到年年丰收的地步，要及时的清除主芽周围的侧芽。这样可使营养集中，使球茎变大。种植之前除了要除去侧芽以外，在种下之后要是又长出了侧芽同样除去。为使侧芽不再生，需要将基部除去。番红花花柱的采收必须是人工完成的。应在开花当日上午采收。采收时剥开花瓣，取出柱头，摊于纸上晒干或阴干（也可在烘箱40温度下烘34小时）。对于病虫害的的防治主要是防治球茎腐败病和菜青虫，前者用石灰水浸种，后者用对环境和对人体无害的农药杀灭防治。19，201.4 番红花主要的化学成分 由于番红花的入药部位是花柱，这些年来有很多人在尝试分析提取番红花的其他部位的化学成分进行研究，现如今已分离得到的化学成分达到100多种。高文远等对现今番红花的研究概况进行总结得出番红花的花被中含有：山奈酚、槲皮素等黄酮类。宋纯清等人在番红花的花被中提取得到山奈素I、紫云英苷II等众多烷基化合物及黄酮类化合物16，17。国外研究人员在番红花柱头中发现的挥发油共有60多种21。何美莲、陈家宽等人指出目前为止在番红花的侧芽里分离出的大黄素，2-羟基大黄素等蒽醌类化合物。藏红花还含有挥发油前体、类黄酮、树脂及大量氨基酸等。1.5 西红花的药理作用 由于番红花的入药部位为其花柱（番红花入药部位又叫西红花），许多对对番红花的花柱进行了研究。研究出西红花具有活血化瘀、抗炎镇痛、调和气血、安神开窍等功效。还能抑制肿瘤、治疗脑血栓、镇痛等作用。现代医学研究表明，番红花提取物能预防动脉粥样硬化和治疗心脑血管疾病，还有抗菌、抗焦虑、抗应激等作用。1.5.1 对肿瘤的抑制作用 翼慧莹，吴绮思等人经过实验发现西红花中具有能使人体膀胱中的肿瘤细胞生长受阻的成分。它的作用机理也许是通过阻碍肿瘤细胞的DNA、RNA的合成从而达到对肿瘤细胞的抑制作用12。临床药理表明西红花苷对多种肿瘤细胞有治疗效果其有效成分对肿瘤细胞具有选择性，而且西红花苷类能减少肿瘤数和抑制肿瘤初阶段，增加正常细胞的生长，影响细胞酶的分裂所以西红花对肝癌、子宫癌等癌症具有一定的治疗效果15。1.5.2 对炎症和镇痛的作用 在研究番红花对小鼠抗炎的影响实验中番红花能够明显的抑制由二甲苯引起的小鼠耳廓发炎以及减轻致炎物质醋酸诱发的疼痛反应有显著作用，醋酸导致的小白鼠腹腔毛细血管通透性增加，这表明西红花苷对炎症早期的毛细血管通透性增加和水肿及炎症引起的疼痛有抑制作用，具有一定的镇痛效果13。1.5.3 对肝脏的作用 实验表明西红花通过影响人体的微循环降低总胆红素和异常增高的球蛋白，增强胆汁的分泌和排泄；可提高相关酶的活性和氨基酸浓度，从而预防有毒物质对机体的损害作用，作为一种植物药，藏红花的副作用小，疗效可靠是不可多得的好药材14。1.6 组织培养概述组织培养又叫植物离体培养，是通过发挥植物细具有全能性的特点，通过人工培养使植物各部分组织离体发育形成完整植株的技术。这种技术不受季节等因素的影响，并且其能够在有限的空间里培养出大量的种苗使繁殖时间大大缩短，因此可以通过通过这种技术短时间内快速扩大植物的数量、培育无毒种苗等。现今成功通过组织培养扩大种植的植物有：石斛，地黄等。2 研究目的及意义 由于西红花(西红花是番红花的药材名)是我国十分珍贵的药材，具有凉血解毒、解郁安神、活血化瘀的功效。其主要化学成分有西红花苷、西红花苦苷、西红花酸等。朱昱等人实验发现番红花侧芽通过醇提取出的物质具有抗炎的活性5。现代研究表明西红花酸能抑制大鼠心肌肥厚以及能够促进兔的胆汁增加6。另外西红花还具有抗癌作用以及抗肿瘤的作用等，由此可见西红花是药理作用广泛、低毒性的不可多得的药材4。番红花在自然条件下不能进行有性生殖只能以球茎进行无性繁殖。近年来很多人尝试扩大番红花的资源种植，但其苛刻的生长条件和病虫害导致西红花产量一直提不上去。由于栽培番红花的人通常采用的栽培方式是去除侧芽保留主芽的方式进行栽种，造成资源的浪费。而且普通栽培番红花的方法受到天气等因素的限制，造成西红花资源品质的降低。故本实验以节约资源的为宗旨。使用番红花的侧芽进行组织培养的实验。本课题主要对番红花的组织培养进行研究，为番红花的种殖提供相关的资料；对光照对番红花侧芽诱导愈伤组织的研究，观察番红花在不同浓度光暗条件下的生长情况，可以为扩大番红花资源种植提供基础资料，提高西红花质量和产量有重要意义。3 实验材料和方法3.1 实验材料 实验仪器：烧杯；量筒；玻璃棒；酒精灯；移液管；培养瓶；接种镊子；解剖刀；电炉；胶头滴管；立式高压蒸汽灭菌器；电子天平；紫外灯；喷壶；卫生棉；打火机；石蜡膜；超净工作台；培养瓶；剪刀；试管刷；试剂瓶；引流器；PH试纸； 实验药剂：蒸馏水；琼脂粉；蔗糖；MS母液（大量元素I、大量元素II、大量元素III、微量元素、有机元素、铁盐元素）；活性炭；95%酒精；70%酒精；盐酸；氢氧化钠；0.05%升汞；生长素；3.2方法3.2.1 配方表1 MS培养基的配制母液名称化合物名称原配方量/mg扩大倍数称取量/mg母液体积/ml配1L培养基称取量/ml大量元素母液INH4NO316505082500100020KNO319005095000KH2PO4170508500大IICaCl22H2O4405022000100020大IIIMgSO47H2O3705018500100020微量元素母液MnSO4H2O22.3100111550010ZnSO47H2O8.6100430CoCl26H2O0.0251001.25CuSO45H2O0.02510012.5H3BO36.2100310Na2MO42H2OP0.2510012.5KI0.8310041.5铁盐母液FeSO47H2O28.7100143550010Na2-EDTA37.31001865有机物母液烟酸(Vpp）0.55025100020盐酸吡哆醇（VB6)0.55025盐酸硫胺素(VB1)0.1505肌醇100505000甘氨酸250100愈伤组织诱导培养基为：MS+NAA 5mg/L + 6-BA 5mg/L-P以上所有培养基均添加琼脂0.7%，蔗糖添加2%，pH 5.8，培养温度20+2，光照条件和黑暗条件分别培养。黑暗培养：5个浓度*8瓶*5个外植体光照培养：5个浓度*8瓶*5个外植体3.2.2 配制1) 取一干净的1000ml大烧杯，往烧杯内依次加入大量元素母液I、大量元素母液II、大量元素母液III、微量元素母液、铁盐母液、有机母液。2) 在上述装有试剂的大烧杯中，加入700ml蒸馏水，加热；3) 用天平称取琼脂、蔗糖和活性炭放在一边备用；4) 不断加热到沸腾，加入7g的琼脂，搅拌，然后加热至水透明，之后加入20g蔗糖，其间不断搅拌，加水到1000毫升，最后再加入生长素，搅拌使加入的所有成分充分混匀；调配PH至5.8-6。5) 最终把培养基分别装在培养瓶里面。3.2.3 灭菌将装好培养基的培养瓶放凉后装入封闭的蒸锅内开始进行灭菌，另再把实验需要的镊子、解剖刀、无菌水及无菌纸一起放入其中进行消毒。蒸锅内的高压及121的高温能有效的杀灭实验用具上的细菌及芽孢。1. 在将培养瓶放入蒸锅之前必须检查蒸锅的水位、排气阀是否关闭，如果水位是低水位必须加水。2. 将实验所需的要用到的工具及水与加入了培养基的培养瓶一起放入蒸锅中，盖上盖并旋紧。设置加热温度及时间进行加热灭菌。3. 当温度显示为104以上时打开排气阀，将里面的气体排出，使锅内温度降低，当温度降到100以下时关闭排气阀继续加热直至灭菌结束。4. 灭菌结束待锅内温度降到100以下时再，打开排气阀排空蒸汽，取出培养瓶，放入超净工作台上自然冷却，应注意取出培养瓶时不要倾斜和摇晃。(加热结束后瓶中的培养基处于液态的状态，轻微的震摇可能会导致培养基溅到瓶壁上。)3.3接种3.3.1 番红花外植体的选择和前处理试验植株是由南阳理工学院提供的无病虫害的番红花，将番红花上生长出来的幼嫩侧芽剪下，用纱布包着放在水龙头下冲洗过夜。3.3.2 接种前准备接种时有一个敞口的过程，为了减少污染的概率，所以接种前要严格进行消毒。接种前准备：1) 在接种前，先打开超净工作台的紫外线灯和风机30min进行消毒；2) 进行对培养瓶、无菌水、纸、镊子、剪刀等接种所用物品的灭菌（注：所需物品均在培养基灭菌时已附带）；3) 准备好消毒用的酒精棉，仔细检查超净台上各种用具，提早补充酒精灯的酒精，确认实验工具的齐全；4) 放入待消毒接种材料和刚消完毒的待接入培养基，以“便捷取用为宜”而陈列； 3.3.3 接种接种人员最先开始清洗双手,上了工作台之后,使用酒精棉球擦拭双手,尤其是手指缝隙不易消毒的地方;之后再把工作台面擦抹一遍;首先酒精棉球擦拭接种器材,之后把镊子和剪刀依照顺序过火一回,火烤时应多次经过火焰顶端的地方,对培养皿需要过火烤至干燥;本实验由于番红花侧芽表面紧密包裹着芽鞘，想在无菌条件下去除芽鞘难度很大，易造成污染。故本实验在点燃酒精灯10cm类进行操作。打开材料瓶和培养瓶，将需要接种的嫩芽先用70%的乙醇消毒30s，放入0.05%的升汞里8 min后，取出，去除芽鞘，再放入0.05%的升汞里3 min，取出用无菌水漂洗4次，用无菌滤纸吸干水分即侧芽的消毒结束。将已消毒的侧芽用解剖刀切成0.5cm的小段（注：在每段上斜着切几条伤口。）等待接入培养基。接种前需要灼烧7-12s培养瓶口，将准备好的材料接入培养瓶。（接种时材料和培养瓶不能离开酒精灯火焰10cm以内的范围）接种时要时常重新对接种所要用到的镊子和解剖刀进行消毒。（接种工具不能一直用到接种结束都不消毒，这样可能会导致培养基污染。）接种结束用石蜡膜进行封口标注日期和分组，根据实验需要将需要分开培养的培养基分开培养。3.4 统计学分析 出愈数：接种后长出愈伤组织的数量（接种10天后统计）愈伤组织萌动率（%）=有萌动特征的植株数/接种数100%（接种30天后统计）愈伤组织诱导率（%）=愈伤组织数/接种数100%（接种30天后统计）愈伤组织不同质地占出愈数（%）=不同质地数/出愈数100%（接种30天后统计）愈伤组织不同色泽占出愈数（%）=不同色泽数/出愈数100%3.4.1 不同激素及浓度下侧芽的萌动数侧芽接种于同一激素及浓度下，10天后开始萌动，30后统计萌动率，有的侧芽的周围明显可见淡黄色或者半透明的愈伤组织，这个时期称萌动期，各个培养基萌动数如下表：表1 光暗条件下个愈伤组织的萌动情况比较激素浓度接种数萌动数萌动率%萌动期（天）24h黑暗 P402972.51012h光照 P4018451424h光照 P401537.5193.4.2 不同激素和浓度下侧芽的诱导率番红花接种30天后，统计在不同培养基中侧芽愈伤组织的诱导率，情况如下表：表2 光暗条件下瘀伤组织的诱导率比较激素浓度接种数出愈数诱导率%24h黑暗P401742.512h光照P401537.524h光照P401127.53.4.3 不同激素和浓度下侧芽愈伤组织的质地形成的愈伤组织质地蓬松容易形成棉花状愈伤组织，从而无法继续培养，各个培养基的质地如下表： 表3 光暗条件下愈伤组织的质地比较激素浓度接种数出愈数疏松致密数量百分数%数量百分数%24h黑暗P4017211.81588.212h光照p4015746.7853.324h光照P4011872.7327.33.4.4 不同激素和浓度下侧芽愈伤组织的颜色西红花侧芽愈伤组织容易褐化（褐化会导致组织代谢紊乱，生长受阻，最终逐渐死亡）或者部分褐化，通过观察侧芽愈伤组织的颜色可以判断愈伤组织的褐化程度，情况如表：表4 黑暗条件下愈伤组织的色泽比较激素浓度接种数出愈数褐色黄色白色数量百分数%数量百分数%数量百分数%24h黑暗P4017211.7211.71376.512h光照P4015426.7853.330.224h光照P4011872.7327.3003.4.5 不同激素和浓度下侧芽愈伤组织的生长量西红花侧芽愈伤组织在不同培养基中光暗条件下的生长量不同，生长量大的说明愈伤组织更适合在这个条件下生长，表如下：表5 光暗条件下愈伤组织生长量的比较激素浓度接种数出愈数生长量大生长量小24h黑暗P401712512h光照P40156924h光照P4011474 结果与分析 光照条件对侧芽愈伤组织诱导的影响：选用MS+NAA 5mg/L + 6-BA 5mg/L培养基，考察不同光照条件对侧芽愈伤组织诱导的影响（如上表），外植体个数为40。由表1对比可知萌动数最高达29株且其为黑暗条件下P浓度里的结果，同浓度在光照条件下培养则只有15株萌动。经计算24h黑暗培养的萌动率为72.5%与12h光照以及24h光照的萌动率相比可以明显看出24h黑暗培养的萌动率明显比其他俩个高。通过观察同种培养基在不同的光暗条件下的萌动期不同，黑暗条件下的萌动期大部分比光照的萌动期短。经观察表2可以得出光暗培养下侧芽愈伤组织诱导率最高的为24h黑暗培养的P浓度诱导率达到42.5%，光培养24h侧芽愈伤组织诱导率最高达27.5%，经对比同激素浓度的培养基在光暗条件下的诱导率有着明显的不同，其中12h光培养比24h光培养诱导率高10%，而24h暗培养比24h光培养高15%。根据表3中数据可得同浓度暗培养条件下的侧芽愈伤组织质地致密的株数占出愈数的百分比为88.2%，光培养所占百分比均比暗培养的低。表4的数据中可以看到在24h的光照下培养出的愈伤组织褐色的居多为8株，随着光照时间的减少愈伤组织的颜色逐渐以白色偏多。表5可以看到在24h暗培养的情况下愈伤组织生长速度加快生长量大的占出愈数的大部分，24h光培养则生长量小的占大部分。另外经统计光培养下的侧芽培养基一共污染了10瓶，而暗培养下的侧芽培养基污染了3瓶，其中暗培养的受到污染的一共有15株，光培养受到污染的一共有43株。5 讨论与结论5.1 暗培养对侧芽愈伤组织的影响：实验通过5种不同的培养基的光照对照进行实验得出侧芽在暗培养的情况下诱导出的愈伤组织颜色、生长量、质地均比在光培养下诱导出的愈伤组织要好。进行光照条件下愈伤组织生长缓慢，且褐化严重。暗培养诱导速度较快，不易褐化。说明黑暗条件下更有利于侧芽愈伤组织的形成。因此可以看出对于愈伤组织的诱导而言，光照是非必要条件。另外根据细菌污染的株数来看，暗中培养的培养基与光照培养的培养基对比，前者的污染率更低。5.2 活性炭对愈伤组织的影响：本实验做了活性炭的对照，有活性炭加入的培养基诱导出的愈伤组织比没有活性炭的培养基里诱导出的愈伤组织颜色鲜艳，且有活性炭的培养基里诱导的愈伤组织出现褐化现象的瓶数较没加入活性炭的培养基要少。则活性炭能有效的防止愈伤组织褐化。5.3 暗培养对球茎愈伤组织的影响：实验除了做了侧芽的培养外还做了一部分球茎的光暗对照实验但实验数据较少不易进行比较，经观察暗培养下的培养基里的球茎愈伤组织普遍比光培养下的愈伤组织生长得更快更大，有的甚至已经长出了芽。从这这些明显的现象来判断在黑暗条件对球茎愈伤组织的诱导更好，暗培养更能够促进球茎愈伤组织的生长。5.4 番红花其他部位的愈伤组织的培养：实验对番红花的嫩叶、花柱、花瓣进行了培养。但是经过30d的观察培养基里的嫩叶逐渐枯萎、花柱没有任何动静、花瓣已经腐败，可以看出番红花的嫩叶、花柱、花瓣并不适合进行组织培养。参考文献1 裴鉴、丁志遵，中国植物志J.科学出版社1985,16（1）：122.2 李时珍，本草纲目（卷15）M.北京：人民卫生出版社，1982.3 刘招光，红花之药理学研究J中华医学杂志，1935，（79）：727,983,985,911.4 何美莲，陈家宽，周铜水何美莲，陈家宽，周铜水等.番红花化学成分及生物活性研究进展J.中草药,2006, 37(3):466-470.5 朱昱,韩婷, 等. 番红花不同药用部位的镇痛和抗炎活性比较研究J.药学实践杂志, 2008, 26（4）:269 -271.6 范国平.番红花酸药理作用研究进展J.世界最新医学信息文摘（电子版）,2014, 14(21):115 .7 丁向东，周锦祥，培育番红花大球茎的栽培技术研究J，江苏农业科学，2000，(6)：32-33.8 许建平，包士忠等，西红花栽培技术J，上海农学报，2003,19(2)：94-96.9 汪洋，韩婷等.番红花组织培养及快速繁殖研究J.中草药,2009,40(5):807-809.10 王兴刚，肖建梅，西红花组培快繁技术研究J，2012，(5)：93-94.11 何美莲，陈家宽，周铜水，番红花化学成分及生物活性研究进展J.中草药，2006,37（3）：466-47012 翼慧莹，吴绮思，赵培等，藏